專利名稱：一種發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀的方法及其培養(yǎng)基組份的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體為一種發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀的方法及其培養(yǎng)基組份。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及的發(fā)酵法生產(chǎn)的利普司他汀是新型減肥藥奧利司他的中間體。奧利司他目前是全球唯一的減肥類藥品，是長效和強效的特異性胃腸道脂肪酶抑制劑，它通過與胃和小腸腔內(nèi)胃脂肪酶和胰脂肪酶的活性絲氨酸部位形成共價鍵使酶失活而發(fā)揮治療作用，失活的酶不能將食物中的脂肪，主要是甘油三酯水解為可吸收的游離脂肪酸和單?；视汀Ｎ聪母视腿ゲ荒鼙簧眢w吸收，從而減少熱量攝入，控制體重。奧利司他的生產(chǎn)有兩種方法，發(fā)酵合成法以及全合成法。全合成法生產(chǎn)成本比較高。發(fā)酵合成法生產(chǎn)成本比較低，更適合大規(guī)模生產(chǎn)。美國專利US4598089、US2005089978A1涉及到的利普司他汀發(fā)酵工藝不采用流加補料以及中間補料的方法，發(fā)酵水平比較低。歐洲專利EP0S03576A2 以及國際專利 W02007134836AU WO 2007078263A2 涉及到的發(fā)酵工藝部分采用流加亞油酸和氨基酸的工藝，但是發(fā)酵水平比較低；歐洲專利 EP0803576發(fā)酵水平低于lg/L。國際專利W02004003212采用了不同的淀粉底物，發(fā)酵水平為1. 486g/L ；國際專利 W003048335 發(fā)酵水平為 1. 8g/L。

發(fā)明內(nèi)容
為解決現(xiàn)有技術(shù)中發(fā)酵水平低、不穩(wěn)定的問題，本發(fā)明提供了一種新的發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀的培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝控制方法和發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分。本發(fā)明的方法包括毒三素鏈霉菌(Sti^ptomyces toxytricini)或其衍生物的斜面菌種培養(yǎng)、搖瓶種子液培養(yǎng)、種子液培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)。所述毒三素鏈霉菌(Streptomyces toxytricini)可以是ACCC 41038。具體工藝過程如下a.斜面菌種的制備將凍干的菌種用無菌水稀釋后涂布裝有固體培養(yǎng)基的斜面上，溫度^°C，濕度40 60%，培養(yǎng)8 10天。產(chǎn)孢后加無菌水制成孢子懸浮液。b.搖瓶種子液制備將斜面孢子接種搖瓶種子培養(yǎng)基，250rpm，溫度^°C，培養(yǎng) 20 30小時。c.種子液的制備將步驟b中培養(yǎng)好的搖瓶種子接種到儲有種子培養(yǎng)基的種子罐中，接種量為種子培養(yǎng)基體積的0. 1 0. 8% (V/V)，在下通氣量0. 8VVM 1. OVVM，單位VVM是體積/體積/分鐘，罐壓0. 04 0. 07MPa的條件下，培養(yǎng)20 40小時。d.發(fā)酵培養(yǎng)將步驟c中培養(yǎng)好的菌種接種到儲有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中， 接種種子液的量占發(fā)酵培養(yǎng)基和種子液體積的5 10%作/力，在溫度為觀！，通氣量 0. 6VVM 1. 1VVM，罐壓0. 06 0. 08MPa,發(fā)酵過程中pH控制在6. 5 7. 5范圍內(nèi)，發(fā)酵過
