專利名稱：人類特發(fā)性基底節(jié)鈣化致病基因及其編碼蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人體變異的基因，即人類特發(fā)性基底節(jié)鈣化(IBGC)致病基因SLC20A2。本發(fā)明還涉及這種變異基因及其編碼的蛋白在檢測(cè)和作為治療IBGC疾病的藥物靶點(diǎn)中的作用和意義。
背景技術(shù)：
特發(fā)性腦基底節(jié)I丐化(IdiopathicBasal Ganglia Calcification, IBGC)俗稱Fahr病，是一種先天性神經(jīng)系統(tǒng)錐體外系疾病，大腦X-射線電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)發(fā)現(xiàn)率為1-2% [1_2]。大多數(shù)IBGC家系表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳方式，也有常染色體隱性遺傳和性染色體連鎖遺傳的報(bào)道。IBGC癥在CT上表現(xiàn)為大腦雙側(cè)對(duì)稱性基底節(jié)鈣化。常見鈣化部位的發(fā)生順序是蒼白球、尾狀核、殼核、丘腦、額頂葉腦回底部、齒狀核、小腦皮層、腦干中央部及側(cè)腦室周圍，在CT上可表現(xiàn)為卵圓形和或八字形高密度影，常為對(duì)稱性。患者運(yùn)動(dòng)能力逐漸受損或喪失，智力和意識(shí)表現(xiàn)癡呆、癲癇、精神障礙等，目前尚未有針對(duì)性藥物治療該病。其發(fā)病機(jī)制不清楚，對(duì)其進(jìn)行分子遺傳學(xué)研究有望克隆其致病基因，為尋找藥靶、開發(fā)相關(guān)藥物及治療該病奠定基礎(chǔ)。目前該病定位3個(gè)致病位點(diǎn)14ql3 (IBGCl)、2q37(IBGC2)和8p21. 1-qll. 23(IBGC3)，其中IBGC3位點(diǎn)是我們定位的。該病的致病基因尚未克隆，因此對(duì)IBGC致病基因進(jìn)行系統(tǒng)研究，將對(duì)大腦基底節(jié)鈣化的診斷、開發(fā)針對(duì)性的藥物及治療具有十分重要理論和實(shí)踐意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供IBGC致病基因，定位出該疾病的基因突變位點(diǎn)，以及利用該疾病的基因突變位點(diǎn)檢測(cè)人體中是否存在該基因突變的方法。同時(shí)提供IBGC致病基因編碼的蛋白質(zhì)序列及其突變導(dǎo)致的細(xì)胞磷吸收下降，為闡明該病的致病機(jī)制提供了基礎(chǔ)，為進(jìn)一步治療該病提供了設(shè)計(jì)藥物的靶點(diǎn)。本發(fā)明真對(duì)收集并鑒定的一個(gè)IBGC大家系進(jìn)行微衛(wèi)星標(biāo)記的連鎖分析，排除了與IBGCl和IBGC2的連鎖關(guān)系，但將該家系的致病基因定位于IBGC3位點(diǎn)，進(jìn)一步連鎖縮短了 IBGC3位點(diǎn)即將8p21. 1-qll. 23 (25Mb物理圖距，12. 29cM遺傳圖距)縮短在.8pl2-qll. 23(19. 5Mb物理圖距，6. 40cM遺傳圖距)染色體區(qū)段。本發(fā)明對(duì)定位于8pl2-qll. 23區(qū)域內(nèi)特發(fā)性基底節(jié)鈣化的41個(gè)候選基因進(jìn)行雙向測(cè)序，在第一個(gè)家系中發(fā)現(xiàn)SLC20A2基因一個(gè)點(diǎn)突變；在第二、三個(gè)家系中，發(fā)現(xiàn)該基因三個(gè)新點(diǎn)突變，第二個(gè)家系先征者存在兩個(gè)點(diǎn)突變，一個(gè)突變來自父親，第二個(gè)突變來自母親。隨后在巴西和西班牙IBGC家系中發(fā)現(xiàn)該基因四個(gè)新的突變包括兩個(gè)缺失突變和兩個(gè)點(diǎn)突變。