專利名稱：一種轉(zhuǎn)座載體及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是涉及一種轉(zhuǎn)座載體及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)座子，又稱轉(zhuǎn)座因子，是轉(zhuǎn)座元件中的一種，具有完整轉(zhuǎn)座元件的功能特征，并能攜帶內(nèi)外源基因組片段(單基因或多基因)，在基因組內(nèi)移動或在生命體之間傳播并可表達出新的表型。轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座會使基因組結(jié)構(gòu)和功能改變上有所改變，因而在進化中扮演重要角色。自Mc Clintock在玉米中發(fā)現(xiàn)第一個轉(zhuǎn)座子以來，隨著對轉(zhuǎn)座子研究的不斷深入和技術(shù)的日臻完善，轉(zhuǎn)座子已經(jīng)作為一種重要的基因工程工具，用于多物種的基因組功能和遺傳學(xué)分析。人類基因組計劃(Human Genome Project,HGP)揭示人類基因組中大約有45%源于轉(zhuǎn)座子，足見轉(zhuǎn)座子在人類基因組進化過程中的影響。然而，長期以來，哺乳動物中由于缺少高效的轉(zhuǎn)座子，其基因操作方面受到很大限制。目前發(fā)現(xiàn)的能夠在哺乳動物中轉(zhuǎn)座反應(yīng)的元件有hAT樣Tol2轉(zhuǎn)座子、Tcl樣轉(zhuǎn)座子和PB (PiggyBac)轉(zhuǎn)座子家族，其中Tcl樣轉(zhuǎn)座子包括SB (Sle印ing Beauty) ^P FP (Frog Prince)。這其中SB和PB是目前在哺乳動物應(yīng)用最為廣泛的兩種DNA轉(zhuǎn)座子。SB是通過與Tcl家族轉(zhuǎn)座子序列比對，并從鮭魚(salmanoid)基因組分離重建出的一種Tcl/mariner樣轉(zhuǎn)座子，它是第一個能夠在哺乳動物細胞中轉(zhuǎn)座的DNA轉(zhuǎn)座元件。 SB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)主要包括轉(zhuǎn)座酶合成基因和一能夠被轉(zhuǎn)座酶識別的具有反向重復(fù)序列的轉(zhuǎn)座元件。SB發(fā)生轉(zhuǎn)座時須2個組成部分同時存在。PB分離于甘藍蠖度尺蛾(Callage Iooper moth Trichoplusia ni)，各方面明顯不同于已發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)座子類型，屬于一新轉(zhuǎn)座子家族。 最初PB發(fā)現(xiàn)能夠在果蠅和昆蟲中轉(zhuǎn)座，通過序列比對和功能重建，發(fā)現(xiàn)PB還能夠在哺乳動物細胞以及生殖細胞轉(zhuǎn)座。PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的轉(zhuǎn)座也需要轉(zhuǎn)座子序列和轉(zhuǎn)座酶同時存在。SB和PB作為DNA轉(zhuǎn)座子，具有相似的轉(zhuǎn)座機制，但由于來源不同及本身的特性不同，二者之間也存在多方面差異。與PB相比，SB轉(zhuǎn)座酶和轉(zhuǎn)座識別序列的分離構(gòu)建二元轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，提高了轉(zhuǎn)座的安全性。同時SB具有轉(zhuǎn)座子的整合偏好性，更容易插入到供體附近位置，如Kokubu等發(fā)現(xiàn)SB轉(zhuǎn)座插入到供體臨近的8kb區(qū)域內(nèi)頻率更大；Liang等通過 SB和PB的活性比較，發(fā)現(xiàn)SB25%的重新整合位點位于次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase,Hprt)供體位置白勺4Mb 內(nèi)，而PB貝Ij 未能表現(xiàn)出這種偏好性。而與SB相比，PB具有更高的轉(zhuǎn)座活性，且轉(zhuǎn)座后供體位置處不留任何足跡，不會造成供體處遺傳物質(zhì)的改變。