專利名稱：一種應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物土壤微生態(tài)安全性評(píng)價(jià)的Biolog ECO微平板技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物土壤微生態(tài)安全性評(píng)價(jià)的Biolog ECO微平板技術(shù)，屬轉(zhuǎn)基因生物安全性評(píng)估和微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自1983年世界上首例轉(zhuǎn)基因植物獲得成功以來(lái)，利用基因工程對(duì)農(nóng)作物進(jìn)行改良和優(yōu)化后在提高產(chǎn)量、改善農(nóng)產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)成分、縮短育種周期、增強(qiáng)抗病蟲性等方面均取得了巨大成就。許多轉(zhuǎn)基因作物如玉米、棉花、大豆等已經(jīng)進(jìn)入了商業(yè)化生產(chǎn)。然而這些轉(zhuǎn)入了外源基因的作物是否會(huì)給人們帶來(lái)不可預(yù)料的風(fēng)險(xiǎn)卻備受爭(zhēng)議，轉(zhuǎn)基因作物的安全問(wèn)題也是目前國(guó)際社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)。土壤是生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化的重要場(chǎng)所，土壤微生物既是土壤有機(jī)物質(zhì)轉(zhuǎn)化的執(zhí)行者，又是影響植物營(yíng)養(yǎng)元素活性的重要因素，土壤微生物多樣性與活性的保持是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)健康、穩(wěn)定的基礎(chǔ)。土壤微生物群落功能多樣性是描述土壤微生物群落特征的一個(gè)重要指標(biāo)，可以反映土壤狀況的重要信息。因此，開展轉(zhuǎn)基因植物對(duì)土壤微生物群落功能影響的研究對(duì)于科學(xué)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因植物的潛在風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。目前研究土壤微生物群落功能主要通過(guò)兩種方式一種是通過(guò)研究土壤酶活性變化來(lái)探討微生物群落功能的變化；另一種是基于“碳源利用水平”的代謝指紋法來(lái)研究微生物群落功能。Biolog ECO微平板就是通過(guò)微生物對(duì)單一碳源的利用情況來(lái)了解其微生物的動(dòng)態(tài)，微生物對(duì)碳源的利用能力是表征土壤微生物生長(zhǎng)情況的主要指標(biāo)，可用于估價(jià)土壤微生物群落代謝多樣性和功能多樣性的研究。Biolog ECO微平板方法由于操作簡(jiǎn)便，培養(yǎng)周期短，得到了研究者的青睞，是研究微生物代謝特征的主流方法之一，與DGGE、PLFA等分子手段互為補(bǔ)充、相互印證，被用于評(píng)估植物對(duì)重金屬污染土壤、養(yǎng)殖場(chǎng)土壤、曝氣廢水處理反應(yīng)器的修復(fù)效果、長(zhǎng)期施肥等農(nóng)田管理措施對(duì)土壤微生物的影響等。然而應(yīng)用此技術(shù)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因作物對(duì)根際土壤微生物群落功能影響的研究較為匱乏，急需建立完善相關(guān)技術(shù)體系。蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt)是一種分布廣泛的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，在其芽孢形成過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生Bt殺蟲晶體蛋白，該Bt殺蟲毒蛋白又可分為α外毒素、β外毒素、S內(nèi)毒素和虱因子，其中用于轉(zhuǎn)基因作物的主要是δ內(nèi)毒素。δ內(nèi)毒素被靶標(biāo)昆蟲取食后，在中腸的堿性和還原性環(huán)境中降解為60kD左右的活性肽，并與昆蟲中腸上皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，引起細(xì)胞膜穿孔，破壞細(xì)胞滲透平衡，致使細(xì)胞腫脹破裂， 最終導(dǎo)致昆蟲癱瘓或死亡。由于Bt毒蛋白對(duì)敏感害蟲專一性強(qiáng)、效果好，且對(duì)人畜安全，因此Bt基因是目前轉(zhuǎn)基因作物研究中應(yīng)用最廣泛的抗蟲基因。因此，建立一種適用于評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)Bt基因作物對(duì)根際土壤微生物群落功能影響的 Biolog ECO微平板技術(shù)，對(duì)于完善轉(zhuǎn)基因作物土壤生態(tài)安全評(píng)價(jià)技術(shù)體系尤其至關(guān)重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物土壤微生態(tài)安全性評(píng)價(jià)的Biolog ECO微平板技術(shù)，特別是提供一種快捷、敏感地評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)Bt基因植物對(duì)根際土壤微生物群落功能影響的研究方法，以解決傳統(tǒng)方法工作量繁重、誤差大、不全面等問(wèn)題， 從而將Biolog ECO微平板技術(shù)成功應(yīng)用于轉(zhuǎn)Bt基因作物對(duì)根際土壤微生態(tài)安全性評(píng)價(jià)中。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明所述的應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物土壤微生態(tài)安全性評(píng)價(jià)的Biolog ECO微平板技術(shù)，其工藝流程如

