專利名稱：水體環(huán)境中銅綠微囊藻噬藻體的SYBR-Green熒光定量RT-PCR檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用STOR-Green熒光定量RT-PCR技術(shù)對水體環(huán)境中銅綠微囊藻噬藻體進(jìn)行定量檢測和分析的方法，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
藍(lán)藻是一類原核光合自養(yǎng)生物，具有細(xì)菌的一些特征，因此又稱為藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)。感染藍(lán)藻的病毒稱為噬藻體(Cyanophage)，這是由于噬藻體與噬菌體非常相似的緣故。藍(lán)藻是水華暴發(fā)的主要原因。近年來，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人類活動的增加以及水體富營養(yǎng)化程度的提高，藍(lán)藻“水華”的發(fā)生日益嚴(yán)重。噬藻體在海洋與淡水中都大量存在，并且藍(lán)藻水華消退前后其含量有十分明顯的變化，噬藻體作為藍(lán)藻“水華”潛在的特異性生物控制因子，影響水體初級生產(chǎn)力的生產(chǎn)，其重要性逐漸為人們所認(rèn)知。因此噬藻體可能是控制藍(lán)藻水華生消的重要生態(tài)因子。噬藻體作為藍(lán)藻的致死劑、基因信息載體及群落結(jié)構(gòu)的調(diào)解者，廣泛存在于海洋和淡水生態(tài)系統(tǒng)中。其海水表層水中的含量能達(dá)到細(xì)菌數(shù)量的10倍以上。海洋中感染聚球藻的噬藻體對聚球藻的日致死率最高能達(dá)到對％。因此，噬藻體對初級生產(chǎn)力有著不可忽視的影響。因其對細(xì)菌與藍(lán)藻宿主的高致死率，藻類病毒在自然水體中對微藻密度具有顯著的調(diào)節(jié)作用，也使得噬藻體成為水華治理過程中的“明星”。研究發(fā)現(xiàn)，通常情況下藍(lán)藻水華過程中含有大量的病毒粒子，噬藻體的增殖會裂解水華藍(lán)藻，從而導(dǎo)致宿主藍(lán)藻死亡，一方面藍(lán)藻數(shù)量變化造成噬藻體數(shù)量變化，另一方面，噬藻體對水華藍(lán)藻的死亡有促進(jìn)作用，噬藻體與藻類的數(shù)量總是保持季節(jié)性的平行關(guān)系。在發(fā)生水華的水體中，銅綠微囊藻是形成水華的優(yōu)勢種之一。自上世紀(jì)90年代，人們發(fā)現(xiàn)噬藻體豐富存在于海洋中，并且其在水生態(tài)系統(tǒng)中具有重要作用。由于各種現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)技術(shù)的運(yùn)用，現(xiàn)今在噬藻體的生態(tài)，分子生物學(xué)以及與藍(lán)藻水華關(guān)系的研究上已取得一些階段性成果。但是有待解決的問題也很多，比如噬藻體數(shù)量及其時(shí)空分布、分子進(jìn)化與遺傳多樣性、噬藻體的生物學(xué)功能基因(特別是感染和裂解宿主的功能)等等。未來將著重利用分子生物學(xué)方法對噬藻體分布、豐度和遺傳多樣性、與宿主在分子水平上存在何種依存或制約關(guān)系、對初級生產(chǎn)力和水華的種群結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)作用以及實(shí)時(shí)定量檢測的研究，并將噬藻體作為防治藍(lán)藻類水華的有效生物調(diào)控因子加以利用。在加強(qiáng)噬藻體各方面基礎(chǔ)研究的同時(shí)，著重研究其在水華形成與消退過程中所起的作用。最初，噬藻體分子生物學(xué)的研究對象主要局限于海洋噬藻體，研究深度局限于利用衣殼組裝蛋白基因進(jìn)行病毒檢測、生態(tài)分布和遺傳多樣性分析。近來對淡水噬藻體的研究也得到了其應(yīng)有的重視，一些現(xiàn)代的研究技術(shù)也被運(yùn)用到噬藻體的研究當(dāng)中。但研究噬藻體實(shí)時(shí)數(shù)量變化的方法還不多