3程中補入營養(yǎng)物質(zhì)，培養(yǎng)160 190小時。步驟a中所用培養(yǎng)基成分和含量為葡萄糖2 8g/L，麥芽提取物2 8g/L，酵母提取物4 10g/L，瓊脂10 20g/L，pH為6. 9 7. 4 ；步驟b中所用培養(yǎng)基成分和含量為 甘油10g/L，麥芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脫脂豆粉20g/L，pH為6. 0 6. 5 ；步驟c 中所用液體培養(yǎng)基成分和含量為甘油10g/L，麥芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脫脂豆粉20g/L，pH為6. 0 6. 5。步驟d中所用液體培養(yǎng)基成分和含量為甘油10 20g/L，脫脂豆粉20 40g/L，豆油10 20g/L，消泡劑2 5g/L，發(fā)酵初始pH為6. 7 7. 0。在步驟d發(fā)酵過程中，在接種后至30小時左右，即發(fā)酵培養(yǎng)基中的甘油消耗殆盡后，開始流加補料亞油酸和亮氨酸溶液(亮氨酸溶液濃度70g/L，pH為11)，補料流加速度為0. 2 0. 5g/L/h，單位g/L/h是克/升/小時，在發(fā)酵接種后至115h，補料速度進(jìn)行調(diào)整，補料流加速度為0. 2 0. 5g/L/h。同時，在發(fā)酵過程中，在接種后至70小時左右，一次性補入滅菌的酵母提取物以及甘油，使培養(yǎng)基中酵母提取物以及甘油基質(zhì)濃度在5 IOg/ L的水平。本發(fā)明發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基中使用脫脂豆粉為主要氮源，甘油和豆油為主要碳源， 發(fā)酵培養(yǎng)基中無須添加無機(jī)鹽。在發(fā)酵表達(dá)利普司他汀階段連續(xù)補料亞油酸和氨基酸的基礎(chǔ)上，在發(fā)酵的特定階段一次性補加一定量的甘油和酵母提取物，避免了現(xiàn)有技術(shù)中的高粘度、溶氧不好控制的情況，提高了發(fā)酵過程中表達(dá)的穩(wěn)定性，提高了發(fā)酵效價，降低了發(fā)酵成本。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明不僅限于以下實施例。實施例1斜面培養(yǎng)按如下比例配制培養(yǎng)基葡萄糖2g/L，麥芽提取物8g/L，酵母提取物10g/L，瓊脂 15g/L，pH為7. 1。配制培養(yǎng)基300毫升，加熱瓊脂融化后攪拌均勻裝入10支大試管中，滅菌，做成斜面?zhèn)溆谩龈傻亩救劓溍咕N用無菌水5毫升溶解，取4毫升均勻涂布在 10支斜面上，溫度^°C，濕度40 60%，培養(yǎng)10天，產(chǎn)生大量孢子。加無菌水制成孢子懸浮液。搖瓶種子液制備按如下比例配制培養(yǎng)基甘油10g/L，麥芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脫脂豆粉20g/L，pH為6. 0。配制培養(yǎng)基200毫升，裝500mL三角瓶4瓶(每瓶裝液量50mL)，滅菌，備用。將孢子懸浮液2mL接種到搖瓶中。溫度，培養(yǎng)30小時。種子罐培養(yǎng)采用15升罐進(jìn)行種子培養(yǎng)。按如下比例配制種子罐所用液體培養(yǎng)基(按實消后 10升配制)甘油10g/L，麥芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脫脂豆粉20g/L, pH為6. 0。 實消后體積為10升，當(dāng)溫度降至?xí)r，將SOmL種子液(0. 8% )接種到種子罐中，在溫度為的條件下，攪拌轉(zhuǎn)速400 450轉(zhuǎn)/分，通氣量0. 8VVM(體積/體積/分鐘)，罐壓 0. 04MPa的條件下，培養(yǎng)20小時。發(fā)酵罐培養(yǎng)
4
采用50升發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)。按如下比例配制液體培養(yǎng)基甘油10g/L，脫脂豆粉 20g/L，豆油10g/L，消泡劑2g/L，pH為7. 0。實消后體積為33. 25升，待溫度降至?xí)r， 培養(yǎng)好的種子罐菌種接種到發(fā)酵罐中，接種量為5% (1. 75升)，在溫度為的條件下，整個過程中通過調(diào)節(jié)罐壓、轉(zhuǎn)速、通氣量控制溶氧在30 40%內(nèi)。攪拌轉(zhuǎn)速為300 540轉(zhuǎn) /分，通氣量0. 6VVM 1. IVVM(體積/體積/分鐘)，罐壓0. 06 0. 08MP。在發(fā)酵接種后至27小時，甘油被利用完，開始進(jìn)入利普司他汀合成階段。此時開始補料亞油酸和亮氨酸溶液，補料流速為亞油酸0. 3g/L/h，亮氨酸溶液(濃度為70g/L，PH :11)0. 3g/L/h，發(fā)酵接種后至115h，補料速度調(diào)整為亞油酸0. 35g/L/h，亮氨酸溶液(濃度70g/L, pH :11)0. 