專利名稱：噬菌體展示抗原克隆生物標(biāo)志物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及噬菌體展示技術(shù)。
背景技術(shù)：
用噬菌體載體克隆抗原基因做為生物標(biāo)志物時，被克隆的抗原基因與載體噬菌體的基因連在一起，形成融合蛋白基因。融合蛋白基因表達(dá)后包裝形成噬菌體顆粒，被克隆的抗原基因的表達(dá)產(chǎn)物就被展示在重組噬菌體顆粒表面。重組噬菌體顆粒可被點在生物芯片或其它承載介質(zhì)上，抗原便可在承載介質(zhì)上與加入的抗體發(fā)生特異雜交反應(yīng)并在儀器終端生成圖像信號數(shù)據(jù)。在將重組噬菌體顆粒點在生物芯片或其它承載介質(zhì)上的時候，點樣量常常難以準(zhǔn)確控制，同一點樣批次的點樣量差距不會太大，但不同點樣批次的差距會較大。 這就需要一種可以消除這些差距引起的誤差的方法?，F(xiàn)有的方法常常在加入與克隆的抗原基因相對應(yīng)的抗體(如血清)和標(biāo)記的抗原基因抗體的抗體的同時，加入噬菌體抗體及標(biāo)記的噬菌體抗體的抗體以定量校正不同的點樣點(加樣點)的點樣量(加樣量)。比如，用抗原重組噬菌體展示技術(shù)結(jié)合生物芯片技術(shù)開發(fā)人類癌癥檢測標(biāo)志物時，現(xiàn)有的定量校正方法就是在加入受檢者的血清和標(biāo)記的IgG 的抗體的同時，加入適量的噬菌體抗體及標(biāo)記的噬菌體抗體的抗體。噬菌體引發(fā)的的信號強度與抗原蛋白引發(fā)的信號強度相對值就可以用來消除各個點樣點之間因點樣量不同引起的誤差?，F(xiàn)有的方法有時會出現(xiàn)定量校正不準(zhǔn)確的情況。在加入受檢者的血清的同時，加入適量的噬菌體抗體進(jìn)行定量校正，在噬菌體抗體不能與抗原克隆產(chǎn)生相互交叉非特異性雜交反應(yīng)，或者在血清抗體與噬菌體抗體不產(chǎn)生空間排斥的情況下是有效的；但當(dāng)噬菌體抗體能與抗原克隆產(chǎn)生相互交叉非特異性雜交反應(yīng)或者在血清抗體與噬菌體抗體能產(chǎn)生空間排斥(空間阻礙)的情況下，就會產(chǎn)生誤差。如果所用抗原克隆種類非常多(如幾十種、幾百種、或幾千種)，這種非特異性雜交反應(yīng)就很難避免，導(dǎo)致所得結(jié)果出現(xiàn)誤差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種噬菌體展示抗原克隆生物標(biāo)志物的方法，本發(fā)明的方法提供了一種不同于現(xiàn)有技術(shù)的一個定量校正方法，該方法可以有效避免或降低這種非特異性雜交和空間排斥引起的定量校正誤差。本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下具體步驟如下1、將熒光蛋白基因插入噬菌體DNA的克隆位點前并使熒光蛋白基因的表達(dá)閱讀框架(reading frame)與噬菌體DNA—致；2、再用此重組噬菌體DNA去克隆抗原基因或基因片段；3、重組噬菌體基因在寄主細(xì)菌中表達(dá)；4、將表達(dá)的重組噬菌體點在生物芯片上或其它承載介質(zhì)上；
5、將點好樣的生物芯片與血清抗體雜交；6、再加入標(biāo)記的血清抗體的抗體(二抗)；7、讀取信號及數(shù)據(jù)分析。前述步驟(1)的步驟包括將熒光蛋白基因連接上適當(dāng)?shù)恼尺B序列；再將噬菌體 DNA和熒光蛋白基因用適當(dāng)?shù)拿该盖?；將熒光蛋白基因插入噬菌體DNA。本發(fā)明中的定量校正方法是采用熒光蛋白來完成的。熒光蛋白具有能夠在某些波長的光的激發(fā)下自身發(fā)熒光的功能。熒光蛋白首先被發(fā)現(xiàn)存在于水母體內(nèi)，后其基因被分離、克隆、表達(dá)，并被廣泛用于細(xì)胞生物學(xué)，通過將其與另一基因融合表達(dá)，用熒光蛋白的熒光信號示蹤其它基因在細(xì)胞或在動物活體中的表達(dá)。本發(fā)明就是采用了熒光蛋白這種特殊功能，將其與抗原基因或基因片段融合，并將熒光蛋白的發(fā)射光強做為對照來定量校正噬菌體展示抗原蛋白克隆生物標(biāo)志物的點樣量。