圖1所示，具體包括以下步驟1)收集不同生育期的轉(zhuǎn)基因作物、非轉(zhuǎn)基因親本作物根際土壤樣品；2)進(jìn)行 Biolog ECO 實(shí)驗(yàn)；3)平均吸光度(AWCD)及多樣性指數(shù)的計(jì)算；4)主成分(PCA)分析。其中，上述方法中，所述的生育期包括苗期、分蘗期、拔節(jié)期、抽穗期、成熟期。所述的轉(zhuǎn)基因作物優(yōu)選轉(zhuǎn)Bt基因作物，如轉(zhuǎn)Bt基因水稻、轉(zhuǎn)Bt基因棉花。所述的根際土壤樣品的收集為稱取根際土樣(分別為轉(zhuǎn)基因作物或非轉(zhuǎn)基因親本作物的根際土壤)，放入無(wú)菌水中，二者比例為1 99 (g/ml)，室溫下在搖床上中速振蕩，-20°C保存。所述的Biolog ECO實(shí)驗(yàn)步驟為將得到的根際土壤樣品溶液從冰箱中取出，進(jìn)行 1000倍稀釋，接種到Biolog ECO微平板，然后放入保濕的無(wú)菌塑料容器中恒溫培養(yǎng)； 分別在培養(yǎng)對(duì)11、4811、7211、9611、12011、14411，測(cè)定波長(zhǎng)為590nm時(shí)，對(duì)該微平板進(jìn)行讀數(shù)。本發(fā)明采用平均吸光度(AWCD)來(lái)描述微生物代謝強(qiáng)度，其計(jì)算公式如下AWCD = [Σ (Ci-R)]/31其中，Ci是除對(duì)照孔外各孔的吸光度值，R是對(duì)照孔的吸光度值。AWCD值可用以衡量微生物利用不同碳源的整體能力，通過(guò)對(duì)一系列讀數(shù)時(shí)間的 AffCD值變化趨勢(shì)的差異來(lái)分析樣品間微生物群落代謝功能的不同。由于AWCD值隨時(shí)間變化的趨勢(shì)線具有直觀可見的特點(diǎn)，這樣更易于發(fā)現(xiàn)樣品間碳源利用能力的差異。本發(fā)明所述的多樣性指數(shù)包括Siannon多樣性指數(shù)(H' )、Simpson指數(shù)⑶、 Mcintosh多樣性指數(shù)(U)，以及Siarmon均勻度和Mchtosh均勻度，它們的計(jì)算公式分別如下H' = - Σ PilnPiD=I-E Pi權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物根際土壤微生態(tài)安全性評(píng)價(jià)的Biolog ECO微平板技術(shù)，包括以下步驟(1)收集不同生育期的轉(zhuǎn)基因作物、非轉(zhuǎn)基因親本作物根際土壤樣品；(2)進(jìn)行Biolog ECO 實(shí)驗(yàn)；(3)平均吸光度AWCD及多樣性指數(shù)的計(jì)算；(4)主成分PCA分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微平板技術(shù)，其特征在于，所述的生育期包括苗期、分蘗期、 拔節(jié)期、抽穗期、成熟期。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微平板技術(shù)，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)基因作物優(yōu)選轉(zhuǎn)Bt基因作物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微平板技術(shù)，其特征在于，所述根際土壤樣品的收集如下稱取轉(zhuǎn)基因作物或非轉(zhuǎn)基因根際土樣，放入無(wú)菌水中，二者比例為1 99(g/ml)，室溫下在搖床上中速振蕩，-20°C保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微平板技術(shù)，其特征在于，所述的BiologECO實(shí)驗(yàn)步驟為 將得到的根際土壤樣品溶液從冰箱中取出，進(jìn)行1000倍稀釋，接種到Biolog ECO微平板， 然后放入保濕的無(wú)菌塑料容器中恒溫培養(yǎng)；分別培養(yǎng)Mh、48h、72h、96h、120h、144h， 然后在測(cè)定波長(zhǎng)為590nm下，對(duì)該微平板進(jìn)行讀數(shù)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微平板技術(shù)，其特征在于，所述的多樣性指數(shù)包括aiarmon多樣性指數(shù)H'、Simpson指數(shù)D、Mcintosh多樣性指數(shù)U,以及Shannon均勻度和Mcintosh 均勻度。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微平板技術(shù)，其特征在于，所述的主成分PCA是指BiologECO 微平板中的31種碳源，分別為胺類、氨基酸、糖類、羧酸類、聚合物類。
8.權(quán)利要求1 7任一項(xiàng)所述的BiologECO微平板技術(shù)在轉(zhuǎn)基因作物根際土壤微生態(tài)安全性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物根際土壤微生態(tài)安全性評(píng)價(jià)的Biolog ECO微平板技術(shù)，包括以下步驟1)收集不同生育期的轉(zhuǎn)基因作物、非轉(zhuǎn)基因親本作物根際土壤樣品；2)進(jìn)行Biolog ECO實(shí)驗(yàn)；3)平均吸光度AWCD及多樣性指數(shù)的計(jì)算；4)主成分PCA分析。本發(fā)明技術(shù)可用于評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因作物對(duì)根際土壤微生物群落功能的影響，并由此評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因作物對(duì)根際土壤微生態(tài)系統(tǒng)的潛在安全風(fēng)險(xiǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102251016SQ20111020624
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月22日
發(fā)明者唐雪明, 朱宏, 王金斌, 程凱, 趙凱, 魏曼曼 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院