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明目的是提供一種融合了 SB和PB兩種DNA轉(zhuǎn)座子特性的、用于哺乳動物小鼠、大鼠、豬等基因突變的新型轉(zhuǎn)座載體及其構(gòu)建方法。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種轉(zhuǎn)座載體，包含以下元件a) PB轉(zhuǎn)座酶識別序列PBL和PBR ；b)原核生物抗性基因；c)復(fù)制起始位點序列；d) SB轉(zhuǎn)座酶識別序列SBL和SBR ；e)基因捕獲框，所述基因捕獲框包括剪接受體、報告基因與真核生物抗性基因的融合基因和SV40的多聚腺苷酸信號序列；所述與報告基因融合的抗性基因與所述轉(zhuǎn)座載體所含抗性基因不同。其中，所述PB轉(zhuǎn)座酶識別序列PBL和PBR分別位于轉(zhuǎn)座子的兩端；PB轉(zhuǎn)座酶識別序列PBL與PBR之間依次為原核生物抗性基因、復(fù)制起始位點序列、SB轉(zhuǎn)座酶識別序列 SBL、剪接受體、報告基因與真核生物抗性基因的融合基因、SV40的多聚腺苷酸信號序列和 SB轉(zhuǎn)座酶識別序列SBR。本發(fā)明所述轉(zhuǎn)座載體包含PB轉(zhuǎn)座酶識別序列PBL和PBR和SB轉(zhuǎn)座酶識別序列SBL 與SBR，融合了 PB和SB兩種DNA轉(zhuǎn)座子的特性，兼具了 PB的高轉(zhuǎn)座活性和SB近距離轉(zhuǎn)座偏好性，保證轉(zhuǎn)座載體能夠在PB轉(zhuǎn)座酶和SB轉(zhuǎn)座酶條件下轉(zhuǎn)座。其中，所述PB轉(zhuǎn)座酶識別序列PBL具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列，所述PB轉(zhuǎn)座酶識別序列PBR具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列，所述SB轉(zhuǎn)座酶識別序列SBL具有SEQ ID NO :3所示核苷酸序列，所述SB轉(zhuǎn)座酶識別序列SBR具有SEQ ID NO 4所示核苷酸序列。復(fù)制起始序列為原核生物基因質(zhì)粒的復(fù)制起始位點，是四個高度保守的19bp組成的正向重復(fù)序列，本發(fā)明所述轉(zhuǎn)座載體中包含復(fù)制起始序列，用于功能載體的原核生物內(nèi)的擴增。其中，所述復(fù)制起始序列具有SEQ IDNO :5所示核苷酸序列?？剐曰蚩少x予宿主細胞對某些物質(zhì)的抗性，直接用于選擇轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明所述原核生物抗性基因用于轉(zhuǎn)化子的篩選，可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任意一種抗性基因， 所述抗性基因可以為抗生素抗性基因、重金屬抗性基因或代謝抗性基因，其中，以抗生素抗性基因使用最廣泛。因此，本發(fā)明所述原核生物抗性基因。優(yōu)選為抗生素抗性基因?？股乜剐曰虺３Ｙx予宿主細胞對抗生素產(chǎn)生抗性，而抗生素往往對宿主細胞是致死的?？股乜剐曰虬ㄔ松镏械陌逼S青霉素抗性基因(Ampr)、四環(huán)素抗性基因(Tcr)、氯霉素抗性基因(Cmr)、卡那霉素抗性基因(Kanr)等。在具體實施方式
中，所述原核生物抗性基因為具有SEQ ID NO :6所示核苷酸序列的氨芐青霉素抗性基因。在一些實施例中，氨芐青霉素抗性基因也可為其他抗性基因如氯霉素抗性基因所代替。在一些實施例中，氨芐青霉素抗性基因也可為其他具有可篩選特點的基因片段所代替，如銅抗性基因 (Cur)，胸苷激酶基因(TK)。本發(fā)明所述轉(zhuǎn)座載體中還整合了包括剪接受體、報告基因與抗性基因的融合基因和SV40的多聚腺苷酸信號序列的基因捕獲框，可以實現(xiàn)在高效轉(zhuǎn)座，并且在轉(zhuǎn)座過程中插入基因內(nèi)部，實現(xiàn)基因的插入突變。本發(fā)明所述與報告基因融合的真核生物抗性基因可用于插入突變的篩選和插入基因啟動子驅(qū)動報告基因的表達，保證載體插入宿主基因內(nèi)部的細胞克隆在G418存在下被篩選保留，可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任意一種真核生物抗性基因，如潮霉素抗性基因(Hygr)、新霉素抗性基因(Neor)等。在具體實施方式