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明以云南滇池為研究對象，通過STOR-Green熒光定量PCR技術(shù)，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增銅綠微囊藻噬藻體尾鞘蛋白基因(g91)的定量PCR引物，現(xiàn)有研究主要是通過普通PCR定性研究，本發(fā)明基于STOR-Green定量PCR定量檢測噬藻體的方法，從噬藻體分子生物學(xué)層面，對待檢水體中噬藻體數(shù)量及其時(shí)空分布、分子進(jìn)化與遺傳多樣性、噬藻體的生物學(xué)功能基因(特別是感染和裂解宿主的功能)進(jìn)行研究且有重要作用，從而將噬藻體作為防治藍(lán)藻類水華的有效生物調(diào)控因子加以利用。水體環(huán)境中噬藻體的熒光定量PCR檢測方法，包括基于銅綠微囊藻噬藻體Ma-LMMOl的g91基因片段，設(shè)計(jì)得到定量PCR外參標(biāo)準(zhǔn)品引物SH-WF和SH-WR，定量PCR引物SH-RTF和SH-RTR ；提取待檢水樣濃縮液中噬藻體DNA基因片段；利用引物對該基因片段進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增；對定量PCR結(jié)果進(jìn)行分析。特異性擴(kuò)增銅綠微囊藻噬藻體g91基因寡聚核苷酸的定量外參標(biāo)準(zhǔn)品引物SH-WF/ SH-WR 和定量 PCR 引物 SH-RTF/SH-RTR 如下
SH-WF :5’ -CTACCAGTGGCCGATATTTCCTT-3’SH-WR :5’ -GGTAAAGCCTCTATTAGCAGTGTTG-3’SH-RTF :5’ -ACATCAGCGTTCGTTTCGG-3’SH-RTR :5’ -GTGACAATCTGGTTAGGTAGGTCG-3’
利用定量PCR外參標(biāo)準(zhǔn)品引物SH-WF和SH-WR擴(kuò)增g91基因得到熒光定量的外參標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量PCR引物SH-RTF和SH-RTF擴(kuò)增g91基因，根據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析待測水樣中噬藻體的數(shù)量。本發(fā)明是通過下述的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的
(1)基于銅綠微囊藻噬藻體Ma-LMMOl的g91基因片段，利用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)定量外參標(biāo)準(zhǔn)品引物SH-WF/ SH-WR和定量PCR引物SH-RTF/SH-RTR SH-WF :5’ -CTACCAGTGGCCGATATTTCCTT-3’SH-WR :5’ -GGTAAAGCCTCTATTAGCAGTGTTG-3’SH-RTF :5’ -ACATCAGCGTTCGTTTCGG-3’SH-RTR :5’ -GTGACAATCTGGTTAGGTAGGTCG-3’ ；
(2)提取待檢水樣濃縮液中噬藻體DNA基因片段；
(3)用定量外參標(biāo)準(zhǔn)品引物SH-WF:5，-CTACCAGTGGCCGATATTTCCTT-3，和 SH-WR5，-GGTAAAGCCTCTATTAGCAGTGTTG-3 ’擴(kuò)增并構(gòu)建銅綠微囊藻噬藻體g91基因定量檢測的外參標(biāo)準(zhǔn)品，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品Ct值，得到g91基因定量標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(4)用定量PCR 引物 SH-RTF :5’ -ACATCAGCGTTCGTTTCGG-3，禾口
SH-RTR :5，-GTGACAATCTGGTTAGGTAGGTCG-3，擴(kuò)增待測樣品中銅綠微囊藻噬藻體g91基因序列，將所測樣品的Ct值與g91基因定量標(biāo)準(zhǔn)曲線對比得到檢測水樣中噬藻體g91基因拷貝數(shù)。本發(fā)明基于STOR-Green定量PCR定量檢測噬藻體的方法，從噬藻體分子生物學(xué)層面，對待檢水體中噬藻體數(shù)量及其時(shí)空分布、分子進(jìn)化與遺傳多樣性、噬藻體的生物學(xué)功能基因(特別是感染和裂解宿主的功能)研究有重要作用，從而將噬藻體作為防治藍(lán)藻類水華的有效生物調(diào)控因子加以利用。


圖 1 為 SH-WF/SH-WR PCR 反應(yīng)程序圖2為SH-RTF/SH-RTR反應(yīng)程序
圖3為g91基因定量標(biāo)準(zhǔn)品線性關(guān)系，即外參標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)外參引物擴(kuò)增得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖中所有標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值基本在一條直線上，沒有任何一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)偏差，R2達(dá)到0. 998。