上述的八個(gè)突變分別在各自家系中所有患者的DNA樣品上均得到驗(yàn)證，在家系正常成員、508例正常漢族人群和96例歐洲人群中不存在上述突變，排除了單個(gè)核苷酸多態(tài)性的可能性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)這些突變?cè)斐伤幋a的氨基酸缺失、移碼和改變，由此，本發(fā)明提供了 8種如SEQ ID NO 2~9所示的變異的人類SLC20A2基因，其特征分別在于，所述SLC20A2基因編碼區(qū)第124-126缺失3個(gè)堿基(鳥嘌呤、胸腺嘧啶和鳥嘌呤即GTG)、第362位胞嘧啶被鳥嘌呤替換(C > G)、1409位胞嘧啶堿基缺失(delC)、1492位鳥嘌呤堿基被腺嘌呤替換(G > A)、第1723位鳥嘌呤堿基被腺嘌呤替換(G > A)、第1784位胞嘧啶堿基被胸腺嘧啶替換(C > T)、第1802位胞嘧啶堿基被鳥嘌呤或胸腺嘧啶替換(C >G/T)。正常的人類SLC20A2基因的核苷酸序列如SEQ ID ΝΟ:1所示。本發(fā)明提供了 8種如SEQ ID NO :45_52所示的變異的人類SLC20A2基因所編碼的蛋白質(zhì)序列，其特征分別在于，SLC20A2蛋白的氨基酸序列分別是第42位Val缺失(p. V42del)、第 121 位的 Ser 變?yōu)?Cys (p. S121C)、從 470 位的 Pro 移碼(p. P470Lf sX37) 37個(gè)氨基酸終止、第498的Gly突變?yōu)锳rg (p. G498R)、第575位Glu突變?yōu)長ys (p. E575K)、第595位的Thr突變?yōu)镸et (p. T595M)及第601位的Ser突變?yōu)門rp或Leu (p. S601W/L)。正常的人類SLC20A2基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO 44所示。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)來源于人體的生物樣本中是否存在所述基因的突變方法，其步驟(1)從所述樣本中提取和純化基因材料；(2)對(duì)所述基因材料進(jìn)行聚合酶鏈擴(kuò)增(PCR)反應(yīng)，獲取PCR產(chǎn)物； (3)對(duì)所述PCR產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，與SEQ ID NO : I序列比對(duì)，以確定所述生物樣本中是否含有SLC20A2基因突變。優(yōu)選地，所述生物樣本為體液，該體液包括但不限于血液、血漿、羊水、淋巴液等。優(yōu)選地，所述體液為血液。優(yōu)選地，在上述PCR反應(yīng)中使用的引物對(duì)為SEQ ID NO :10和11 ;12和13 ;22和23 ;26和27 ;28和29。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以使用SEQ ID NO :14和15 ;16和17 ;18和19 ；20和21 ；24和25的引物對(duì)擴(kuò)增相應(yīng)核苷酸序列。本發(fā)明還提供了檢測(cè)來源人體的生物樣本中是否存在上述八種突變的方法，其步驟包括1)從所述樣本中提取和純化基因材料；(2)對(duì)所述基因材料進(jìn)行聚合酶鏈擴(kuò)增(PCR)反應(yīng)，獲取PCR產(chǎn)物；(3)對(duì)所述PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切；(4)對(duì)所述酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察和拍照電泳圖，與表2相關(guān)酶切產(chǎn)物大小比對(duì)，以確定所述生物樣本中是否含有SLC20A2基因上述八種突變。優(yōu)選地，所述體液為血液或羊水。優(yōu)選地，在上述PCR反應(yīng)中使用的引物對(duì)為SEQ ID NO :30和31 ;32和33;34和35 ；36 和 37 ；38 和 39 ；40 和 41 ；42 和 43。優(yōu)選地，上述PCR產(chǎn)物中使用的6種限制性內(nèi)切酶Hpa I、EcoR I、Bam HI、HindIII、Sph I 和 Sac I。本發(fā)明還提供了變異的人類SLC20A2基因功能改變，如附圖6所示，該基因編碼的蛋白是分布在細(xì)胞膜上鈉磷共轉(zhuǎn)體，對(duì)細(xì)胞維持磷的內(nèi)穩(wěn)態(tài)非常重要，SLC20A2基因突變導(dǎo)致該共轉(zhuǎn)體功能下降，從而導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)磷的吸收下降(見實(shí)施例4)，打破了這種內(nèi)穩(wěn)態(tài)，使細(xì)胞外積累大量的無機(jī)磷以至于與基質(zhì)中鈣結(jié)合形成磷酸鈣顆粒，長期積累而導(dǎo)致基底節(jié)鈣化。