35g/ L/h。發(fā)酵接種后至70小時，補入滅菌后的酵母提取物、甘油分別350克。培養(yǎng)過程中，用 20% NaOH,20% H2SO4控制PH在6. 5 7. 5范圍內(nèi)。培養(yǎng)180小時，發(fā)酵效價為6. 7g/L。實施例2斜面培養(yǎng)按如下比例配制培養(yǎng)基葡萄糖8g/L，麥芽提取物4g/L，酵母提取物4g/L，瓊脂 14g/L，pH為7.4。配制培養(yǎng)基300毫升，加熱瓊脂融化后攪拌均勻裝入10支大試管中，滅菌，做成斜面?zhèn)溆谩龈傻亩救劓溍咕N用無菌水5毫升溶解，取4毫升均勻涂布在 10支斜面上，溫度，濕度40 60 %，培養(yǎng)8天，產(chǎn)生大量孢子。加無菌水制成孢子懸浮液。搖瓶種子液制備按如下比例配制培養(yǎng)基甘油10g/L，麥芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脫脂豆粉20g/L，pH為6. 0。配制培養(yǎng)基200毫升，裝500mL三角瓶4瓶(每瓶裝液量50mL)，滅菌，備用。將孢子懸浮液2mL接種到搖瓶中。溫度，培養(yǎng)20小時。種子罐培養(yǎng)采用15升罐進(jìn)行種子培養(yǎng)。按如下比例配制種子罐所用液體培養(yǎng)基(按實消后 10升配制)甘油10g/L，麥芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脫脂豆粉20g/L, pH為6. 0。 實消后體積為10升，當(dāng)溫度降至?xí)r，將20mL種子液(0. 2% )接種到種子罐中，在溫度為的條件下，攪拌轉(zhuǎn)速400 450轉(zhuǎn)/分，通氣量1. OVVM(體積/體積/分鐘)，罐壓 0. 07MPa的條件下，培養(yǎng)40小時。發(fā)酵罐培養(yǎng)采用50升發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)。按如下比例配制液體培養(yǎng)基甘油15g/L，脫脂豆粉 30g/L，豆油10g/L，消泡劑2g/L，pH為6. 7。實消后體積為32. 20升，待溫度降至?xí)r， 培養(yǎng)好的種子罐菌種接種到發(fā)酵罐中，接種量為8% (2. 80升)，在溫度為的條件下，整個過程中通過調(diào)節(jié)罐壓、轉(zhuǎn)速、通氣量控制溶氧在30 40%內(nèi)。攪拌轉(zhuǎn)速為300 540轉(zhuǎn) /分，通氣量0. 6VVM 1. IWM(體積/體積/分鐘)，罐壓0. 06 0. 08MPa。在發(fā)酵接種后至四小時，甘油被利用完，開始進(jìn)入利普司他汀合成階段。此時開始補料亞油酸和亮氨酸溶液，補料流速為亞油酸0. 2g/L/h，亮氨酸溶液(濃度為70g/L，PH :11)0. 2g/L/h，發(fā)酵接種后至115h，補料速度調(diào)整為亞油酸0. 5g/L/h，亮氨酸溶液(濃度70g/L，pH :11)0. 5g/L/ h。發(fā)酵接種后至70小時，補入滅菌后的酵母提取物230克、甘油200克。培養(yǎng)過程中，用 20% NaOH,20% H2SO4控制PH在6. 5 7. 5范圍內(nèi)。培養(yǎng)190小時，發(fā)酵效價為6. 6g/L。實施例3
斜面培養(yǎng)按如下比例配制培養(yǎng)基葡萄糖8g/L，麥芽提取物2g/L，酵母提取物4g/L，瓊脂 12g/L，pH為7. 2。配制培養(yǎng)基300毫升，加熱瓊脂融化后攪拌均勻裝入10支大試管中，滅菌，做成斜面?zhèn)溆?。將凍干的毒三素鏈霉菌菌種用無菌水5毫升溶解，取4毫升均勻涂布在 10支斜面上，溫度^°C，濕度40 60%，培養(yǎng)10天，產(chǎn)生大量孢子。加無菌水制成孢子懸浮液。搖瓶種子液制備按如下比例配制培養(yǎng)基甘油10g/L，麥芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脫脂豆粉20g/L，pH為6. 0。配制培養(yǎng)基200毫升，裝500mL三角瓶4瓶(每瓶裝液量50mL)，滅菌，備用。將孢子懸浮液2mL接種到搖瓶中。溫度，培養(yǎng)27小時。種子罐培養(yǎng)采用15升罐進(jìn)行種子培養(yǎng)。按如下比例配制種子罐所用液體培養(yǎng)基(按實消后 10升配制)甘油10g/L，麥芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脫脂豆粉20g/L, pH為6. 