本發(fā)明利用熒光蛋白本身可以發(fā)射熒光的特性，用熒光蛋白代替了噬菌體抗體和標(biāo)記的噬菌體抗體的抗體的定量校正功能。本發(fā)明所用的熒光蛋白的種類包括，但不限于 綠色焚光蛋白(green fluorescence protein,GFP)、黃色焚光蛋白(yellow fluorescence protein, YFP)、紅色熒光蛋白(red fluorescence protein, RFP)，及其增強型衍生體及其它衍生體，如增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)、增強型黃色熒光蛋白(enhanced yellow fluorescence protein, EYFP)，增強型紅色熒光蛋白 (enhanced red fluorescence protein，ERFP)，以及其它有自身發(fā)熒光功能的蛋白。本發(fā)明所述噬菌體包括單鏈絲狀噬菌體、λ噬菌體、Τ4噬菌體以及Τ7噬菌體。本發(fā)明所用的寄主細(xì)菌較佳的為大腸桿菌。更佳地為大腸桿菌BLT5615。本發(fā)明所述的生物芯片包括，但不限于生物芯片微陣列，蛋白生物芯片微陣列， 生物液體芯片微陣列。本發(fā)明所用的寄主細(xì)菌較佳的為大腸桿菌。更佳地為大腸桿菌寄主菌株BLT5615。本技術(shù)可應(yīng)用于所有以噬菌體為載體的，以包括傳統(tǒng)ELISA，生物芯片微陣列，蛋白生物芯片微陣列，生物液體芯片微陣列為基礎(chǔ)的蛋白生物標(biāo)志物技術(shù)。本發(fā)明提供的噬菌體展示技術(shù)用來克隆抗原基因或基因片段時，這些被克隆展示的抗原可做為生物標(biāo)志物用于檢測人體體液中的相應(yīng)抗體，進(jìn)而檢測某種或多種人類疾病，如各種癌癥，心血管病，自免疫病，等。由于每個噬菌體載體上同時插入了熒光蛋白和抗原基因(或抗原基因片段)，熒光蛋白的信號強度與抗原蛋白引發(fā)的信號強度相對值可以有效地消除各個點樣點之間因點樣量不同引起的誤差。在保證能夠定量校正點樣量的同時，又能避免可能產(chǎn)生的相互交叉雜交及可能存在的空間排斥對結(jié)果的干擾?，F(xiàn)有技術(shù)的定量校正是通過用噬菌體抗體和標(biāo)記的噬菌體抗體的抗體來完成的； 而本發(fā)明是通過用熒光蛋白來完成的。本發(fā)明用熒光蛋白自身發(fā)光的功能替代了噬菌體抗體和標(biāo)記的噬菌體抗體的抗體的定量校正功能。熒光蛋白能自身發(fā)射熒光，既可起到定量校正的功能，又可排除噬菌體抗體及噬菌體抗體的抗體與克隆的抗原之間的非特異性雜交；熒光蛋白融入了噬菌體蛋白顆粒，對克隆抗原與克隆抗原的抗體之間的雜交沒有空間上的競爭。


圖1為本發(fā)明的技術(shù)方案流程示意圖；和背景技術(shù)相比，免去了用噬菌體抗體及標(biāo)記的噬菌體抗體的抗體定量校正的步驟，用熒光蛋白替代了噬菌體抗體及噬菌體抗體的抗體的定量校正功能。圖2為用噬菌體抗體及噬菌體抗體的抗體的雜交流程(現(xiàn)有技術(shù))；圖3為熒光蛋白的雜交流程(本發(fā)明技術(shù))。
具體實施例方式實施例一、制備與增強綠色熒光蛋白(EGFP)基因融合的T7噬菌體載體本發(fā)明制備與EGFP基因融合的T7噬菌體載體可以通過多種具體途徑實施，下面就進(jìn)行較詳細(xì)的描述用如下一對包裹EGFP核苷酸序列的PCR引物正向5，CTTCAGAATTCCAGTATGGTGAGCAAGGGCGA 3，反向5’ TCAGTAAGCTTCACTTTACTTGTACAGCTCGTCCATG 3'從質(zhì)粒載體pEGFP擴增出EGFP的核苷酸序列。在該對PCR引物中， ATGGTGAGCAAGGGCGA 和 TTACTTGTACAGCTCGT 來自 EGFP 核苷酸序列，GAATTC 是 EcoR I 內(nèi)切酶的切點，AAGCTT是Hind III內(nèi)切酶的切點。這樣，擴增出來的EGFP核苷酸序列中，正向5’ 末端含一個EcoR I切點，3’末端含一個Hind III切點，而EGFP核苷酸序列本身卻不包含這兩個切點的任何一個。這兩個切點與T7噬菌體載體的EcoR I和Hind III配合將EGFP 核苷酸序列插入T7噬菌體。