因此人類SLC20A2變異基因可以作為藥物的靶點(diǎn)，開發(fā)相關(guān)藥物治療人類大腦基底節(jié)鈣化提供了科學(xué)依據(jù)。根據(jù)發(fā)明人提供的SLC20A2基因序列變異的位點(diǎn)，應(yīng)用本發(fā)明提供的檢測(cè)來源于人體的生物樣本中是否存在所述基因的突變方法，對(duì)七個(gè)特發(fā)性基底節(jié)鈣化家系所有個(gè)體進(jìn)行突變檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)八個(gè)突變包括兩個(gè)缺失突變和六個(gè)點(diǎn)突變，而家系正常成員、508例正常漢族個(gè)體和96例歐洲個(gè)體中不存在上述突變。證明本發(fā)明提供的方法能夠精確診斷由SLC20A2基因突變導(dǎo)致的IBGC疾病。同時(shí)對(duì)該基因突變所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分析，發(fā)現(xiàn)SLC20A2突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)磷的吸收下降，從而導(dǎo)致人的基底節(jié)鈣化。一方面為顱內(nèi)鈣化患者是否是該基因突變導(dǎo)致的提供病因診斷依據(jù)；另一方面在無臨床表現(xiàn)人群中進(jìn)行該基因突變篩查，提供優(yōu)生優(yōu)育指導(dǎo)；第三，為治療該類基底節(jié)鈣化疾病提供藥物靶點(diǎn)。


以下將通過實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 圖I為家系2中IBGC先證者(a和b)和先證者父親(C)及母親(d)的腦CT圖，a_b表明先證者的顱內(nèi)廣泛鈣化-雙側(cè)大腦半球(額葉、頂葉、顳葉和枕葉)皮質(zhì)、基底節(jié)、丘腦下部和雙側(cè)小腦；其父親(C)雙側(cè)豆?fàn)詈恕⑽矤詈撕颓鹉X下部鈣化；而其母親(d)僅僅左側(cè)蒼白球輕度鈣化。圖2為IBGC家系I (a)和家系2 (b)的系譜，箭頭代表先證者。圖3為IBGC家系I和2致病基因在8號(hào)染色體的定位區(qū)域。圖4為SLC20A2基因8個(gè)突變序列SEQ ID NO :2_9與正常序列SEQ ID N0:1在突變位點(diǎn)的對(duì)比示意圖，箭頭表示突變發(fā)生開始位置或突變位置a，突變發(fā)生在編碼區(qū)第124-126缺失3個(gè)堿基(鳥嘌呤、胸腺嘧啶和鳥嘌呤即GTG) ；b,突變發(fā)生在第362位胞嘧啶被鳥嘌呤替換；c，突變發(fā)生在1409位胞嘧啶堿基缺失(delC) ;d，突變發(fā)生在第1492位鳥嘌呤堿基被腺嘌呤替換(G > A) ;e，突變發(fā)生在第1723位鳥嘌呤堿基被腺嘌呤替換(G >A) ;f，突變發(fā)生在第1784位胞嘧啶堿基被胸腺嘧啶替換(C > T) ;g，h，突變發(fā)生在第1802位胞嘧啶堿基被鳥嘌呤或胸腺嘧啶替換(C > G/T)。圖5為家系I (圖a)和家系2 (圖b)突變驗(yàn)證圖。示相關(guān)突變與該家系疾病共分離。圖6發(fā)明人發(fā)現(xiàn)IBGC致病基因的8個(gè)突變轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞對(duì)磷吸收的影響圖。示這些突變體與野生型(32磷吸收設(shè)為100)相比32磷吸收值。圖7為具體實(shí)施方式
中的PCR反應(yīng)程序(a)和單鏈擴(kuò)增PCR反應(yīng)程序(b)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I : IBGC3致病位點(diǎn)的精細(xì)定位I、家系收集與鑒定發(fā)明人通過對(duì)先征者及其家庭進(jìn)行醫(yī)學(xué)檢查和臨床診斷，采集了第二個(gè)常染色體顯性IBGC家系(四代8名患者，先證者的腦CT如圖1，對(duì)稱性基底節(jié)鈣鹽沉積，血清中生化檢查各項(xiàng)指標(biāo)正常，符合IBGC的臨床特征。系譜圖如圖2b)的外周血樣本。2、基因組DNA提取使用美國Promega公司的Wizard Genomic DNA提取試劑盒提取外周血液樣本基因組DNA。