0。 實消后體積為10升，當(dāng)溫度降至?xí)r，將50mL種子液(0. 5% )接種到種子罐中，在溫度為的條件下，攪拌轉(zhuǎn)速400 450轉(zhuǎn)/分，通氣量0. 8VVM(體積/體積/分鐘)，罐壓 0. 05MPa的條件下，培養(yǎng)28小時。發(fā)酵罐培養(yǎng)采用50升發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)。按如下比例配制液體培養(yǎng)基甘油15g/L，脫脂豆粉 20g/L，豆油10g/L，消泡劑2g/L，pH為7. 0。實消后體積為31.50升，待溫度降至28°C時，培養(yǎng)好的種子罐菌種接種到發(fā)酵罐中，接種量為10% (3. 50升)，在溫度為的條件下，整個過程中通過調(diào)節(jié)罐壓、轉(zhuǎn)速、通氣量控制溶氧在30 40%內(nèi)。攪拌轉(zhuǎn)速為300 540轉(zhuǎn) /分，通氣量0. 6VVM 1. IWM(體積/體積/分鐘)，罐壓0. 06 0. 08MPa。在發(fā)酵接種后至四小時，甘油被利用完，開始進(jìn)入利普司他汀合成階段。此時開始補料亞油酸和亮氨酸溶液，補料流速為亞油酸0. 32g/L/h，亮氨酸溶液(濃度為70g/L，PH 11) 0. 30g/L/h,發(fā)酵接種后至115h，補料速度調(diào)整為亞油酸0. 38g/L/h，亮氨酸溶液(濃度70g/L, pH :11)0. 36g/ L/h。發(fā)酵接種后至70小時，補入滅菌后的酵母提取物、甘油分別210克。培養(yǎng)過程中，用 20% NaOH,20% H2SO4控制PH在6. 5 7. 5范圍內(nèi)。培養(yǎng)160小時，發(fā)酵效價為6. 9g/L。實施例4斜面培養(yǎng)按如下比例配制培養(yǎng)基葡萄糖6g/L，麥芽提取物6g/L，酵母提取物6g/L，瓊脂 20g/L, pH為7.0。配制培養(yǎng)基300毫升，加熱瓊脂融化后攪拌均勻裝入10支大試管中，滅菌，做成斜面?zhèn)溆?。將凍干的毒三素鏈霉菌菌種用無菌水5毫升溶解，取4毫升均勻涂布在 10支斜面上，溫度^°C，濕度40 60%，培養(yǎng)10天，產(chǎn)生大量孢子。加無菌水制成孢子懸浮液。搖瓶種子液制備按如下比例配制培養(yǎng)基甘油10g/L，麥芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脫脂豆粉20g/L，pH為6. 0。配制培養(yǎng)基200毫升，裝500mL三角瓶4瓶(每瓶裝液量50mL)，滅菌，備用。將孢子懸浮液2mL接種到搖瓶中。溫度，培養(yǎng)27小時。種子罐培養(yǎng)
采用15升罐進(jìn)行種子培養(yǎng)。按如下比例配制種子罐所用液體培養(yǎng)基(按實消后 10升配制)甘油10g/L，麥芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脫脂豆粉20g/L, pH為6. 0。 實消后體積為10升，當(dāng)溫度降至?xí)r，將50mL種子液(0. 5% )接種到種子罐中，在溫度為的條件下，攪拌轉(zhuǎn)速400 450轉(zhuǎn)/分，通氣量0. 8VVM(體積/體積/分鐘)，罐壓 0. 05MPa的條件下，培養(yǎng)28小時。發(fā)酵罐培養(yǎng)采用50升發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)。按如下比例配制液體培養(yǎng)基甘油15g/L，脫脂豆粉 30g/L，豆油15g/L，消泡劑5g/L，pH為6. 8。實消后體積為31. 50升，待溫度降至28°C時，培養(yǎng)好的種子罐菌種接種到發(fā)酵罐中，接種量為10% (3. 50升)，在溫度為的條件下，整個過程中通過調(diào)節(jié)罐壓、轉(zhuǎn)速、通氣量控制溶氧在30 40%內(nèi)。攪拌轉(zhuǎn)速為300 540轉(zhuǎn) /分，通氣量0. 6VVM 1. IWM(體積/體積/分鐘)，罐壓0. 06 0. 08MPa。在發(fā)酵接種后至27小時，甘油被利用完，開始進(jìn)入利普司他汀合成階段。此時開始補料亞油酸和亮氨酸溶液，補料流速為亞油酸0. 3g/L/h，亮氨酸溶液(濃度為70g/L，PH :11)0. 3g/L/h，發(fā)酵接種后至115h，補料速度調(diào)整為亞油酸0. 35g/L/h，亮氨酸溶液(濃度70g/L, pH :11)0. 