專利名稱：人STAT3基因SiRNA慢病毒載體及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal Transducton and Activators of Transcription STATs)家族成員，更具體的說，本發(fā)明涉及人STAT3基因SiRNA慢病毒載體的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄活化因子STATs家族是一種存在于細胞胞漿并在激活后能夠轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)與DNA結(jié)合的蛋白家族，具有信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的雙重功能。已發(fā)現(xiàn)的STATs 家族成員有STATl、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6七種，分別由不同的基因編碼，廣泛參與細胞生長、增殖、分化和凋亡等多種生理功能的調(diào)控，并與炎癥、腫瘤和免疫反應關(guān)系密切。在這些STATs蛋白當中，STAT3與腫瘤的關(guān)系最為密切，相當多的證據(jù)表明STAT3 在細胞惡變的過程中起關(guān)鍵性作用。正常情況下，STAT3的激活對細胞的增殖和分化起著重要的調(diào)控作用，但STAT3的異?；罨０殡S有細胞的生長失調(diào)/增殖失控。在多種人類惡性腫瘤，如白血病、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、甲狀腺癌中都發(fā)現(xiàn)有STAT3的持續(xù)性過度激活。研究證明，STAT3是細胞內(nèi)EGFR、IL6/JAK、Src等多個致癌性酪氨酸激酶信號傳導通路匯聚中樞，STAT3過度激活可誘導上述與細胞增殖、分化及凋亡密切相關(guān)的基因的異常高表達，通過多種途徑促進細胞的惡性增殖和轉(zhuǎn)化、抑制細胞凋亡，表現(xiàn)出致癌作用。目前，許多STAT3下游的靶基因已經(jīng)確定，包括編碼抗凋亡蛋白的Bcl-xl、Mcl-I和Bcl_2基因，細胞增殖相關(guān)蛋白編碼基因Cyclin Dl和Myc，以及促血管發(fā)生因子VEGF等，此外，活化的STAT3還可啟動CdC2、CyClinBl、mras和e2f_l等靶基因的異常表達，這些效應蛋白一方面通過促進細胞周期進展、抑制細胞的分化；另一方面通過抑制細胞凋亡，延長細胞生存周期，促使細胞惡性轉(zhuǎn)化。現(xiàn)在傾向于認為STAT3是一個癌基因。由于腫瘤發(fā)生是一個多階段過程，STAT3基因的組成性激活不會單獨導致細胞惡變，STAT3持續(xù)性激活所發(fā)生的細胞變性也不是細胞的終末表型，使用STAT3蛋白的抑制劑或者反義寡聚核苷酸抑制STAT3活性或表達后，可以逆轉(zhuǎn)細胞的惡性型，達到抗腫瘤的效應。為治療腫瘤開辟新的途徑。以STAT3為作用靶點，旨在抑制STAT3活性的抗腫瘤治療研究目前已取得初步成果。RNA干擾(RNA interference SiRNA)是由雙鏈RNA介導，在mRNA轉(zhuǎn)錄后水平沉默特定基因表達的基因阻斷技術(shù)，具有四大明顯優(yōu)勢高特異性、高抑制率、放大效應和可遺傳性。SiRNA抑制基因表達的效率極高，甚至可以完全阻斷基因表達，達到體內(nèi)基因敲除的目的。目前已成為研究基因功能、細胞內(nèi)信號傳導通路的不可缺少的工具及進行基因治療的新策略。慢病毒(Lentivirus，LV)是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，具有逆轉(zhuǎn)錄病毒的基本結(jié)構(gòu)和特征，作為外源基因的載體，已廣泛用于體外細胞的轉(zhuǎn)染和基因治療研究。作為SiRNA載體應用，可以高效感染細胞進行體內(nèi)基因沉默的研究，避免質(zhì)粒的低效率轉(zhuǎn)染所帶來的種種不便，且轉(zhuǎn)染效果更加穩(wěn)定。慢病毒載體構(gòu)建的shRNA表達載體，一方面可以代替瞬時表達載體使用，另一方面，可用于感染其他載體難以轉(zhuǎn)染的細胞，如原代細胞、懸浮細胞等，并可整合到宿主細胞基因組長時間穩(wěn)定表達，產(chǎn)生穩(wěn)定的基因沉默效應，在基因治療中具有良好的應用前景。

發(fā)明內(nèi)容