中，本發(fā)明所述與報告基因融合的真核生物抗性基因為新霉素抗性基因。在一些實施例中，新霉素抗性基因也可為潮霉素抗性基因所代替。報告基因(importer gene)是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，是一個其表達產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進行表達，從而利用它的表達產(chǎn)物來標定目的基因的表達，篩選得到轉(zhuǎn)化體。報告基因已被廣泛應(yīng)用于動、植物基因表達調(diào)控的研究。目前在動物基因工程研究領(lǐng)域，常用的報告基因有半乳糖苷酶基因(LacZ)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat)、二氫葉酸還原酶基因、熒光酶基因等。在具體實施方式
中，本發(fā)明所述報告基因為所述半乳糖苷酶基因，半乳糖苷酶基因與新霉素抗性基因融合得到具有SEQ ID NO :7所示核苷酸序列的β-geo基因，表達β-半乳糖苷酶基因與新霉素抗性基因的融合蛋白，同時具有兩種蛋白質(zhì)的特性，可用G418進行篩選，也可用X-gal染色鑒定陽性克隆。剪接受體(splice acc印tor，SA)，是指RNA剪接過程中，在切斷和重接位點處內(nèi)含子3'端的剪接位點序列。在具體實施方式
中，本發(fā)明所述剪接受體具有SEQ ID N0:8所示核苷酸序列。多聚腺苷酸加尾序列(polyA，pA)，通常位于mRNA上的150-200個腺苷酸殘基，又稱為特殊的尾巴結(jié)構(gòu)。在真核生物中，多聚腺苷酸化是一種機制，令mRNA分子于它們的3' 端中斷。多聚腺苷酸尾(或聚A尾)保護mRNA，免受核酸外切酶攻擊，并且對轉(zhuǎn)錄終結(jié)、將 mRNA從細胞核輸出及進行翻譯都十分重要。在基因捕獲過程中，當報告基因整合到內(nèi)源性基因內(nèi)含子，經(jīng)過mRNA前體的剪接，報告基因可以在活性啟動子作用下表達，通過協(xié)同多聚腺苷酸加尾序列，誘捕基因表達終止。在具體實施方式
中，所述SV40的多聚腺苷酸加尾序列具有SEQ ID NO 9所示核苷酸序列。本發(fā)明所述轉(zhuǎn)座載體還包括兩個Cre-IoxP組件的Ioxp位點序列和兩個Flp-Frt 組件的Frt位點序列，用于PB進行一次轉(zhuǎn)座和SB 二次轉(zhuǎn)座后，在Cre和Flp重組酶作用下， 鄰近轉(zhuǎn)座位點間大片段DNA序列的條件性敲除，以實現(xiàn)轉(zhuǎn)座后近距離DNA片段的條件性敲除研究。其中，所述第一 Ioxp位點序列和第一 Frt位點序列位于復(fù)制起始位點序列與SBL 之間，且第一 Ioxp位點序列位于第一 Frt位點序列的上游；所述第二 Ioxp位點位于SBL與基因捕獲框之間；所述第二 Frt位點序列位于基因捕獲框與SB轉(zhuǎn)座酶識別序列SBR之間， 且第二 Frt位點序列與第一 Frt位點序列反向互補。LoxP (locus of X-over Pl)位點序列來源于Pl噬菌體，是有兩個13bp反向重復(fù)序列和中間間隔的8bp序列共同組成，8bp的間隔序列同時也確定了 LoxP的方向。Cre重組酶在催化DNA鏈交換過程中與DNA共價結(jié)合，13bp的反向重復(fù)序列是Cre重組酶的結(jié)合域。Cre重組酶能介導(dǎo)兩個LoxP位點(序列)之間的特異性重組，使LoxP位點間的基因序列被刪除或重組。在具體實施方式
中，本發(fā)明所述第一 LoxP位點與第二 Ioxp位點序列方向相同，具有SEQ IDNO 10所示核苷酸序列，Cre重組酶能有效切除兩個LoxP位點間的序列，導(dǎo)致兩個Ioxp位點間的序列缺失。Frt (Flp recognition target)位點序列與IoxP位點相似，由兩個長度為13bp的反向重復(fù)序列和一個長度為8bp的核心序列構(gòu)成。與Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)相似。在具體實施方式