35g/ L/h。發(fā)酵接種后至70小時，補入滅菌后的酵母提取物、甘油分別200克。培養(yǎng)過程中，用 20% NaOH,20 % H2SO4控制PH在6. 5 7. 5范圍內(nèi)。培養(yǎng)175小時，發(fā)酵效價為6. 9g/L。實施例5斜面培養(yǎng)按如下比例配制培養(yǎng)基葡萄糖5g/L，麥芽提取物5g/L，酵母提取物6g/L，瓊脂 15g/L，pH為6. 9。配制培養(yǎng)基300毫升，加熱瓊脂融化后攪拌均勻裝入10支大試管中，滅菌，做成斜面?zhèn)溆?。將凍干的毒三素鏈霉菌菌種用無菌水5毫升溶解，取4毫升均勻涂布在 10支斜面上，溫度^°C，濕度40 60%，培養(yǎng)10天，產(chǎn)生大量孢子。加無菌水制成孢子懸浮液。搖瓶種子液制備按如下比例配制培養(yǎng)基甘油10g/L，麥芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脫脂豆粉20g/L，pH為6. 5。配制培養(yǎng)基200毫升，裝500mL三角瓶4瓶(每瓶裝液量50mL)，滅菌，備用。將孢子懸浮液2mL接種到搖瓶中。溫度，培養(yǎng)27小時。種子罐培養(yǎng)采用15升罐進(jìn)行種子培養(yǎng)。按如下比例配制種子罐所用液體培養(yǎng)基(按實消后 10升配制)甘油10g/L，麥芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脫脂豆粉20g/L, pH為6. 5。 實消后體積為10升，當(dāng)溫度降至?xí)r，將50mL種子液(0. 5% )接種到種子罐中，在溫度為的條件下，攪拌轉(zhuǎn)速400 450轉(zhuǎn)/分，通氣量0. 9VVM(體積/體積/分鐘)，罐壓 0. 06MPa的條件下，培養(yǎng)28小時。發(fā)酵罐培養(yǎng)采用50升發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)。按如下比例配制液體培養(yǎng)基甘油20g/L，脫脂豆粉 40g/L，豆油20g/L，消泡劑2g/L，pH為6. 7。實消后體積為31. 85升，待溫度降至?xí)r， 培養(yǎng)好的種子罐菌種接種到發(fā)酵罐中，接種量為9% (3. 15升)，在溫度為的條件下，整個過程中通過調(diào)節(jié)罐壓、轉(zhuǎn)速、通氣量控制溶氧在30 40%內(nèi)。攪拌轉(zhuǎn)速為300 540轉(zhuǎn) /分，通氣量0. 6VVM 1. IWM(體積/體積/分鐘)，罐壓0. 06 0. 08MPa。在發(fā)酵接種后至32小時，甘油被利用完，開始進(jìn)入利普司他汀合成階段。此時開始補料亞油酸和亮氨酸溶液，補料流速為亞油酸0. 35g/L/h，亮氨酸溶液(濃度為70g/L，PH 11) 0. 35g/L/h，發(fā)酵接種后至115h，補料速度調(diào)整為亞油酸0. 35g/L/h，亮氨酸溶液(濃度70g/L, pH :11)0. 35g/ L/h。發(fā)酵接種后至70小時，補入滅菌后的酵母提取物、甘油分別240克。培養(yǎng)過程中，用 20% NaOH,20% H2SO4控制PH在6. 5 7. 5范圍內(nèi)。培養(yǎng)183小時，發(fā)酵效價為7. 5g/L。實施例6斜面培養(yǎng)按如下比例配制培養(yǎng)基葡萄糖4g/L，麥芽提取物4g/L，酵母提取物6g/L，瓊脂 10g/L, pH為6. 9。配制培養(yǎng)基300毫升，加熱瓊脂融化后攪拌均勻裝入10支大試管中，滅菌，做成斜面?zhèn)溆?。將凍干的毒三素鏈霉菌菌種用無菌水5毫升溶解，取4毫升均勻涂布在 10支斜面上，溫度^°C，濕度40 60%，培養(yǎng)10天，產(chǎn)生大量孢子。加無菌水制成孢子懸浮液。搖瓶種子液制備按如下比例配制培養(yǎng)基甘油10g/L，麥芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脫脂豆粉20g/L，pH為6. 2。配制培養(yǎng)基200毫升，裝500mL三角瓶4瓶(每瓶裝液量50mL)，滅菌，備用。將孢子懸浮液2mL接種到搖瓶中。溫度，培養(yǎng)27小時。種子罐培養(yǎng)采用15升罐進(jìn)行種子培養(yǎng)。按如下比例配制種子罐所用液體培養(yǎng)基(按實消后 10升配制)甘油10g/L，麥芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脫脂豆粉20g/L, pH為6. 