3、IBGC致病位點(diǎn)連鎖分析首先對(duì)已報(bào)道的3個(gè)IBGC定位位點(diǎn)區(qū)域的微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析，排除了該家系致病基因與IBGCl和IBGC2區(qū)域的連鎖。初步將第二個(gè)IBGC家系的致病基因定位在IBGC3位點(diǎn)，對(duì)連鎖位點(diǎn)的染色體上下游區(qū)域，從LMS V2. 5-MD5和Genethon連鎖圖譜(Dib等1996)微衛(wèi)星標(biāo)記中，選用含較高信息量的微衛(wèi)星標(biāo)記，由上?；瞪锛夹g(shù)公司合成引物并加熒光標(biāo)記，對(duì)致病基因所在位點(diǎn)進(jìn)行精細(xì)定位，根據(jù)交換發(fā)生的位置，確定致病基因在染色體上的精確位置。進(jìn)一步的精細(xì)定位將IBGC3位點(diǎn)即8p21. 1-qll. 23 (25Mb 物理圖距，12. 29cM 遺傳圖距)縮短在 8pl2-qll. 23(18. 5Mb 物理圖距，6. 40cM遺傳圖距)染色體區(qū)段(圖3)。基因的染色體定位技術(shù)在分子遺傳學(xué)領(lǐng)域?qū)τ诒绢I(lǐng)域的研究人員而言是已知的技術(shù)，本發(fā)明是利用該技術(shù)發(fā)現(xiàn)可能導(dǎo)致人類疾病的變異基因。實(shí)施例2 =IBGC致病基因的克隆I、候選基因的篩選
發(fā)明人根據(jù)基底節(jié)鈣化的病理機(jī)制和基因結(jié)構(gòu)與功能特點(diǎn)，優(yōu)先選擇大腦表達(dá)以及與神經(jīng)系統(tǒng)異常相關(guān)的基因作為候選基因，發(fā)明人在已定位的IBGC區(qū)段(8pl2-qll. 23)內(nèi)選擇 41 個(gè)候選基因 UNC5D，ZNF703, KCNUl，ERLIN2，PROSC, RABlIFIPl，EIF4EBP1，ASH2L，LSMl，BAG4, DDHD2, PPAPDC1B, WHSC1L1, LETM2, ADAM9, ADAM2, ZMAT4, G0LGA7, AGPAT6,NKX6-3, ANKl，PLAT, IKBKB, DKK4, UDAC3, SLC20A2, CHRNB3, CHRNA6, POLB, THAPI, SGK196,HGSNAT, MCM4, EFCABI, SNAI2, CEBPD, UBE2V2, SNTGl, PXDffL, PCMTDl 和 ST18。2、基因組DNA提取使用美國Promega公司的Wizard Genomic DNA提取試劑盒提取外周血液樣本基因組DNA。3、對(duì)候選基因進(jìn)行測(cè)序發(fā)明人根據(jù)外顯子特異的PCR擴(kuò)增引物用Primerf軟件設(shè)計(jì)(如表I所示)，并由上海桑尼生物有限公司合成這些引物，對(duì)樣本目標(biāo)片段進(jìn)行PCR體外擴(kuò)增，擴(kuò)增片段包含了 SLC20A2基因編碼區(qū)所有外顯子、外顯子-內(nèi)含子交界處序列，序列來源為EnsembleGenome Browser，擴(kuò)增片段大小如表I所示。測(cè)序選擇家系先征者以及一名正常個(gè)體同時(shí)進(jìn)行，使用ABI公司商品化的試劑盒，在全自動(dòng)測(cè)序儀上完成，所有擴(kuò)增片段的都會(huì)進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與Ensemble Genome Browser數(shù)據(jù)庫中SLC20A2基因的正常序列比對(duì)分析。成功地克隆了 IBGC致病基因SLC20A2，正是由于該基因發(fā)生了突變導(dǎo)致了 IBGC疾病的發(fā)生。