圖4為g91基因定量標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線，1 XlO7Copies/μ L到1 X IO4Copies/μ L銅綠微囊藻噬藻體g91基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的變化趨勢，顯示為一組斜率相同，間距相等的平行曲線。圖5為g91基因定量產(chǎn)物熔解曲線，除陰性對照(水)外，其他標(biāo)準(zhǔn)品的熔點(diǎn)峰都在86°C左右，曲線平穩(wěn)，出峰尖窄。陰性對照PCR從65 ！到90 °C沒有出現(xiàn)任何波動，熔點(diǎn)曲線為一條直線。圖6為滇池全湖范圍水樣g91基因拷貝數(shù)隨地點(diǎn)的變化情況圖(由北向南)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖，用本發(fā)明的實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但不以來限定本發(fā)明。實(shí)施例1
下列方法中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人的分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)或彭秀玲等人的基因工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)(科學(xué)技術(shù)出版社)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。噬藻體的基因序列來自分子生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(NCBI )。1. PCR引物設(shè)計(jì)
根據(jù)文獻(xiàn)并結(jié)合Genebank中的BALST序列比對結(jié)果，參考銅綠微囊藻噬藻體Ma-LMMOl的尾鞘蛋白編碼基因(g91)，NCBI序列號為AB242^1，利用Primer Premier 5. O和01igo6軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)得到定量PCR外參標(biāo)準(zhǔn)品引物SH-WF和SH-WR，定量引物SH-RTF和SH-RTF (表1)，設(shè)計(jì)好的引物由上海生工生物有限公司合成。表1.銅綠微藻噬藻體定量檢測PCR引物2.噬藻體DNA的提取
(1).采集滇池的水樣依次經(jīng)紗布、0. 45um和0. 22um纖維濾膜過濾后置于4°C，黑暗條件下保存。
(2).水樣過濾液以1. 5ml每管分裝在1. 5ml的EP管(印pendorf tube)中，經(jīng)冷凍干燥真空抽濾儀進(jìn)行冷凍干燥，收集EP管底部水樣過濾液的濃縮液至一新的EP管中，每管為250ul，并計(jì)算濃縮倍數(shù)。(3).使用上海華舜生物工程有限公司生產(chǎn)的小量病毒RNA/DNA抽提試劑盒完成水樣過濾濃縮液中核酸的提取。具體操作步驟如下
a.在裝有250ul水樣過濾濃縮液的EP管中加入500ul裂解液RV，蓋上蓋子，高速振蕩2分鐘后，置于室溫靜置5分鐘。b.加入750ul異丙醇，顛倒EP管以混勻。c.移取750ul至吸附柱，于室溫、9，OOOg條件下離心15秒，倒掉收集管中的液體。d.將吸附柱移入同一個(gè)收集管中，將剩余的裂解物移入吸附柱中，于室溫、9，OOOg條件下離心15秒后，倒掉收集管中的液體，再將吸附柱移入同一個(gè)收集管中，于室溫、9，OOOg條件下再離心15秒。e.加入500ul緩沖液RP，于室溫、9，OOOg條件下離心30秒后將吸附柱移入一個(gè)干
凈的收集管中。f.加入500ul洗脫液W3，靜置1分鐘后，于室溫、9，OOOg條件下離心15秒后倒掉收集管中的液體，再將吸附柱移入同一個(gè)收集管中。g.加入500ul W3液，于室溫、9，OOOg條件下離心15秒，倒掉收集管中的液體后將吸附柱移入同一個(gè)收集管中。h.于室溫、9，OOOg條件下再離心1分鐘。i.將吸附柱放入一個(gè)干凈的1. 5ml的EP管中，在吸附膜中央加入30ul純水，室溫靜置3分鐘后，于室溫、9，OOOg條件下再離心3分鐘。j.用上一步的洗脫液再洗脫一次，提取所得的核酸產(chǎn)物儲存于_80°C，待用。3.定量標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)物的PCR擴(kuò)增
使用TaKaRa公司生產(chǎn)的I^remix Taq PCR反應(yīng)液進(jìn)行PCR擴(kuò)增銅綠微囊藻噬藻體g91基因上491bp序列構(gòu)建銅綠微囊藻噬藻體定量PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)品。反應(yīng)條件和程序設(shè)置如表2和圖1。