STAT3與腫瘤的關(guān)系最為密切，相當多的證據(jù)表明STAT3在細胞惡變的過程中起關(guān)鍵性作用。本發(fā)明的目的是利用RNA干擾技術(shù)和慢病毒載體技術(shù)，構(gòu)建人STAT3基因的 SiRNA慢病毒載體，提供一種人STAT3基因SiRNA慢病毒載體及其構(gòu)建方法，從而提供一種在體內(nèi)敲除STAT3基因表達的有效方式，為治療腫瘤開辟了新的途徑。本發(fā)明涉及一種人STAT3基因SiRNA慢病毒載體，該載體包括一段核苷酸序列和慢病毒載體pLenti6. 3/V5-DEST，所述核苷酸序列含有針對人STAT3基因mRNA序列的干擾靶序列SiRNA，所述人STAT3基因mRNA序列的Gene bank登錄號為NM_139276 ；所述干擾靶序列SiRNA選自SEQ ID NO 1 5' -GGCGTCCAGTTCACTACTAAA-3’，或SEQ ID NO :2 :5’ AGGAGGCATTCGGAAAGTATT-3’，或SEQ ID NO :3 :5’ TCTACAGTGACAGCTTCCCAA-3’，或SEQ ID NO 4 :5，CGGCAACAGATTGCCTGCATT-3’。本發(fā)明涉及的人STAT3基因SiRNA慢病毒載體，所述人STAT3基因SiRNA慢病毒載體包括含有所述干擾靶序列SiRNA的寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列選自SEQ ID NO 6 5’ -CCTGTTTAGTAGTGATGGACGCCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGGCGTCCAGTTCACTACTAAA C-3，，或SEQ ID NO 8 5’ -CCTGAATACTTTCCGTGCCTCCTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAGGAGGCATTCGGAAAGTATT C-3，，或SEQ ID NO: 10:5’ -CCTGTTGGGAAGCTGACTGTAGAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTCTACAGTGACAGCTTCCCAA C-3，，或SEQ ID NO: 12:5’ -CCTGAATGCAGGCAATGTTGCCGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCGGCAACAGATTGCCTGCATT C-3，。本發(fā)明還涉及一種人STAT3基因SiRNA慢病毒載體的構(gòu)建方法，包括步驟1 針對選自人STAT3基因mRNA序列的干擾靶序列SiRNA，所述人STAT3基因 mRNA序列的Gene bank登錄號為NM_139276，設(shè)計并合成含有干擾靶序列SiRNA的雙鏈寡核苷酸序列，所述雙鏈寡核苷酸序列選自1# SEQ ID NO 5 5， -TGCTGTTTAGTAGTGAACTGGACGCCGTTTTGGCCACTGACTGACGGCGTCCATCACTACTAAA-3，SEQ ID NO 6 5’ -CCTGTTTAGTAGTGATGGACGCCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGGCGTCCAGTTCACTACTAAA C-3，，或 T-3'
2#
SEQ ID NO 7
5’ -TGCTGAATACTTTCCGAATGCCTCCTGTTTTGGCCACTGACTGACAGGAGGCACGGAAAGTATSEQ ID NO 8 5’ -CCTGAATACTTTCCGTGCCTCCTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAGGAGGCATTCGGAAAGTATT C-3，，或
A-3，
3#
SEQ ID NO 9
5’ -TGCTGTTGGGAAGCTGTCACTGTAGAGTTTTGGCCACTGACTGACTCTACAGTCAGCTTCCCASEQ ID NO: 10:5’ -CCTGTTGGGAAGCTGACTGTAGAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTCTACAGTGACAGCTTCCCAA C-3，，或
T-3'
4#
SEQ ID NO 11
5， -TGCTGAATGCAGGCAATCTGTTGCCGGTTTTGGCCACTGACTGACCGGCAACATTGCCTGCATSEQ ID NO: 12:5’ -CCTGAATGCAGGCAATGTTGCCGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCGGCAACAGATTGCCTGCATT C-3'其中，所述干擾靶序列SiRNA分別對應于SEQID NO 1SEQID NO 2SEQID NO 3SEQID NO 4