中，本發(fā)明所述Frt位點具有SEQ ID NO 11所示核苷酸序列，但第一 Frt位點與第二 Frt位點序列反向互補，用以實現(xiàn)二次轉(zhuǎn)座DNA序列的鄰近倒置插入時，F(xiàn)lp重組酶重組酶能夠識別兩個Frt位點間的序列，導(dǎo)致兩個Frt位點間的序列缺失。在具體實施實施方案中，本發(fā)明提供了具有SEQ ID NO :12所示所示核苷酸序列的轉(zhuǎn)座載體。本發(fā)明所述轉(zhuǎn)座載體融合了 PB和SB兩種DNA轉(zhuǎn)座子的特性，能夠在PB轉(zhuǎn)座酶和 SB轉(zhuǎn)座酶條件下轉(zhuǎn)座，同時整合了包括剪接受體、報告基因與抗性基因的融合基因和SV40 的多聚腺苷酸加尾序列的基因捕獲閱讀框，用以在轉(zhuǎn)座過程中實現(xiàn)基因的插入突變，可廣泛應(yīng)用于小鼠、大鼠、豬等哺乳動物的基因突變模型的建立及基因組內(nèi)大規(guī)?；蚬δ芎Y選。本發(fā)明所述轉(zhuǎn)座載體還包括Ioxp位點和Frt位點序列，可以實現(xiàn)轉(zhuǎn)座后近距離DNA片段的條件性敲除，應(yīng)用于小鼠、大鼠、豬等哺乳動物的大片段DNA序列的條件性缺失模型建立。目前利用基因工程技術(shù)獲得DNA片段的方法有很多種，包括利用限制性內(nèi)切酶酶切具有目的分子的載體或以具有目的分子的載體為模板PCR擴增，此外還有化學(xué)合成方法。本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)座載體的制備方法，包括步驟1、用連接酶將PB轉(zhuǎn)座酶識別序列PBL和PBR、原核生物抗性基因、復(fù)制起始位點序列、SB轉(zhuǎn)座酶識別序列SBL和SBR、兩個Ioxp位點序列、兩個Frt位點序列、剪接受體、報告基因與真核生物抗性基因的融合基因和SV40的多聚腺苷酸加尾序列連接，步驟2 轉(zhuǎn)化宿主細胞，用原核生物抗性基因?qū)?yīng)的抗生素篩選，限制性內(nèi)切酶酶切驗證陽性克??；其中，所述PBL和PBR分別位于轉(zhuǎn)座子的兩端；PBL與PBR之間依次為原核生物抗性基因、復(fù)制起始位點序列、SBL、剪接受體、報告基因與真核生物抗性基因的融合基因、 SV40的多聚腺苷酸加尾序列和SBR ；所述第一 Ioxp位點序列和第一 Frt位點序列位于復(fù)制起始位點序列與SBL之間，且第一 Ioxp位點序列位于第一 Frt位點序列的上游；所述第二 Ioxp位點位于SBL與SV40的多聚腺苷酸加尾序列之間；所述第二 Frt位點序列位于SV40 的多聚腺苷酸加尾與SBR之間，且第二 Frt位點序列與第一 Frt位點序列反向互補。在具體實施方案中，本發(fā)明所述制備方法，步驟1為用連接酶將具有SEQ ID NO 13 16所示核苷酸序列的Biol-Bglll片段、BglII-ClaI片段、Cla I-SphI片段和Sph I-Xho I片段連接，其中所述 ιοΙ-BglII片段包括PB轉(zhuǎn)座酶識別序列PBL和PBR、原核生物抗性基因、復(fù)制起始位點序列、SB轉(zhuǎn)座酶識別序列SBL和SBR、兩個Ioxp位點序列、兩個 Frt位點序列和剪接受體，所述BglII-ClaI片段包括報告基因IacZ前部分序列，所述Cla I-SphI片段包括報告基因IacZ序列，所述SphI-B10 I片段包括報告基因IacZ與新霉素抗性基因的融合基因的末端和SV40的多聚腺苷酸加尾序列。在具體實施方案中，本發(fā)明所述制備具有SEQ ID NO :13所示核苷酸序列的 XhoI-BglII片段的方法為先化學(xué)合成包括PB轉(zhuǎn)座酶識別序列PBL和PBR、原核生物抗性基因、復(fù)制起始位點序列、SB轉(zhuǎn)座酶識別序列SBL和SBR、兩個Ioxp位點序列和兩個Frt位點序列的DNA片段，測序驗證后與以HindIII/BglII限制性內(nèi)切酶雙酶切自載體EGFP β geo 的剪切受體片段連接。在一個實施方案中，本發(fā)明所述制備具有SEQ ID NO :14所示核苷酸序列的BglII-ClaI片段的方法為以pU21質(zhì)粒為模板，用具有SEQ ID NO :17所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :18所示的核苷酸序列的下游引物擴增。