專利名稱：一種綿羊支原體肺炎抗性基因型的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體說是涉及一種綿羊支原體肺炎抗性基因型的篩選方法。
背景技術(shù)：
綿羊支原體性肺炎又稱綿羊傳染性胸膜肺炎的病原，是一種由綿羊肺炎支原體 (Mycoplasma ovipneumoniae,MO)所引起的以咳嗽、喘氣、漸進(jìn)性消瘦以及肺間質(zhì)增生性炎癥為特征的呼吸道疾病，本病的直接損失是羔羊死亡率增加、疾病監(jiān)測治療的費(fèi)用提高；間接損失主要是疾病的慢性營養(yǎng)消耗、體重減輕、上市推遲、繁殖力降低等。因此從抗病育種的角度，通過研究MBL基因多態(tài)性與疾病的相關(guān)性，采用PCR-SSCP技術(shù)研究其MBL基因外顯子和內(nèi)含子的遺傳多態(tài)性，并統(tǒng)計(jì)分析MBL基因不同的基因型與湖羊血清MBL水平的相關(guān)性，尋找抗性型與易感型個(gè)體，為研究綿羊MBL基因的多態(tài)性與疾病的關(guān)系奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，對合理開發(fā)利用新疆地方綿羊品種遺傳資源以及引進(jìn)新品種具有重要的現(xiàn)實(shí)意義；MBL存在于人及動(dòng)物的血液和肝臟組織中，是一種重要的天然免疫防御分子，MBL 能直接介導(dǎo)調(diào)理吞噬作用或通過MBL途徑激活補(bǔ)體，在機(jī)體先天性免疫防御、免疫監(jiān)視和免疫復(fù)合物清除中起重要作用。MBL生物學(xué)功能的實(shí)現(xiàn)有賴于其完整的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，MBL結(jié)構(gòu)基因突變影響了蛋白多聚體的功能性和穩(wěn)定性，使得MBL血清濃度明顯降低，機(jī)體的免疫防御和監(jiān)視能力削弱，導(dǎo)致機(jī)體對多種病原的易感。研究表明編碼區(qū)上游(主要是外顯子1、2)的點(diǎn)突變則會(huì)影響血清MBL檢測濃度，而內(nèi)含子區(qū)域的突變可能影響轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致功能區(qū)翻譯不全，使得MBL的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，因此MBL基因外顯子和內(nèi)含子的多態(tài)性與 MBL的表達(dá)水平具有一定的相關(guān)性，為進(jìn)一步選育綿羊支原體肺炎抗性基因型個(gè)體奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是以常發(fā)病綿羊支原體肺炎為疾病模型，實(shí)驗(yàn)證實(shí)該病與MBL多態(tài)性及血清水平有相關(guān)性，并提供綿羊MBL基因與MBL水平相關(guān)的21種基因型和各自的突變位點(diǎn)，分析了綿羊MBL基因外顯子1、4和內(nèi)含子1、2的多態(tài)性，通過測序找到他們的突變位點(diǎn)，并經(jīng)過EILSA檢測發(fā)現(xiàn)這些位點(diǎn)的突變對綿羊支原體肺炎的抗性是有意義的，最后用人工感染的方法進(jìn)行了驗(yàn)證的一種綿羊支原體肺炎抗性基因型的篩選方法，以克服上述不足。本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種綿羊支原體肺炎抗性基因型的篩選方法，其特征是綿羊支原體肺炎抗性基因多態(tài)性分析及篩選，具體篩選包括以下方法(1)樣品采集和綿羊基因組DNA的提取；(2)對MBL外顯子1和4、內(nèi)含子1和2逐段進(jìn)行多態(tài)性分析，設(shè)計(jì)了 7對引物， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出與MBL水平相關(guān)的基因型21種，其中外顯子1上有4種基因型，即AA、BB、CC和BC型，含5個(gè)突變位點(diǎn)，分別位于第27、41、43、83、105位點(diǎn)，其中g(shù). 27T > C 和 gl05C > T 為同義突變，g41T > A (Val 14 Glu)，g43G > A (Val 15 Met)，g83A > G(Glu28 Gly) 3處為錯(cuò)義突變；外顯子4上有3種基因型，即GG、GH和HH型，含5個(gè)突變位點(diǎn)，分別位于第 3235、3243、3257、3331、3334 位點(diǎn)，其中 g. 3235T > C，g. 3331C > T，g. 3334C > T 為同義突變，g. 3243A>G(Glu 181 Gly)，g. 3257G > A (Gly 186 Ser) 2 處為錯(cuò)義突變；內(nèi)含子 1上有3種基因型，含AA、BB、AB型，1個(gè)突變位點(diǎn)，位于第288位點(diǎn)；內(nèi)含子2上有11種基因型，包括PP、OP、CC、CD、DD、EE、EF、FF、GG、GH、HH型，含3個(gè)突變位點(diǎn)，分別位于第1091、 1096、1784位點(diǎn)，均為同義突變位點(diǎn)；(3)進(jìn)行綿羊支原體肺炎EILSA抗體水平檢測，以外顯子1的多態(tài)性分析為基礎(chǔ)， 對同一基因型綿羊支原體肺炎陰性和陽性不同個(gè)體進(jìn)行差異顯著性分析，篩選出綿羊支原體肺炎抗性基因型和易感性基因型；(4)以外顯子1的多態(tài)性分析為基礎(chǔ)，篩選出中國美利奴羊四種不同MBL基因型， 即BB型、BC型、CC型和DD型各9只，建立供試群體，EILSA檢測群體MBL水平，結(jié)果顯示 CC型MBL血清水平最高，BB、BC次之，DD型MBL血清水平最低，預(yù)測CC型為抗性組，DD型為易感組，人工感染綿羊肺炎支原體，結(jié)果抗性組中發(fā)病2只，未發(fā)病7只；易感組中發(fā)病7 只，未發(fā)病2只，對照組均未發(fā)病，BC組中發(fā)病5只，未發(fā)病5只；BB組中發(fā)病5只，未發(fā)病 4只，表明抗性組綿羊支原體肺炎的感染率顯著低于易感組。