表2 SH-WF/SH-WR PCR反應(yīng)條件
材料體積2XPremixTaq(TaKaRa)12. 5μ 1SH-WFPrimer(10u M)0. 5μ 1SH-WRPrimer(10 μ M)0. 5μ 1Template(sample)2. 0μ 1RnaseFreedH2O9. 5μ 1總計(jì)25 μ 1
4. PCR產(chǎn)物檢測和純化
PCR擴(kuò)增所得的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(1).將1.5%瓊脂糖凝膠加熱溶化均勻，冷卻到60-70°C加EB至濃度0. 5 μ g/ml ； (2).倒入封好的凝膠槽，厚度約3_5mm，在距底板0. 5 lmm的位置放置樣品梳；C3).待冷卻成形后取出梳子及隔板，放入水平電泳槽中，緩沖液淹沒過膠2mm位置；(4). IOul SH-ffF/SH-ffR PCR產(chǎn)物加1/5體積的上樣緩沖液，混勻，取10 μ 1加入凝膠點(diǎn)樣孔中，同時(shí)加入分子量標(biāo)準(zhǔn)物Trans2K 4 μ 1 ； (5).電壓< lOV/cm，電泳至溴酚蘭移出樣品槽到凝膠板的2/3距離時(shí)，關(guān)閉電源；(6).取出凝膠塊，置紫外-可見凝膠成像系統(tǒng)(HoeferMacrovueUvis-20)上觀察，即可見桔紅的DNA區(qū)帶，并拍照。
PCR產(chǎn)物純化使用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒SK1132 (Sangon)完成。具體操作過程嚴(yán)格遵照試劑盒說明進(jìn)行(1).配制瓊脂糖凝膠，將上述PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣，80伏電壓電泳25分鐘；(2).紫外燈下切下含有目的DNA瓊脂糖膠塊，放入新的1.5ml EP管中；(3).加入500ul結(jié)合緩沖液Binding Buffer,置于50 60°C水浴中10分鐘，使膠徹底融化；(4).將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移到套放于收集管內(nèi)的純化柱中，室溫放置2分鐘后SOOOrpm離心1分鐘；( .取下純化柱，倒掉收集管中的廢液，將純化柱放入同一個(gè)收集管中，加入500 μ 1 Wash Solution (洗液)后，8000rpm室溫離心1分鐘；(6).重復(fù)步驟円|一次。(7).取下純化柱，倒掉收集管中的廢液，將純化柱放入同一個(gè)收集管中，12，OOOrpm室溫離心15秒；(8).將純化柱放入一個(gè)新的1.5ml EP管中，在柱子膜中央加入30 μ 1洗脫緩沖液Elution Buffer 在 37°C放置 5-10 分鐘；(9). 12，OOOrpm 室溫離心 1 分鐘，將 30 μ 1 DNA 溶液吸入純化柱中心膜上12，OOOrpm室溫離心2分鐘，于4°C保存待與質(zhì)粒連接。5. g91基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建1).受體菌的培養(yǎng)
本發(fā)明所用克隆載體為PMD18-T Vector (TaKaRa)，受體菌為萬.co/i JM109 (公司購買，ftOmegEi，USA)。從LB平板上挑取新活化的五coli J1109單菌落，接種于3_5ml LB液體培養(yǎng)基中，37°C下振蕩培養(yǎng)12小時(shí)左右，直至對數(shù)生長后期。將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)至OD600 = 0 . 5左右。2).感受態(tài)細(xì)胞的制備(CaCl2法)
a.將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中，冰上放置10分鐘，然后于4°C下3000g離心10分鐘；b.棄去上清，用預(yù)冷的0. 05mol/L的CaCl2溶液IOml輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置15-30分鐘后，4°C下3000g離心10分鐘；c.棄去上清，加入細(xì)1預(yù)冷含15%甘油的0. 05mol/L的CaCl2溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置幾分鐘，即成感受態(tài)細(xì)胞懸液；d.感受態(tài)細(xì)胞分裝成200 μ 1的小份，部分貯存于4°C以供近期使用，部分貯存于-70°C以供較長時(shí)期內(nèi)使用。3).純化PCR產(chǎn)物的連接