在一個實施方案中，本發(fā)明所述制備具有SEQ ID NO 15所示核苷酸序列的Cla I-SphI片段的方法為提取pU21質(zhì)粒，用Cla I/Sph I限制性內(nèi)切酶酶切，回收大小為 2800bp 片段。在一個實施方案中，本發(fā)明所述制備具有SEQ ID NO :16所示核苷酸序列的 SphI-Xho I片段的方法為以pU21質(zhì)粒為模板，用具有SEQ ID NO :19所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :20所示的核苷酸序列的下游引物擴增。本發(fā)明所述制備方法步驟2所述宿主細胞可以為本領(lǐng)域人員技術(shù)人員熟知的任意一種宿主細胞，如大腸桿菌系列菌株，包括DH5 α、W3110、HBlOU JM83、JMlOl和JM109 等生長迅速，培養(yǎng)簡單，重組子穩(wěn)定的菌株。在一個優(yōu)選實施方案中，宿主細胞為Eco. Ii JM109菌株。本發(fā)明所述制備方法步驟2所述限制性內(nèi)切酶酶切驗證陽性克隆為分別通過限制性內(nèi)切酶 I、BglII/Cla I,Hind ΙΙΙ/Xho I,Hind ΙΙΙ/BglII 和 SphI 酶切驗證。其中，所述限制性內(nèi)切酶切后的理論大小分別為Sal I酶切產(chǎn)生9398bp片段；Bglll/Clal酶切產(chǎn)生829bp和8569bp兩個片段；Hind ΙΙΙ/Xho I酶切產(chǎn)生3303bp和6095bp兩個片段； Hind ΙΙΙ/BglII酶切產(chǎn)生1721bp和7677bp兩個片段；SphI酶切產(chǎn)生1503bp和7895bp兩個片段。


圖1示實施例1 4中各片段酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖，泳道1為DL15000DNA 分子量標志物，泳道2為實施例1酶切后的片段，泳道3為實施例2酶切后的片段，泳道4 為實施例3酶切后的片段，泳道5為實施例4酶切后的片段，泳道6為DL2000DNA分子量標志物；圖2示實施例5不同的限制性內(nèi)切酶酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖，泳道1為 DL15000DNA分子量標志物，泳道2為對照，泳道3為限制性內(nèi)切酶Ml I酶切后的片段，泳道4為限制性內(nèi)切酶Bgl II/Cla I酶切后的片段，泳道5為限制性內(nèi)切酶HindIIlAho I 酶切后的片段，泳道6為限制性內(nèi)切酶Hindlll/Bglll酶切后的片段，泳道7為限制性內(nèi)切酶SphI酶切后的片段，泳道8為DL2000DNA分子量標志物；圖3示本發(fā)明所述轉(zhuǎn)座載體的質(zhì)粒譜圖；圖4示實施例6本發(fā)明所述轉(zhuǎn)座載體分別與PB和SB兩種轉(zhuǎn)座酶共轉(zhuǎn)染H印G2細胞后，捕獲內(nèi)源基因驅(qū)動報告基因表達的統(tǒng)計結(jié)果圖，其中橫坐標為實驗組別，縱坐標為藍色斑點數(shù)量。
具體實施例方式本發(fā)明實施例公開了一種轉(zhuǎn)座載體及其構(gòu)建方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。為了進一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細說明。實施例1 本發(fā)明所述轉(zhuǎn)座載體中B10I-Bgl II片段的制備由中美泰和生物技術(shù)有限公司人工合成不含剪切受體片段的Hind III-XhoI片段，片段大小3327bp，包括PB和SB的轉(zhuǎn)座酶識別序列，復(fù)制起始位點，氨芐青霉素抗性基因，兩個IoxP位點序列和兩個Frt位點序列，并測序驗證。提取EGFP β geo質(zhì)粒，用HindIII和Β ο I限制性內(nèi)切酶雙酶切EGFP β geo質(zhì)粒和化學(xué)合成的片段，反應(yīng)體系如下A管中加入以下成分
EGFPPgeo質(zhì)粒2颶
Hindlll(\5UI\il,)IpL
Xho I (15U^L)
IOxKbuffer2μΙ
加入滅菌蒸餾水補足體系總量至20汕。B管中加入以下成分