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明以綿羊支原體肺炎為疾病模型，從補(bǔ)體角度入手，通過對綿羊自身MBL基因的研究，研究發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性與綿羊支原體的抗性緊密相關(guān)，預(yù)測MBL基因?yàn)榫d羊支原體肺炎抗性性狀的候選基因，可作為選育高抗性綿羊的分子標(biāo)記，并能快速、準(zhǔn)確地建立抗綿羊支原體肺炎新品系，同時(shí)，本發(fā)明也可為該疾病的治療提供新的思路，MBL作為廣泛參與多種疾病免疫途徑的重要因素，該發(fā)明為其它疾病研究提供借鑒，因此通過PCR-SSCP篩選得到的基因型和多態(tài)位點(diǎn)對綿羊支原體肺炎的抗病育種有一定意義，對合理開發(fā)利用新疆地方綿羊品種遺傳資源以及引進(jìn)新品種具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。


圖1是本發(fā)明綿羊全血基因組DNA提取結(jié)果圖；圖2是本發(fā)明湖羊MBL基因外顯子1的PCR-SSCP電泳圖；圖3是本發(fā)明湖羊MBL基因外顯子4的PCR-SSCP電泳圖；圖4是本發(fā)明弓丨物對③PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的SSCP分析圖；圖5是本發(fā)明引物對④PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的SSCP分析圖；圖6是本發(fā)明弓丨物對⑤PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的SSCP分析圖；圖7是本發(fā)明弓丨物對⑥PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的SSCP分析圖；圖8是本發(fā)明弓丨物對⑦PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的SSCP分析圖。下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，
具體實(shí)施例方式實(shí)施例檢測各個(gè)樣本的基因型，篩選出和我們測到的抗性型基因一致的個(gè)體進(jìn)行育種，淘汰易感性基因型個(gè)體，以徹底從遺傳水平上消滅支原體肺炎。如圖1-圖8所示，一種綿羊支原體肺炎抗性基因型的篩選方法，其特征是由綿羊支原體綿羊肺炎抗性基因提取篩選，具體篩選包括以下方法和步驟(1)樣品采集和綿羊基因組DNA的提取；(2)對MBL外顯子1和4、內(nèi)含子1和2逐段進(jìn)行多態(tài)性分析，設(shè)計(jì)了 7對引物， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出與MBL水平相關(guān)的基因型21種，其中外顯子1上有4種基因型，即 AA、BB、CC和BC型，含5個(gè)突變位點(diǎn)，分別位于第27、41、43、83、105位點(diǎn)，其中g(shù). 27T > C 和 gl05C > T 為同義突變，g41T > A (Val 14 Glu)，g43G > A (Val 15 Met)，g83A > G(Glu28 Gly) 3處為錯(cuò)義突變；外顯子4上有3種基因型，即GG、GH和HH型，含5個(gè)突變位點(diǎn)，分別位于第 3235、3243、3257、3331、3334 位點(diǎn)，其中 g. 3235T > C，g. 3331C > T，g. 3334C > T 為同義突變，g. 3243A>G(Glu 181 Gly)，g. 3257G > A (Gly 186 Ser) 2 處為錯(cuò)義突變；內(nèi)含子 1上有3種基因型，含AA、BB、AB型，1個(gè)突變位點(diǎn)，位于第288位點(diǎn)；內(nèi)含子2上有11種基因型，包括PP、OP、CC、CD、DD、EE、EF、FF、GG、GH、HH型，含3個(gè)突變位點(diǎn)，分別位于第1091、 1096、1784位點(diǎn)，均為同義突變位點(diǎn)；(3)進(jìn)行綿羊支原體肺炎EILSA抗體水平檢測，以外顯子1的多態(tài)性分析為基礎(chǔ)， 對同一基因型綿羊支原體肺炎陰性和陽性不同個(gè)體進(jìn)行差異顯著性分析，篩選出綿羊支原體肺炎抗性基因型和易感性基因型；(4)以外顯子1的多態(tài)性分析為基礎(chǔ)，篩選出中國美利奴羊四種不同MBL基因型， 即BB型、BC型、CC型和DD型各9只，建立供試群體，EILSA檢測群體MBL水平，結(jié)果顯示 CC型MBL血清水平最高，BB、BC次之，DD型MBL血清水平最低，預(yù)測CC型為抗性組，DD型為易感組，人工感染綿羊肺炎支原體，結(jié)果抗性組中發(fā)病2只，未發(fā)病7只；易感組中發(fā)病7 只，未發(fā)病2只，對照組均未發(fā)病，BC組中發(fā)病5只，未發(fā)病5只；BB組中發(fā)病5只，未發(fā)病 4只，表明抗性組綿羊支原體肺炎的感染率顯著低于易感組；材料和方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)九師某羊場，隨機(jī)采集血樣105只，所采血樣提取基因組DNA，引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)利用 Primer premier5. 