使用PMD18-T Vector (TaKaRa)與純化的SH-WF/SH-WR PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)，先用0. 2 ml PCR管將1. 0 μ 1 pMD18_T Vector和4· 0 μ 1 PCR純化產(chǎn)物混合均勻，再加入5 μ 1Solution I (溶解液I)混合均勻，16°C連接過夜。4).連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
a.取200 μ 1感受態(tài)細(xì)胞懸液，室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上；b.加入10 μ 1連接反應(yīng)液輕輕搖勻，冰上放置30分鐘后；c.42°C水浴中熱擊60秒，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘；d.向管中加入Iml SOC培養(yǎng)液(不含氨芐青霉素Amp)，混勻后37°C振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr) ； e.將上述菌液搖勻后取100 μ 1涂布于含Amp的篩選平板上，正面向上放置半小時(shí)，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37°C培養(yǎng)16- 小時(shí)。同時(shí)做兩個(gè)對照對照組1:以同體積的無菌雙蒸水代替d步驟中的菌液，其它操作與上面相同，此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應(yīng)沒有菌落出現(xiàn)；對照組2:以同體積的無菌雙蒸水代替d步驟中的菌液，但涂板時(shí)只取5μ 1菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應(yīng)產(chǎn)生大量菌落。5).陽性重組子的篩選和鑒定
a.挑取在Amp+選擇培養(yǎng)基上長出的菌落若干(4-6個(gè)/樣品)，置于Iml含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C振蕩培養(yǎng)，并設(shè)置一個(gè)陰性對照，即挑取空菌落加入含Amp的ImlLB液體培養(yǎng)基中；b.待菌液有渾濁之后取2ul菌液利用引物進(jìn)行陽性重組子的菌落PCR快速鑒定，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。6).陽性重組質(zhì)粒的提取
使用質(zhì)粒提取試劑盒Rapid Plasmid DNA Daily Mini-Prep Kit(V-gene)完成陽性重組質(zhì)粒的提取，具體步驟如下ill.取擴(kuò)大培養(yǎng)M小時(shí)的1 細(xì)1重組質(zhì)粒菌液PCR陽性菌液，12，OOOrpm離心2分鐘，棄上清。(2) ·用250 μ 1的Solution I (溶解液I)(含RNaseAl)充分懸浮細(xì)菌沉淀。131 .加入250 μ 1的Solution II (溶解液II)輕輕地上下翻轉(zhuǎn)混合5 6次，使菌體充分裂解，形成透明液體。f4].加入400 μ 1的4°C預(yù)冷的SolutionIII (溶解液III))，輕輕地上下翻轉(zhuǎn)混合5 6次，直至形成緊實(shí)凝集塊，然后室溫靜置2分鐘。舊室溫12，OOOrpm離心5分鐘，取上清。IH.將試劑盒中的離心柱安置于收集管上。丨 ).將上述操作四中上清液轉(zhuǎn)移至離心柱中12，OOOrpm離心1分鐘，棄濾液。[8].將500 μ 1 Rinse A加入離心柱中，12，OOOrpm離心30秒，棄濾液。(9}.將700 μ 1 Rinse B加入離心柱Spin Column中，12，OOOrpm離心30秒，棄濾液。IlUl .重復(fù)操作步驟(9)。(II).將離心柱Spin Column安置于新的1.5ml的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入60 μ 1的Elution Buffer,室溫靜置1分鐘。(123 · 12, OOOrpm離心1分鐘洗脫重組質(zhì)粒DNA,重復(fù)一次。7).質(zhì)?？截悢?shù)的確定拷貝數(shù)的計(jì)算
a.將純化好的質(zhì)粒100倍稀釋測量OD值，吸取2 μ 1純化質(zhì)粒，加入198 μ 1的雙蒸水混合均勻，測量其OD值，OD260為0. 004。b.克隆質(zhì)粒核苷酸片段長度計(jì)算公式
M (bp) =原質(zhì)粒片段長度(bp) +插入片段長度(bp)克隆質(zhì)粒分子量的計(jì)算X (MW)