0。 實消后體積為10升，當(dāng)溫度降至?xí)r，將50mL種子液(0. 5% )接種到種子罐中，在溫度為的條件下，攪拌轉(zhuǎn)速400 450轉(zhuǎn)/分，通氣量0. 8VVM(體積/體積/分鐘)，罐壓 0. 05MPa的條件下，培養(yǎng)28小時。發(fā)酵罐培養(yǎng)采用50升發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)。按如下比例配制液體培養(yǎng)基甘油15g/L，脫脂豆粉 40g/L，豆油20g/L，消泡劑2g/L，pH為7. 0。實消后體積為31.50升，待溫度降至28°C時，培養(yǎng)好的種子罐菌種接種到發(fā)酵罐中，接種量為10% (3. 50升)，在溫度為的條件下，整個過程中通過調(diào)節(jié)罐壓、轉(zhuǎn)速、通氣量控制溶氧在30 40%內(nèi)。攪拌轉(zhuǎn)速為300 540轉(zhuǎn) /分，通氣量0. 6VVM 1. IVVM(體積/體積/分鐘)，罐壓0. 06 0. 08MPa在發(fā)酵接種后至30小時，甘油被利用完，開始進(jìn)入利普司他汀合成階段，此時開始補料亞油酸和亮氨酸溶液，補料流速為亞油酸0. 32g/L/h，亮氨酸溶液(濃度為70g/L，PH 11) 0. 32g/L/h，發(fā)酵接種后至115h，補料速度調(diào)整為亞油酸0. 35g/L/h，亮氨酸溶液(濃度70g/L, pH :11)0. 35g/ L/h。發(fā)酵接種后至70小時，補入滅菌后的酵母提取物、甘油分別280克。培養(yǎng)過程中，用 20% NaOH,20% H2SO4控制PH在6. 5 7. 5范圍內(nèi)。培養(yǎng)180小時，發(fā)酵效價為7. 9g/L。對比例1斜面培養(yǎng)按如下比例配制培養(yǎng)基葡萄糖4g/L，麥芽提取物4g/L，酵母提取物6g/L，瓊脂 10g/L, pH為6. 9。配制培養(yǎng)基300毫升，加熱瓊脂融化后攪拌均勻裝入10支大試管中，滅菌，做成斜面?zhèn)溆?。將凍干的毒三素鏈霉菌菌種用無菌水5毫升溶解，取4毫升均勻涂布在 10支斜面上，溫度^°C，濕度40 60%，培養(yǎng)10天，產(chǎn)生大量孢子。加無菌水制成孢子懸浮液。搖瓶種子液制備按如下比例配制培養(yǎng)基甘油10g/L，麥芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脫脂豆粉20g/L，pH為6. 2。配制培養(yǎng)基200毫升，裝500mL三角瓶4瓶(每瓶裝液量50mL)，滅菌，備用。將孢子懸浮液2mL接種到搖瓶中。溫度，培養(yǎng)27小時。種子罐培養(yǎng)采用15升罐進(jìn)行種子培養(yǎng)。按如下比例配制種子罐所用液體培養(yǎng)基(按實消后 10升配制)甘油10g/L，麥芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脫脂豆粉20g/L, pH為6. 0。 實消后體積為10升，當(dāng)溫度降至?xí)r，將50mL種子液(0. 5% )接種到種子罐中，在溫度為的條件下，攪拌轉(zhuǎn)速400 450轉(zhuǎn)/分，通氣量0. 8VVM(體積/體積/分鐘)，罐壓 0. 05MPa的條件下，培養(yǎng)28小時。發(fā)酵罐培養(yǎng)采用50升發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)。按如下比例配制液體培養(yǎng)基甘油45g/L，豆粉Ilg/ L，豆油llg/L，消泡劑0. 55ml，碳酸鈣2. 2g/L，亞油酸2. 2g/L，硫酸亞鐵0. 09g/L,硫酸鋅 0. 045g/L，四水氯化錳0. 13g/L，七水硫酸鎂0. 13g/L，pH為6. 5。實消后體積為31. 50升， 待溫度降至?xí)r，培養(yǎng)好的種子罐菌種接種到發(fā)酵罐中，接種量為10% (3. 50升)，在溫度為的條件下，整個過程中通過調(diào)節(jié)罐壓、轉(zhuǎn)速、通氣量控制溶氧在30 40%內(nèi)。攪拌轉(zhuǎn)速為300 540轉(zhuǎn)/分，通氣量0. 6VVM 1. IVVM(體積/體積/分鐘)，罐壓0. 06 0. OSMI^a在發(fā)酵接種后至32小時，甘油被利用完，開始進(jìn)入利普司他汀合成階段，此時開始補料亞油酸和亮氨酸溶液，補料流速為亞油酸0. 32g/L/h，亮氨酸溶液(濃度為70g/L，PH 11)0. 