化學(xué)合成片段2颶
Η η ΙΙΙ(\5υ/μ^IpL
Sg/II(15U^L)IpL
IOxKbuffer2μΙ
加入滅菌蒸餾水補足體系總量至20汕。將Α，B兩管放入37°C恒溫水浴池進行酶切消化，然后將酶切產(chǎn)物進行凝膠電泳并通過膠回收試劑盒OiIAGEN)進行DNA凝膠回收，回收長度為6905bp的剪切受體片段和長度為3303bp的化學(xué)合成片段?；厥掌卧赥4DNA連接酶(購自Takara公司)的作用下 4°C連接過夜(8 12h)。連接反應(yīng)體系
酶切后的A片段
酶切后的化學(xué)合成B片段IpL
T4DNA連接酶IpL
連接酶buffer2μL
加入滅菌蒸餾水補足體系總量至20汕。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入Eco. Ii JM109感受態(tài)細胞(Takara公司)，經(jīng)含有氨芐抗生素的固體培養(yǎng)板篩選14-16小時獲得的陽性克隆，提質(zhì)粒鑒定(小提質(zhì)粒試劑盒，Axgen公司)，Hind III-XhoI酶切鑒定(具體過程同上)，獲得6905bp和3303bp片段的為正確的克隆，正確的克隆通過Bgl IIAho I雙酶切獲得50Mbp的Bi0I-BglII片段，結(jié)果見圖1。
實施例2 本發(fā)明所述轉(zhuǎn)座載體中Bgl II-ClaI片段的制備以pU21質(zhì)粒為模板，用具有SEQ ID No :17所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No :18所示核苷酸序列的下游引物，進行PCR擴增，得到BglII-ClaI片段。PCR擴增反應(yīng)體系
Taq DNA polymerase0.2μLIOxbuffer (Mg2+ free)2\\LdNTP mix (IOmM)0單Mg2+IpL50μΜ上游引物0.2μL50μΜ上游引物0.2μL質(zhì)粒 pU21 (5 lOng/μΙ)IpL加入滅菌蒸餾水補足體系總量至20pL。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)座載體，其特征在于，包含以下元件a)PB轉(zhuǎn)座酶識別序列PBL和PBR ；b)原核生物抗性基因；c)復(fù)制起始位點序列；d)SB轉(zhuǎn)座酶識別序列SBL和SBR ；e)基因捕獲框，所述基因捕獲框包括剪接受體、報告基因與真核生物抗性基因的融合基因和SV40的多聚腺苷酸加尾序列；所述與報告基因融合的抗性基因與所述轉(zhuǎn)座載體所含抗性基因不同；其中，所述PB轉(zhuǎn)座酶識別序列PBL和PBR分別位于轉(zhuǎn)座子的兩端；PB轉(zhuǎn)座酶識別序列 PBL與PBR之間依次為原核生物抗性基因、復(fù)制起始位點序列、SB轉(zhuǎn)座酶識別序列SBL、剪接受體、報告基因與真核生物抗性基因的融合基因、SV40的多聚腺苷酸加尾序列和SB轉(zhuǎn)座酶識別序列SBR。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)座載體，其特征在于，所述原核生物抗性基因抗性基因為氨芐青霉素抗性基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)座載體，其特征在于，所述與報告基因融合的真核生物抗性基因為新霉素抗性基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)座載體，其特征在于，所述報告基因為半乳糖苷酶基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)座載體，其特征在于，所述SV40的多聚腺苷酸加尾序列具有 SEQ ID NO :9所示核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5所述任意一項轉(zhuǎn)座載體，其特征在于，還包括兩個Ioxp位點序列和兩個Frt位點序列，其中，所述第一 Ioxp位點序列和第一 Frt位點序列位于復(fù)制起始位點序列與SBL之間，且第一 Ioxp位點序列位于第一 Frt位點序列的上游；所述第二 Ioxp 位點位于SBL與基因捕獲框之間；所述第二 Frt位點序列位于基因捕獲框與SB轉(zhuǎn)座酶識別序列SBR之間，且第二 Frt位點序列與第一 Frt位點序列反向互補。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述轉(zhuǎn)座載體，其特征在于，具有SEQID NO: 12所示核苷酸序列。