lbp=330daltons ； X (MW) = M (bp) X330daltonsX2nt/bp質(zhì)量濃度=0擬60 X 50 μ g/ml X稀釋倍數(shù)(lbp=50 μ g/ml)摩爾濃度=質(zhì)量濃度/ X (MW)
拷貝數(shù)/ μ 1=摩爾濃度X 6. 02 X 1023 (阿佛加德羅常數(shù))8).質(zhì)粒DNA梯度稀釋
將已知拷貝數(shù)的重組陽性質(zhì)粒用DEPC水(焦碳酸二乙酯水)按照10倍梯度稀釋關(guān)系，g91 基因從 1 X IO8Copies/ μ LUX IO7Copies/ μ LUX IO6Copies/ μ LUX IO5Copies/ μ L、1 X IO4Copies/ μ L拷貝數(shù)濃度用DEPC水進(jìn)行10倍系列稀釋，得到不同分子含量的PMD-18TCD81陽性質(zhì)粒濃度樣品，保存于-80°C作為銅綠微囊藻噬藻體定量檢測的外參標(biāo)準(zhǔn)品，在熒光定量PCR時(shí)，需要檢測的樣品與外參標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，從而得出要檢測的樣品的拷貝數(shù)。6.定量PCR反應(yīng)條件
使用TaKaRa (寶生物工程公司)的STOR Premix Ex Taq定量PCR反應(yīng)液，在熒光定量PCR儀ABI PRISM 7300 Real-Time PCR System測定定量標(biāo)準(zhǔn)曲線和產(chǎn)物融解曲線分析，從而得到樣品的拷貝數(shù)和熔解溫度。使用SH-RTF/SH-RTR引物特異擴(kuò)增銅綠微藻噬藻體尾鞘蛋白編碼基因(g91)上656bp到791bp之間的一段長為的DNA序列。結(jié)合引物本身特性和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定具體反應(yīng)條件和程序(見表3和圖2)。表3 SH-RTF/SH-RTR 反應(yīng)條件
權(quán)利要求
1.水體環(huán)境中銅綠微囊藻噬藻體的STOR-Green熒光定量RT-PCR檢測方法，包括下列步驟(1)基于銅綠微囊藻噬藻體Ma-LMMOl的g91基因片段，利用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)定量外參標(biāo)準(zhǔn)品引物SH-WF/ SH-WR和定量PCR引物SH-RTF/SH-RTR SH-WF :5’ -CTACCAGTGGCCGATATTTCCTT-3’SH-WR :5’ -GGTAAAGCCTCTATTAGCAGTGTTG-3’SH-RTF :5’ -ACATCAGCGTTCGTTTCGG-3’SH-RTR :5’ -GTGACAATCTGGTTAGGTAGGTCG-3’ ；(2)提取待檢水樣濃縮液中噬藻體DNA基因片段；(3)用定量外參標(biāo)準(zhǔn)品引物SH-WF:5，-CTACCAGTGGCCGATATTTCCTT-3，和 SH-WR5，-GGTAAAGCCTCTATTAGCAGTGTTG-3 ’擴(kuò)增并構(gòu)建銅綠微囊藻噬藻體g91基因定量檢測的外參標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品Ct值，得到g91基因定量標(biāo)準(zhǔn)曲線；(4)用定量PCR 引物 SH-RTF :5’ -ACATCAGCGTTCGTTTCGG-3，禾口SH-RTR :5，-GTGACAATCTGGTTAGGTAGGTCG-3，擴(kuò)增待測樣品中銅綠微囊藻噬藻體g91基因序列，將所測樣品的Ct值與g91基因定量標(biāo)準(zhǔn)曲線對比得到檢測水樣中噬藻體g91基因拷貝數(shù)量。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水體環(huán)境中銅綠微囊藻噬藻體的SYBR-Green熒光定量RT-PCR檢測方法，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明基于銅綠微囊藻噬藻體Ma-LMM01的尾鞘蛋白基因g91片段，利用Premier5.0和Oligo6軟件設(shè)計(jì)了定量PCR外參標(biāo)準(zhǔn)品引物SH-WF和SH-WR和定量PCR引物SH-RTF和SH-RTR，對水體環(huán)境中銅綠微囊藻噬藻體數(shù)量進(jìn)行檢測，旨在分析水體中銅綠微囊藻噬藻體的數(shù)量隨時(shí)間、空間變化規(guī)律。
文檔編號C12Q1/68GK102382901SQ20111020642
公開日2012年3月21日 申請日期2011年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月22日
發(fā)明者馮悅, 劉麗, 劉騰騰, 向安, 夏雪山, 魏大巧 申請人:昆明理工大學(xué)