5， -GGCGTCCAGTTCACTACTAAA-3‘ 5， -AGGAGGCATTCGGAAAGTATT-3‘ 5， -TCTACAGTGACAGCTTCCCAA-3‘ 5’ -CGGCAACAGATTGCCTGCATT-3‘步驟2 將步驟1中設(shè)計并合成的所述雙鏈寡核苷酸序列退火后形成含有干擾靶序列SiRNA的雙鏈DNA，將所述含有干擾靶序列SiRNA的雙鏈DNA插入到表達載體 pcDNA 6. 2-Gff/EmGFPmiR中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 α后，測序，構(gòu)建得到STAT3 SiRNA干擾載體；步驟3:將所述STAT3 SiRNA干擾載體亞克隆至pD0NR221載體中，再與慢病毒表達載體pLenti6. 3/V5-DEST進行重組，構(gòu)建得到人STAT3基因SiRNA慢病毒載體pLenti6. 3/ V5-DEST/STAT3SiRNA ；步驟4 將所述慢病毒載體pLenti6. 3/V5_DEST/STAT3SiRNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 α后，篩選陽性克隆進行測序鑒定，鑒定正確的克隆即為成功構(gòu)建的人STAT3基因SiRNA慢病毒載體。本發(fā)明涉及的人STAT3基因SiRNA慢病毒載體的構(gòu)建方法，進一步包括采用不對人類任何基因產(chǎn)生干擾的SiRNA雙鏈作為陰性對照重復上述步驟1-2，所述陰性對照SiRNA 雙鏈和所選中的STAT3siRNA序列有相同的核苷酸組成，但沒有明顯的同源性，和細胞中其他基因也沒有同源性。本發(fā)明涉及的人STAT3基因SiRNA慢病毒載體的構(gòu)建方法，所述陰性對照的雙鏈寡核苷酸序列為NC SEQ ID NO: 13:5’ -TGCTGAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCACGCAGTACATT T-3'SEQ ID NO: 14:5，-CCTGAAATGTACTGCGTGGAGACGTCAGTCAGTGGCCAAAACGTCTCCACGCGCAGTACATTT C-3，。本發(fā)明涉及的人STAT3基因SiRNA慢病毒載體的構(gòu)建方法，步驟2進一步包括對所述STAT3SiRNA干擾載體進行干擾效果測定，篩選出干擾效率最高的干擾載體，用于步驟 3。本發(fā)明涉及的人STAT3基因SiRNA慢病毒載體的構(gòu)建方法，所述STAT3SiRNA干擾載體的所述干擾效果測定包括實時定量Q-PCR技術(shù)與免疫印記法技術(shù)。本發(fā)明涉及的人STAT3基因SiRNA慢病毒載體的構(gòu)建方法，步驟4進一步包括以所述成功構(gòu)建的人STAT3基因SiRNA慢病毒載體與其相應慢病毒包裝系統(tǒng)載體一起感染
細胞48小時后，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，濃縮后進行慢病毒滴度測定。為了構(gòu)建本發(fā)明的人STAT3基因SiRNA慢病毒載體，可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的 DNA 操作技術(shù)(例如參見 Sambrook et. al. , Molecular Cloning ；A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour, 1989)進行基因的分離、核苷酸片斷的切割與連接、克隆和表達載體的構(gòu)建及擴增、核苷酸序列的分析與鑒定、細胞的轉(zhuǎn)化和擴大培養(yǎng)等操作。首先是針對目的基因SiRNA靶點序列，利用公共網(wǎng)站設(shè)計并合成4對含目的基因SiRNA序列的雙鏈寡核苷酸(DNAoligo)，4對寡核苷酸退火形成雙鏈后，分別插入到SiRNA的表達載體pcDNA 6. 2-Gff/EmGFPmiR中，構(gòu)建4個STAT3SiRNA干擾載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5 α， 篩選陽性克隆并經(jīng)測序鑒定序列正確后，轉(zhuǎn)染目的細胞，分別采用實時定量Q-PCR技術(shù)和 Western-blot方法檢測目的基因mRNA及蛋白的表達情況，判斷STAT3SiRNA干擾載體對目的基因的抑制情況。再利用hvitrogen的Gateway 技術(shù)，經(jīng)過兩步重組進一步構(gòu)建 STAT3SiRNA的慢病毒表達載體。具體步驟是先將上述階段篩選出的干擾效率最高的干擾載體亞克隆至PD0NR221載體(美國hvitrogen公司)中，再與慢病毒表達載體pLenti6. 3/ V5-DEST (美國hvitrogen公司)進行重組，構(gòu)建得到重組慢病毒載體pLenti6. 3/ V5-DEST/STAT3SiRNA,上述重組慢病毒載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 α后，篩選陽性克隆進行測序鑒定，鑒定正確的克隆即為成功構(gòu)建的STAT3基因SiRNA慢病毒載體。以該重組慢病毒載體與其相應包裝系統(tǒng)載體一起感染細胞48小時后，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，濃縮后進行慢病毒滴度測定。