PCR反應(yīng)在20 μ 1的反應(yīng)液中進(jìn)行，反應(yīng)液中含IOpg的pEGFP 質(zhì)粒DNA模板、2mM MgCl2、ImM各核苷酸(dNTP)、IXPCR緩沖液(IOmM Tris-HCl pH8. 3、50mM 此1，0.0001%膠原蛋白)、1口11的正向和反向引物、1單位的Taq酶。反應(yīng)溫度循環(huán)如下 94 0C 2分鐘，30個循環(huán)的94 °C 45秒、58°C 45秒、72°C 45秒，再72°C 5分鐘。在總體積為 50 μ 1的反應(yīng)液中，加入10 μ 1擴增的EGFP的PCR產(chǎn)物、5 μ 1 IOX Hind III內(nèi)切酶緩沖液、 10單位Hind III和10單位EcoR I內(nèi)切酶37°C消化3小時。同時，在另外20 μ 1的反應(yīng)液中，將Ig Τ7噬菌體載體也用EcoR I和Hind III內(nèi)切酶37°C消化3小時。在10 μ 1的反應(yīng)液中，加入2μ 1擴增的EGFP的內(nèi)切酶消化液、1 μ 1的Τ7噬菌體載體內(nèi)切酶消化液、 1 μ 1的IOX的連接酶緩沖液、1 μ 1 IOmM的ATP、1 μ 1 IOOmM的DTT、1單位T4DNA連接酶。 反應(yīng)在14°C進(jìn)行16小時。之后4°C下保存，或直接進(jìn)行包裝。噬菌體包裝、裂解擴增、效價測定按照Nogagen公司試劑盒“T7Select System Manual ”提供的方法進(jìn)行。從效價測定的培養(yǎng)盤上挑選6個噬菌斑，用T7引物PCR擴增后，稀釋5倍的PCR產(chǎn)物用作模板測序，檢驗插入EGFP的序列。挑選EGFP插入序列正確的克隆擴增、提取純化融合噬菌體載體DNA、 EcoR I和Hind III內(nèi)切酶酶切、純化、將濃度調(diào)至200ng/μ 1后，保存于_20°C待用。EGFP的核苷酸序列如下ATGGTGAGCA AGGGCGAGGA GCTGTTCACC GGGGTGGTGC CCATCCTGGTCGAGCTGGAC GGCGACGTAA ACGGCCACAA GTTCAGCGTG TCCGGCGAGGGCGAGGGCGA TGCCACCTAC GGCAAGCTGA CCCTGAAGTT CATCTGCACCACCGGCAAGC TGCCCGTGCC CTGGCCCACC CTCGTGACCA CCCTGACCTACGGCGTGCAG TGCTTCAGCC GCTACCCCGA CCACATGAAG CAGCACGACTTCTTCAAGTC CGCCATGCCC GAAGGCTACG TCCAGGAGCG CACCATCTTC
TTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGG
CGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGG
ACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAAC
GTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAA
GATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACC
AGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCAC
TACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGA
TCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCA
TGGACGAGCTGTACAAGTAA
用上述PCR引物擴增后的PCR產(chǎn)物的序列如下
CTTCAGAATTCCAGT
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGT
CGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGG
GCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACC
ACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTA
CGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACT
TCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTC
TTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGG
CGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGG
ACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAAC
GTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAA
GATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACC
AGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCAC
TACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGA
TCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCA
TGGACGAGCTGTACAAGTAAAGTGAAGCTTACTGA。
實施例二、T7噬菌體cDNA文庫轉(zhuǎn)成熒光蛋白基因融合T7噬菌體cDNA文庫。
起始的T7噬菌體cDNA文庫是用試齊U ！ Trizol (Invitrogen)、polyA
mRNA purification (Qiagen)、T70rientExpress (Novagen)、 禾口 T7Select System Manual (Novagen)從癌癥組織和癌細(xì)胞系構(gòu)建而來，共12個96孔盤1152個T7噬菌體抗原克隆。首先照上述試劑盒方法培養(yǎng)得到12個盤的裂解液(每孔180，并將它們合并，得到約 200ml裂解液，從這200ml的裂解液中提取T7噬菌體cDNA文庫DNA，取20 μ g cDNA文庫DNA 用EcoR I和Hind III內(nèi)切酶消化反應(yīng)3小時，1. 5%瓊脂糖膠分離，切下鏈長200至1600 堿基對的凝膠部分，用硅介質(zhì)法提取、純化凝膠中DNA至200 μ 1 10/1ΤΕ緩沖液中，保存于-20°C待用。這些待克隆的cDNA片段也可用試劑盒Trizol、polyA mRNA purification、 T70rientExpress,從癌癥組織和癌細(xì)胞系提取、純化mRNA，合成、修飾(連接粘結(jié)序列)、 酶切(EcoR I，Hind III)cDNA得到。在10 μ 1的反應(yīng)液中，加入21cDNA的內(nèi)切酶消化液、 1 μ 1的融合Τ7噬菌體載體內(nèi)切酶消化液、1 μ 1的IOX的連接酶緩沖液、1 μ 1 IOmM的ΑΤΡ、 1μ 1 IOOmM的DTT、1單位T4DNA連接酶。反應(yīng)在14°C進(jìn)行16小時。之后4°C下保存，或直接進(jìn)行包裝。噬菌體包裝、裂解擴增、效價測定按照Nogagen公司試劑盒“T7Select System Manual”提供的方法進(jìn)行。根據(jù)裂解擴增的重組噬菌體效價測定計算，按每個15cm瓊脂LB 培養(yǎng)皿400個噬菌斑稀釋裂解液鋪盤，共鋪6個盤。用牙簽挑選邊緣清晰、不與其它斑點粘連的噬菌斑置于每孔盛有8(^1待裂解大腸桿菌寄主菌株^^5615的96孔培養(yǎng)皿，共挑選 12盤96孔培養(yǎng)皿(共1152個克隆)。裂解后加入5 μ 1終止裂解混合液(終止混合液由如下試劑及比例組成PMSF(in 2ml MEOH,addO. 007g PMSF) 2% Gelatin PIC(Sigma) =1:1: 1)終止裂解，保存于-80°C待用。實施例三、制備抗原蛋白芯片、抗原蛋白芯片與血清樣本(來自癌癥病人和健康對照)群體印跡雜交反應(yīng)、和檢測癌癥。