8.一種轉(zhuǎn)座載體的制備方法，其特征在于，包括步驟1、用連接酶將PB轉(zhuǎn)座酶識別序列PBL和PBR、原核生物抗性基因、復(fù)制起始位點序列、SB轉(zhuǎn)座酶識別序列SBL和SBR、兩個Ioxp位點序列、兩個Frt位點序列、剪接受體、報告基因與真核生物抗性基因的融合基因和SV40的多聚腺苷酸加尾序列連接，步驟2 轉(zhuǎn)化宿主細胞，用原核生物抗性基因?qū)?yīng)的抗生素篩選，限制性內(nèi)切酶酶切驗證陽性克隆；其中，所述PBL和PBR分別位于轉(zhuǎn)座子的兩端；PBL與PBR之間依次為原核生物抗性基因、復(fù)制起始位點序列、SBL、剪接受體、報告基因與真核生物抗性基因的融合基因、SV40的多聚腺苷酸加尾序列和SBR ；所述第一 Ioxp位點序列和第一 Frt位點序列位于復(fù)制起始位點序列與SBL之間，且第一 Ioxp位點序列位于第一 Frt位點序列的上游；所述第二 Ioxp位點位于SBL與SV40的多聚腺苷酸加尾序列之間；所述第二 Frt位點序列位于SV40的多聚腺苷酸加尾與SBR之間，且第二 Frt位點序列與第一 Frt位點序列反向互補。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述制備方法，其特征在于，步驟1為用連接酶將具有SEQID NO 13 16所示核苷酸序列的B10I-BglII片段、BglII-ClaI片段、Cla I-Sph I片段和SphI-Xho I片段連接，其中所述 ιοΙ-BglII片段包括PB轉(zhuǎn)座酶識別序列PBL和PBR、原核生物抗性基因、復(fù)制起始位點序列、SB轉(zhuǎn)座酶識別序列SBL和SBR、兩個Ioxp位點序列、兩個 Frt位點序列和剪接受體，所述Bgl II-ClaI片段包括報告基因β-半乳糖苷酶基因前部分序列，所述Cla I-Sph I片段包括報告基因β-半乳糖苷酶基因序列，所述Sph I-Xho I片段包括報告基因β -半乳糖苷酶基因與新霉素抗性基因的融合基因的末端和SV40的多聚腺苷酸加尾序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述制備方法，其特征在于，步驟2所述宿主細胞為Eco.Ii JM109菌株。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述制備方法，其特征在于，步驟2所述限制性內(nèi)切酶酶切驗證陽性克隆為分別通過限制性內(nèi)切酶Ml I、Bgl ΙΙ/Cla I、Hind ΙΙΙ/Xho I、HindIII/Bgl II 和Sph I酶切驗證。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種轉(zhuǎn)座載體及其制備方法。本發(fā)明所述轉(zhuǎn)座載體融合了PB和SB兩種DNA轉(zhuǎn)座子的特性，能夠在PB轉(zhuǎn)座酶和SB轉(zhuǎn)座酶條件下轉(zhuǎn)座，同時整合了包括剪接受體、報告基因與真核生物抗性基因的融合基因和SV40的多聚腺苷酸加尾序列的基因捕獲閱讀框，用以在轉(zhuǎn)座過程中實現(xiàn)基因的插入突變，可廣泛應(yīng)用于小鼠、大鼠、豬等哺乳動物的基因突變模型的建立及基因組內(nèi)大規(guī)?；蚬δ芎Y選。本發(fā)明所述轉(zhuǎn)座載體還包括loxp位點和Frt位點序列，可以實現(xiàn)轉(zhuǎn)座后近距離DNA片段的條件性敲除，應(yīng)用于小鼠、大鼠、豬等哺乳動物的大片段DNA序列的條件性缺失模型建立。
文檔編號C12N15/64GK102286514SQ20111020335
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月20日
發(fā)明者全雄志, 張連峰, 王貴利, 馬元武 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所