32g/L/h，發(fā)酵接種后至115h，補料速度調(diào)整為亞油酸0. 35g/L/h，亮氨酸溶液(濃度 70g/L，pH :11)0. 35g/L/h。發(fā)酵接種后至70小時，補入滅菌后的酵母提取物、甘油分別280 克。培養(yǎng)過程中，用20% Na0H、20% H2SO4控制PH在6. 5 7. 5范圍內(nèi)。培養(yǎng)180小時，發(fā)酵效價為6. Og/L。對比例2斜面培養(yǎng)按如下比例配制培養(yǎng)基葡萄糖4g/L，麥芽提取物6g/L，酵母提取物6g/L，瓊脂 10g/L, pH為7.0。配制培養(yǎng)基300毫升，加熱瓊脂融化后攪拌均勻裝入10支大試管中，滅菌，做成斜面?zhèn)溆?。將凍干的毒三素鏈霉菌菌種用無菌水5毫升溶解，取4毫升均勻涂布在 10支斜面上，溫度^°C，濕度40 60%，培養(yǎng)10天，產(chǎn)生大量孢子。加無菌水制成孢子懸浮液。搖瓶種子液制備按如下比例配制培養(yǎng)基甘油10g/L，麥芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脫脂豆粉20g/L，pH為6. 0。配制培養(yǎng)基200毫升，裝500mL三角瓶4瓶(每瓶裝液量50mL)，滅菌，備用。將孢子懸浮液2mL接種到搖瓶中。溫度，培養(yǎng)27小時。種子罐培養(yǎng)采用15升罐進(jìn)行種子培養(yǎng)。按如下比例配制種子罐所用液體培養(yǎng)基(按實消后 10升配制)甘油10g/L，麥芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脫脂豆粉20g/L, pH為6. 0。 實消后體積為10升，當(dāng)溫度降至?xí)r，將50mL種子液(0. 5% )接種到種子罐中，在溫度為的條件下，攪拌轉(zhuǎn)速400 450轉(zhuǎn)/分，通氣量0. 8VVM(體積/體積/分鐘)，罐壓 0. 05MPa的條件下，培養(yǎng)28小時。發(fā)酵罐培養(yǎng)采用50升發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)。按如下比例配制液體培養(yǎng)基(按實消并移種后35 升配制):甘油158/1，脫脂豆粉4(^/1，豆油158/1，消泡劑28/1，？!1為6.9。實消后體積為31. 5升，待溫度降至?xí)r，培養(yǎng)好的種子罐菌種接種到發(fā)酵罐中，接種量為10% (3. 5 升)，在溫度為的條件下，整個過程中通過調(diào)節(jié)罐壓轉(zhuǎn)速通氣量控制溶氧在30 40% 內(nèi)。攪拌轉(zhuǎn)速為300 540轉(zhuǎn)/分，通氣量0. 6VVM 1. IVVM(體積/體積/分鐘)，罐壓 0. 06 0. 08MPa，發(fā)酵過程中用20% NaOH,20% H2SO4控制PH在6. 5 7. 5范圍內(nèi)。在發(fā)酵接種后至30小時，甘油被利用完，開始進(jìn)入利普司他汀合成階段，此時開始補料亞油酸和亮氨酸溶液，補料流速為亞油酸0. 6g/L/h，亮氨酸溶液(濃度為70g/L，PH :11)0. 6g/L/h。 培養(yǎng)190小時，發(fā)酵效價為5. 3g/L。
權(quán)利要求
1.一種發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀的方法，包括毒三素鏈霉菌或其衍生物的斜面菌種的制備、搖瓶種子液的制備、種子液的制備以及發(fā)酵培養(yǎng)，其特征在于在發(fā)酵培養(yǎng)中，在發(fā)酵培養(yǎng)基中的甘油消耗殆盡后，開始流加補入亞油酸和亮氨酸溶液，其中亮氨酸溶液的濃度為 70g/L，pH為11，二者的補料流速均為0. 2 0. 5g/L/h，單位g/L/h是克/升/小時；在發(fā)酵接種后至115小時，補料速度進(jìn)行調(diào)整，補料速度在0. 2 0. 5g/L/h ；在接種后至70小時， 一次性補入滅菌的酵母提取物以及甘油，使培養(yǎng)基中酵母提取物以及甘油基質(zhì)濃度在5 10g/L的水平。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀的方法，其特征在于所述菌種為毒三素鏈霉菌ACCC41038或其衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀的方法，其特征在于它包括以下步驟a.