本發(fā)明選擇的慢病毒表達載體系統(tǒng)，可用于在細胞內(nèi)直接包裝成為慢病毒顆粒， 對分裂和非分裂細胞均有感染作用，尤其適用于難轉(zhuǎn)染細胞，如血液系統(tǒng)細胞的感染，也可用于制備多種穩(wěn)定沉默特定基因的細胞株篩選。此外，所使用的慢病毒包裝載體去除了慢病毒的關(guān)鍵蛋白，所包裝出的病毒顆粒自身活性丟失，病毒感染細胞后整合到細胞基因組中并不會產(chǎn)生具有自身包裝能力的活性病毒，對人體的安全性較高，也適用于RNAi干擾的體內(nèi)實驗研究。本發(fā)明是基于已知的人STAT3基因RNA干擾有效靶點序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計合成4 對針對STAT3基因的SiRNA寡核苷酸序列，使用特定載體和方法成功構(gòu)建了表達人STAT3 基因SiRNA慢病毒載體，經(jīng)PCR和基因測序證實，本發(fā)明所構(gòu)建的人STAT3基因shRNA慢病毒載體序列正確。進一步在靶細胞中進行基因敲減實驗證明，本發(fā)明所構(gòu)建的STAT3SiRNA 慢病毒對目的基因的表達抑制率達70%以上，具有良好的基因敲減效率。因此，本發(fā)明提供了一種如上限定的人STAT3基因SiRNA慢病毒載體的構(gòu)建方法。


為了更清楚地說明本發(fā)明的上述和其他特征，以下借助附圖和實施例對本發(fā)明進行詳細描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不背離本發(fā)明的基本精神和原則的前提下，改變或改動本說明書中描述的某些技術(shù)內(nèi)容或技術(shù)環(huán)節(jié)。但人們可以理解到，這些平行的改變或改動均將包括在本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍之內(nèi)。圖1是本發(fā)明的STAT3SiRNA干擾載體陽性重組克隆的測序鑒定圖；其中，A-D分別為1至4號含目的基因干擾靶序列陽性重組干擾載體的測序結(jié)果。圖2是本發(fā)明的STAT3SiRNA干擾效果的Western-blot檢測；其中，STAT3為目的基因STAT3的蛋白表達，GAPDH為內(nèi)參管家基因GAPDH蛋白的表達；1-4分別為1-4號干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)STAT3蛋白表達情況；NC為陰性對照質(zhì)粒； CON為無質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞。圖3是本發(fā)明的STAT3SiRNA慢病毒載體的測序鑒定結(jié)果。
具體實施例方式實施例lSTAT3SiRNA干擾載體構(gòu)建與鑒定根據(jù)STAT3mRNA全長序列(使用的人STAT3基因mRNA序列Genebank登錄號為 NM_139276)，利用 SiRNA 在線設(shè)計軟件 B LOCK-iT RNAiDesigner (https:// rnaidesigner. invitrogen. com/rnaiexpress/rnaiExpress. jsp)分另U 設(shè)計 4 對含 STAT3 基因SiRNA序列的雙鏈寡核苷酸序列(寡核苷酸序列見表1)，采用不對人類任何基因產(chǎn)生干擾的SiRNA雙鏈作為陰性對照(PSC-NC)，合成4對STAT3SiRNA寡核苷酸序列(由美國 Invitrogen公司合成)。表1含STAT3基因SiRNA序列的雙鏈寡核苷酸
權(quán)利要求
1.一種人STAT3基因SiRNA慢病毒載體，包括一段核苷酸序列和慢病毒載體 pLenti6. 3/V5-DEST，所述核苷酸序列含有針對人STAT3基因mRNA序列的干擾靶序列 SiRNA，所述人STAT3基因mRNA序列的Gene bank登錄號為NM_139276 ；其特征在于，所述干擾靶序列 SiRNA 選自SEQ ID NO :1，或 SEQ ID NO :2，或 SEQ ID NO :3，或 SEQ ID NO :4。
2.如權(quán)利要求1所述的人STAT3基因SiRNA慢病毒載體，其特征在于，所述人STAT3基因SiRNA慢病毒載體包括含有所述干擾靶序列SiRNA的寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列選自SEQ ID NO :6，或 SEQ ID NO :8，或 SEQ ID NO: 10，或 SEQ ID NO :12。