在12個96孔培養(yǎng)皿中每孔加入感受態(tài)待裂解大腸桿菌寄主菌株BLT5615 180μ1，用96針印戳將保存?zhèn)溆玫?2盤的1152個帶有熒光蛋白基因噬菌體的抗原克隆復(fù)制到這12個盤中，裂解后加入12μ 1終止裂解混合液。這12個盤的抗原蛋白-熒光蛋白_噬菌體重組克隆再轉(zhuǎn)入3個384孔盤，每孔15 μ 1 (180 μ 1至少可轉(zhuǎn)入8個3X384)，用 Cartesian 5510芯片點樣儀，每個3X384 (3個盤)可點80張芯片，用2個3X384點兩批130 張芯片。同時，用相同方法制作沒有插入熒光蛋白基因的重組噬菌體的12個盤抗原克隆， 合并到3個384孔盤，同樣用2個3X384點兩批130張芯片。按照Chatterjee M，Mohapatra S, Ionan A, Bawa G, Ali-Fehmi R, Wang X, Nowak J, Ye B, Nahhas FA, Lu K, Witkin SS, Fishman D, Munkarah A, Morris R, Levin NK, Shirley NN, Tromp G, Abrams J, Draghici S, Tainsky MA. Diagnostic markers of ovarian cancer by high-throughput antigen cloning and detection on arrays. Cancer Res. 2006 ;66 :1181_90 中描述的雜交方法， 用120個血清樣本(60個來自癌癥病人，60個來自健康人)分別與120張具熒光蛋白基因的重組克隆芯片雜交，相同的120個血清樣本用相同的雜交方法分別與120張不具熒光蛋白基因的重組克隆芯片雜交。雜交后，各芯片用Axon 4200Autoloader芯片掃描儀掃描成圖像數(shù)據(jù)文件，再將圖像數(shù)據(jù)用Imagene軟件轉(zhuǎn)化為數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)。再按照Ho-Sheng Lin, Harvinder S.Talwar, Adi Tarea, Alexei Ionan, Madhumita Chatterjee, Bin Ye, Jerzy Wojciechowski, Saroj Mohapatra, Marc D. Basson, George Yoo, Brian Peshek, Fulvio Lonardo, Chuan-Ju G.Pan, Sorin Draghici, Judith Abrams, and Michael A. Tainsky. Autoantibody Approach for Serum-Based Detection of Head and Neck Cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2007. 16 :2396_2405中描述的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計算癌癥預(yù)測靈敏性、特異性、及準(zhǔn)確率。實驗結(jié)果表明用不具熒光蛋白基因的重組克隆芯片的癌癥預(yù)測靈敏性、特異性、及準(zhǔn)確率分別為71%、73%、和72%;用具熒光蛋白基因的重組克隆芯片的癌癥預(yù)測靈敏性、特異性、及準(zhǔn)確率則分別為84%、82%、和83%。靈敏性、特異性、 及準(zhǔn)確率分別提高了 13% (P = 0. 00052) ,9% (P = 0. 00071)、和 11% (P = 0. 00062)。EGFP蛋白序列MVSKGEELFT GVVPILVELD GDVNGHKFSV SGEGE⑶ATY GKLTLKFICT TGKLPVPffPT LVTTLTYGVQCFSRYPDHMK QHDFFKSAMP EGYVQERTIF FKDDGNYKTR AEVKFEGDTL VNRIELKGID FKEDGNILGHKLEYNYNSHN VYIMADKQKN GIKVNFKIRH NIEDGSVQLA DHYQQNTPIG DGPVLLPDNH YLSTQSALSKDPNEKRDHMV LLEFVTAAGI TLGMDELYKii。上述僅為本發(fā)明的具體實施例，但本發(fā)明的設(shè)計構(gòu)思并不局限于此，凡利用此構(gòu)思對本發(fā)明進(jìn)行非實質(zhì)性的改動，均應(yīng)屬于侵犯本發(fā)明保護(hù)范圍的行為。