第一個(gè)家系中，突變發(fā)生在第8外顯子編碼區(qū)(c. 1492G>A/p.G498R)(圖4d);第二、三個(gè)家系中，突變發(fā)生在第11個(gè)外顯子編碼區(qū)(同一個(gè)位的堿基發(fā)生不同的突變)(c. 1802C> G/p. S601W ；c. 1802C > T/p. S601L)(圖4g和h);第二個(gè)家系先征者存在兩個(gè)突變，一個(gè)突變來自父親(c. 1802C > G/p. S601W)，第二個(gè)突變來自母親(c. 362C > G/p. S121C，圖4b)。隨后在巴西和西班牙IBGC家系中發(fā)現(xiàn)該基因四個(gè)突變分別是c. 124-126delGTG/p. V42del (圖 4a)，c. 1409delC/p. 470Lfs37X(圖 4c)，c. 1723G > A/p. E575K(圖 4e)，c. 1784C > T/p. T595M(圖4f)。上述的八個(gè)突變分別在各自家系中所有患者的DNA樣品上均得到驗(yàn)證，在508例正常漢族人群和96例歐洲人群中不存在上述突變，排除了單個(gè)核苷酸多態(tài)性的可能性。八個(gè)突變序列和正常人的序列比對(duì)示意圖如圖4所示。表I IBGC家系SLC20A2基因編碼區(qū)所有外顯子測(cè)序引物
權(quán)利要求
1.一種變異的人類SLC20A2基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO :2至9中任一序列所示。
2.權(quán)利要求I所述的變異的人類SLC20A2基因所編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列為SEQID NO 45至52中任一序列所示。
3.權(quán)利要求I所述的變異的人類SLC20A2基因在制備人類特發(fā)性基底節(jié)鈣化疾病基因診斷芯片中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述的變異的人類SLC20A2基因所編碼的蛋白質(zhì)作為治療人類特發(fā)性基底節(jié)鈣化疾病的藥物靶點(diǎn)。
5.—種體外檢測(cè)SLC20A2基因突變的試劑盒，含有以下10對(duì)引物中的一對(duì)或幾對(duì)或全部
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，還含有Taq酶、緩沖液和dNTP。
7.—種體外檢測(cè)SLC20A2基因突變的試劑盒，含有以下7對(duì)引物中的一對(duì)或幾對(duì)或全部
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，還含有Taq酶、緩沖液和dNTP。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于，還含有限制性內(nèi)切酶HpaI.EcoRI、Bam HKHind III、Sph I 和 Sac I0
全文摘要
本發(fā)明提供了一組變異的人類SLC20A2基因，并揭示了該變異的人類SLC20A2基因?yàn)樘匕l(fā)性腦基底節(jié)鈣化疾病的致病基因。利用該變異的人類SLC20A2基因，可以對(duì)特發(fā)性基底節(jié)鈣化疾病進(jìn)行診斷和患病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。本發(fā)明還提供了由所述的變異的人類SLC20A2基因所編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可作為治療該類基底節(jié)鈣化的藥物靶點(diǎn)。此外，本發(fā)明還提供了用于特發(fā)性基底節(jié)鈣化疾病診斷的試劑盒，以及變異的人類SLC20A2基因在制備人類特發(fā)性基底節(jié)鈣化疾病基因診斷芯片中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102888406SQ201110207219
公開日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2011年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月22日
發(fā)明者劉靜宇, 張學(xué), 王程, 李雨雷, 石磊, 任杰 申請(qǐng)人:武漢淘智生命科技有限公司