0 軟件，參照 Genbank 中的綿羊 MBL 基因序列(Accession No. FJ977629)設(shè)計(jì)2個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子如下引物(表1)，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。表1 MBL基因外顯子和內(nèi)含子引物序列信息Table 1 Primer sequences Information of MBL exon and intron Gene
權(quán)利要求
1. 一種綿羊支原體肺炎抗性基因型的篩選方法，其特征是綿羊支原體肺炎抗性基因的多態(tài)性分析及提取篩選，具體篩選包括以下方法(1)樣品采集和綿羊基因組DNA的提?。?2)對MBL外顯子1和4、內(nèi)含子1和2逐段進(jìn)行多態(tài)性分析，設(shè)計(jì)了7對引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，篩選出與MBL水平相關(guān)的基因型21種，其中外顯子1上有4種基因型，即AA、BB、CC 和BC型，含5個(gè)突變位點(diǎn)，分別位于第27、41、43、83、105位點(diǎn)，其中g(shù). 27T > C ^P gl05C > T 為同義突變，g41T > A、Vall4 Glu，g43G > A、Vall5 Met, g83A > G,Glu28 Gly3 處為錯(cuò)義突變；外顯子4上有3種基因型，即GG、GH和HH型，含5個(gè)突變位點(diǎn)，分別位于第3235、 3243,3257,3331,3334 位點(diǎn)，其中 g. 3235T > C, g. 3331C > T, g. 3334C > T 為同義突變， g. 3243A > G、Glu 181 Gly, g. 3257G > A、Gly 186 Ser,2 處為錯(cuò)義突變；內(nèi)含子 1 上有 3 種基因型，含AA、BB、AB型，1個(gè)突變位點(diǎn)，位于第288位點(diǎn)；內(nèi)含子2上有11種基因型，包括 PP> OP、CC、CD、DD、EE、EF、FF、GG、GH、HH 型，含 3 個(gè)突變位點(diǎn)，分別位于第 1091、1096、1784 位點(diǎn)，均為同義突變位點(diǎn)；(3)進(jìn)行綿羊支原體肺炎EILSA抗體水平檢測，以外顯子1的多態(tài)性分析為基礎(chǔ)，對同一基因型綿羊支原體肺炎陰性和陽性不同個(gè)體進(jìn)行差異顯著性分析，篩選出綿羊支原體肺炎抗性基因型和易感性基因型；(4)以外顯子1的多態(tài)性分析為基礎(chǔ)，篩選出中國美利奴羊四種不同MBL基因型，即BB 型、BC型、CC型和DD型各9只，建立供試群體，EILSA檢測群體MBL水平，結(jié)果顯示CC型 MBL血清水平最高，BB,BC次之，DD型MBL血清水平最低，預(yù)測CC型為抗性組，DD型為易感組，人工感染綿羊肺炎支原體，結(jié)果抗性組中發(fā)病2只，未發(fā)病7只；易感組中發(fā)病7只，未發(fā)病2只，對照組均未發(fā)病，BC組中發(fā)病5只，未發(fā)病5只；BB組中發(fā)病5只，未發(fā)病4只， 表明抗性組綿羊支原體肺炎的感染率顯著低于易感組。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體說是涉及一種綿羊支原體肺炎抗性基因型的篩選方法，本發(fā)明從補(bǔ)體角度入手，通過對綿羊自身MBL基因的研究，研究發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性與綿羊支原體的抗性緊密相關(guān)，預(yù)測MBL基因?yàn)榫d羊支原體肺炎抗性性狀的候選基因，可作為選育高抗性綿羊的分子標(biāo)記，并能快速、準(zhǔn)確地建立抗綿羊支原體肺炎新品系，同時(shí)，本發(fā)明也可為該疾病的治療提供新的思路，MBL作為廣泛參與多種疾病免疫途徑的重要因素，該發(fā)明為其它疾病研究提供借鑒，對合理開發(fā)利用新疆地方綿羊品種遺傳資源以及引進(jìn)新品種具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，為進(jìn)一步選育綿羊支原體肺炎抗性基因型個(gè)體奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102277425SQ20111020609
公開日2011年12月14日 申請日期2011年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月22日
發(fā)明者余鵬, 劉賢俠, 張慧, 張紅梅, 王建梅, 賈斌, 趙鳳, 趙宗勝 申請人:趙宗勝