權(quán)利要求
1.一種噬菌體展示抗原克隆生物標(biāo)志物的方法，包括如下步驟(1)將熒光蛋白基因插入噬菌體DNA的克隆位點前并使熒光蛋白基因的表達(dá)閱讀框架與噬菌體DNA —致；(2)用此重組噬菌體DNA去克隆抗原基因或基因片段；(3)重組噬菌體基因在寄主細(xì)菌中表達(dá)；(4)將表達(dá)的重組噬菌體點在生物芯片上或其它承載介質(zhì)上；(5)將點好樣的生物芯片與血清抗體雜交；(6)加入標(biāo)記的血清抗體的抗體；(7)讀取信號及數(shù)據(jù)分析。
2.如權(quán)利要求1所述的一種噬菌體展示抗原克隆生物標(biāo)志物的方法，其特征在于所述步驟(1)的方法包括將熒光蛋白基因連接上適當(dāng)?shù)恼尺B序列；再將噬菌體DNA和熒光蛋白基因用適當(dāng)?shù)拿该盖?；將熒光蛋白基因插入噬菌體DNA。
3.如權(quán)利要求1所述的一種噬菌體展示抗原克隆生物標(biāo)志物的方法，其特征在于熒光蛋白包括綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白，及其增強型衍生體及其它衍生體，以及其它有自身發(fā)熒光功能的蛋白。
4.如權(quán)利要求1所述的一種噬菌體展示抗原克隆生物標(biāo)志物的方法，其特征在于所述噬菌體包括單鏈絲狀噬菌體、λ噬菌體、Τ4噬菌體或Τ7噬菌體。
5.如權(quán)利要求1所述的一種噬菌體展示抗原克隆生物標(biāo)志物的方法，其特征在于所述的寄主細(xì)菌為大腸桿菌。
6.如權(quán)利要求5所述的一種噬菌體展示抗原克隆生物標(biāo)志物的方法，其特征在于寄主細(xì)菌為大腸桿菌BLT5615。
7.如權(quán)利要求1、2、3、4或5所述的一種噬菌體展示抗原克隆生物標(biāo)志物的方法，其特征在于所述生物芯片包括生物芯片微陣列，蛋白生物芯片微陣列，生物液體芯片微陣列。
8.一種噬菌體展示抗原克隆生物標(biāo)志物的方法，包括如下步驟(1)制備與增強綠色熒光蛋白(EGFP)基因融合的Τ7噬菌體載體用如下一對包裹EGFP核苷酸序列的PCR引物正向 5’ CTTCAGAATTCCAGTATGGTGAGCAAGGGCGA 3’反向 5' TCAGTAAGCTTCACTTTACTTGTACAGCTCGTCCATG 3'從質(zhì)粒載體PEGFP擴增出EGFP的核苷酸序列；擴增出來的EGFP核苷酸序列中，正向5’ 末端含一個EcoR I切點，3’末端含一個Hind III切點，利用這兩個切點與T7噬菌體載體的EcoR I和Hind III配合將EGFP核苷酸序列插入T7噬菌體；(2)T7噬菌體cDNA文庫轉(zhuǎn)成熒光蛋白基因融合T7噬菌體cDNA文庫(3)制備抗原蛋白芯片、抗原蛋白芯片與血清樣本群體印跡雜交反應(yīng)；(4)信號檢測。
9.如權(quán)利要求1所述的一種噬菌體展示抗原克隆生物標(biāo)志物的方法的用途，其應(yīng)用于以噬菌體為載體的，以包括傳統(tǒng)ELISA，生物芯片微陣列，蛋白生物芯片微陣列，生物液體芯片微陣列為基礎(chǔ)的蛋白生物標(biāo)志物技術(shù)上。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種噬菌體展示抗原克隆生物標(biāo)志物的方法，本發(fā)明在噬菌體展示技術(shù)中，用熒光蛋白替代了噬菌體抗體和標(biāo)記的噬菌體抗體的抗體，熒光蛋白能自身發(fā)射熒光，既可起到定量校正的功能，又可排除噬菌體抗體及噬菌體抗體的抗體與克隆的抗原之間的非特異性雜交；熒光蛋白融入了噬菌體蛋白顆粒，對克隆抗原與克隆抗原的抗體之間的雜交沒有空間上的競爭。
文檔編號C12R1/19GK102305853SQ20111020422
公開日2012年1月4日 申請日期2011年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月20日
發(fā)明者翁長仁 申請人:龍巖九健生物芯片技術(shù)研究所