3.—種人STAT3基因SiRNA慢病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括步驟1 針對選自人STAT3基因mRNA序列的干擾靶序列SiRNA，所述人STAT3基因mRNA 序列的Gene bank登錄號為NM 139276，設(shè)計并合成含有干擾靶序列SiRNA的雙鏈寡核苷酸序列，所述雙鏈寡核苷酸序列選自 1# SEQ ID NO 5 與 SEQ ID NO :6，或 2# SEQ ID NO 7 與 SEQ ID NO :8，或 3# SEQ ID NO 9 與 SEQ ID NO :10，或 4# SEQ ID NO 11 與 SEQ ID NO :12。其中，所述干擾靶序列SiRNA分別對應于SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 ；步驟2:將步驟1中設(shè)計并合成的所述雙鏈寡核苷酸序列退火后形成含有干擾靶序列SiRNA的雙鏈DNA，將所述含有干擾靶序列SiRNA的雙鏈DNA插入到表達載體 pcDNATM6. 2-Gff/EmGFPmiR中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 α后，測序，構(gòu)建得到STAT3SiRNA干擾載體；步驟3 將所述STAT3 SiRNA干擾載體亞克隆至pD0NR221載體中，再與慢病毒表達載體pLenti6. 3/V5-DEST進行重組，構(gòu)建得到人STAT3基因SiRNA慢病毒載體pLenti6. 3/ V5-DEST/STAT3SiRNA ；步驟4 將所述慢病毒載體pLenti6. 3/V5_DEST/STAT3SiRNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 DH5a后，篩選陽性克隆進行測序鑒定，鑒定正確的克隆即為成功構(gòu)建的人STAT3基因 SiRNA慢病毒載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人STAT3基因SiRNA慢病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，進一步包括采用不對人類任何基因產(chǎn)生干擾的SiRNA雙鏈作為陰性對照重復上述步驟1-2， 所述陰性對照SiRNA雙鏈和所選中的STAT3siRNA序列有相同的核苷酸組成，但沒有明顯的同源性，和細胞中其他基因也沒有同源性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的人STAT3基因SiRNA慢病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述陰性對照的雙鏈寡核苷酸序列為NC SEQ ID NO 13 與 SEQ ID NO :14。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人STAT3基因SiRNA慢病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟2進一步包括對所述STAT3SiRNA干擾載體進行干擾效果測定，篩選出干擾效率最高的干擾載體，用于步驟3。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的人STAT3基因SiRNA慢病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述STAT3SiRNA干擾載體的所述干擾效果測定包括實時定量Q-PCR技術(shù)與免疫印記法技術(shù)。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人STAT3基因SiRNA慢病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟4進一步包括以所述成功構(gòu)建的人STAT3基因SiRNA慢病毒載體與其相應慢病毒包裝系統(tǒng)載體一起感染細胞48小時后，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，濃縮后進行慢病毒滴度測定。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人STAT3基因SiRNA慢病毒載體，包括一段核苷酸序列和慢病毒載體pLenti6.3/V5-DEST，該核苷酸序列含有針對人STAT3基因mRNA序列的干擾靶序列SiRNA，該人STAT3基因mRNA序列的Gene bank登錄號為NM_139276；該干擾靶序列SiRNA選自SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO4。該慢病毒載體在靶細胞內(nèi)時表達人STAT3基因siRNA分子的正義鏈與反義鏈，使人STAT3mRNA發(fā)生特異性降解，導致其表達沉默，提供一種體內(nèi)敲除STAT3基因表達的有效方式，為治療腫瘤開辟了新的途徑。
文檔編號C12N15/867GK102250953SQ20111020250
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月19日
發(fā)明者倪誠, 夏蕾, 文世宏, 蔣麗佳, 馬玲娣 申請人:馬玲娣