斜面菌種的制備將凍干的菌種用無菌水稀釋后涂布裝有固體培養(yǎng)基的斜面上，溫度^°C，濕度40 60%，培養(yǎng)8 10天，產(chǎn)孢后加無菌水制成孢子懸浮液；b.搖瓶種子液制備將斜面孢子接種搖瓶種子培養(yǎng)基，250rpm，溫度^°C，培養(yǎng)20 30小時；c.種子液的制備將步驟b中培養(yǎng)好的搖瓶種子接種到儲有種子培養(yǎng)基的種子罐中， 接種量為種子培養(yǎng)基體積的0. 1 0. 8%，在下通氣量0. 8VVM 1. 0VVM,單位VVM是體積/體積/分鐘，罐壓0. 04 0. 07MPa的條件下，培養(yǎng)20 40小時；d.發(fā)酵培養(yǎng)將步驟c中培養(yǎng)好的菌種接種到儲有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種種子液的量占發(fā)酵培養(yǎng)基和種子液體積的5 10%，在溫度為^°C，通氣量0. 6VVM 1. 1VVM, 罐壓0. 06 0. 08MPa,發(fā)酵過程中pH控制在6. 5 7. 5范圍內(nèi)，培養(yǎng)160 190小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀的方法，其特征在于所述的步驟a中固體培養(yǎng)基的成分和含量為葡萄糖2 8g/L，麥芽提取物2 8g/L，酵母提取物4 IOg/ L，瓊脂 10 20g/L, pH 為 6. 9 7. 4。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀的方法，其特征在于所述的步驟b中搖瓶種子培養(yǎng)基成分和含量為甘油10g/L，麥芽提取物10g/L，酵母提取提取物5g/L，脫脂豆粉 20g/L，pH 為 6. 0 6. 5。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀的方法，其特征在于所述的步驟c中種子培養(yǎng)基使用脫脂豆粉作為主要氮源。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀的方法，其特征在于所述的步驟c中種子培養(yǎng)基成分和含量為甘油10g/L，麥芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脫脂豆粉20g/L， pH 為 6. 0 6. 5。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀的方法，其特征在于所述的步驟d中發(fā)酵培養(yǎng)基使用甘油、豆油和脫脂豆粉為主要碳源或氮源。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀的方法，其特征在于所述的步驟d中發(fā)酵培養(yǎng)基成分和含量為甘油10 20g/L，脫脂豆粉20 40g/L，豆油10 20g/L，消泡劑 2 5g/L，pH 為 6. 7 7. 0。
10.一種發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于其成分和含量為甘油10 20g/L，脫脂豆粉20 40g/L，豆油10 20g/L，消泡劑2 5g/L，pH為6. 7 7. 0。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵生產(chǎn)領(lǐng)域，提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀(lipstatin)的方法。該方法以毒三素鏈霉菌(Streptomyces toxytricini)為出發(fā)菌，主要包括斜面菌種的制備、種子液的制備以及發(fā)酵工藝控制等步驟。本發(fā)明以大豆粉、豆油、甘油為發(fā)酵培養(yǎng)基的主要氮源和碳源并通過調(diào)控發(fā)酵工藝及培養(yǎng)基組份，使利普司他汀的生產(chǎn)成本大大降低，發(fā)酵效價提高，解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的生產(chǎn)成本高、發(fā)酵效價低的缺點。
文檔編號C12P17/02GK102268466SQ201110207208
公開日2011年12月7日 申請日期2011年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月23日
發(fā)明者劉茂田, 趙志全 申請人:魯南新時代生物技術(shù)有限公司