專利名稱：一種乳酸菌亞硝酸鹽還原酶的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)，具體涉及一種乳酸菌亞硝酸鹽還原酶的發(fā)酵生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
亞硝酸鹽是我國近年來食物中毒的主要化學(xué)致病因子之一。亞硝酸鹽被吸收進(jìn)入血液后，可使正常的血紅蛋白中狗2+氧化成狗3+，使血紅蛋白失去攜氧功能，出現(xiàn)組織缺氧， 甚至導(dǎo)致缺氧窒息。亞硝酸鹽還是強(qiáng)致癌物亞硝胺的前體物質(zhì)，潛在著致癌危害。它與胃癌、肝癌、食道癌發(fā)生有密切關(guān)系。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，癌癥高發(fā)區(qū)居民飲水中亞硝酸鹽含量高于低發(fā)區(qū)。目前，一些地區(qū)由于大量使用氮肥、以及使用工業(yè)廢水和生活污水灌溉，致使水中亞硝酸鹽污染嚴(yán)重，致使這些地區(qū)蔬菜、糧食、飼料中亞硝酸鹽超標(biāo)也較普遍。此外，我國傳統(tǒng)腌泡菜、各種肉灌腸中一直存在亞硝酸鹽超標(biāo)問題。鑒于食物中亞硝酸鹽的危害嚴(yán)重，人們在努力尋找降低和去除食品亞硝酸鹽的新途徑。亞硝酸鹽還原酶是催化亞硝酸鹽還原的一類酶，可用于消除食品與飼料中亞硝酸鹽。 從食品安全角度出發(fā)，開發(fā)乳酸菌亞硝酸鹽還原酶用來降低和消除食品中亞硝酸鹽的殘留具有廣闊前景和安全優(yōu)勢。MRS培養(yǎng)基是目前可用于發(fā)酵生產(chǎn)乳酸菌亞硝酸鹽還原酶的培養(yǎng)基。MRS用胰蛋白胨，牛肉膏，酵母膏，檸檬酸銨，葡萄糖，乙酸鈉；硫酸鎂，硫酸錳等多種成分組成。一般MRS種子液體培養(yǎng)基和液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方是胰蛋白胨10g，牛肉膏10g， 酵母膏5g，檸檬酸銨2 g，葡萄糖20g，KH2PO4 2g，乙酸鈉5g，吐溫80 lmL，硫酸鎂0.5 g，硫酸錳0.2g，水1000mL。該配方組分多、成本比較高，制備比較復(fù)雜。由此造成乳酸菌亞硝酸鹽還原酶生產(chǎn)成本高，制備過程復(fù)雜等問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了解決上述的技術(shù)問題而提供一種以較廉價農(nóng)產(chǎn)品即白菜、西紅柿汁作為種子及發(fā)酵培養(yǎng)基來生產(chǎn)乳酸菌亞硝酸鹽還原酶的生產(chǎn)方法，該生產(chǎn)方法具有原料易得，可大大節(jié)省生產(chǎn)成本，且生產(chǎn)過程簡單。本發(fā)明技術(shù)方案
一種乳酸菌亞硝酸鹽還原酶的生產(chǎn)方法，包括下列步驟 (1)、菌種活化
將-20°c以下冰箱保存的乳酸菌用常規(guī)MRS液體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)2 3代； 所述的乳酸菌包括植物乳桿菌{Lactobacillus plantarun)、短乳桿菌 (Lactobacillus brevis)> 1 Il 片球菌(Pediococcus pentosaceus) > 明串球菌 (Leuconostoc)等乳酸菌；
所述的MRS液體培養(yǎng)基即乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基，用來培養(yǎng)乳酸菌，使用發(fā)明者的名字來命名的，即發(fā)明者de Man, Rogosa and Sharp的第一個字母；(2)、將步驟(1)活化后的乳酸菌按接種量3 6% (V/V)接種于種子培養(yǎng)基中，在溫度33 37°C下培養(yǎng)10 15 h，獲得生產(chǎn)菌種；
所述種子培養(yǎng)基由白菜汁、西紅柿汁和水組成，其中還含有0. 2 0. 3g/100mL KH2PO4 ； 其中白菜汁、西紅柿汁和水按體積比即白菜汁西紅柿汁水為0. 35 0. 50 0. 35 0. 40 0. 10 0. 30 ；
培養(yǎng)基于121°C滅菌15 min ； 所述的白菜汁通過如下方法制備
取新鮮白菜，加等量的水用高速組織打碎機(jī)中打碎，再用2層紗布過濾，所得的汁液即為白菜汁；
所述的番茄汁通過如下方法制備
取新鮮番茄清洗，于95°C水中熱燙3 5 min，去皮，用組織搗碎機(jī)攪碎，再用2層紗布過濾，所得的汁液即為番茄汁；
(3)、將步驟(2)所得的生產(chǎn)菌種按接種量為5 10% (V/V)接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在 33 37°C培養(yǎng)Mh，獲得乳酸菌發(fā)酵液；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基由白菜汁、西紅柿汁和水組成，其中還含有0. 2 0. 6g/100mL KH2PO4 ； 白菜汁、西紅柿汁和水按體積比即白菜汁西紅柿汁水為0. 35 0. 50 0. 35 0. 40 0. 10 0. 30 ；
培養(yǎng)基于121°C滅菌15min ； 所述的白菜汁通過如下方法制備
取新鮮白菜，加等量的水用高速組織打碎機(jī)中打碎，再用2層紗布過濾，所得的汁液即為白菜汁；
所述的番茄汁通過如下方法制備
取新鮮番茄清洗，于95°C水中熱燙3 5 min，去皮，用組織搗碎機(jī)攪碎，再用2層紗布過濾，所得的汁液即為番茄汁；
(4)、用氫氧化鈉調(diào)節(jié)步驟(3)所得的乳酸菌發(fā)酵液的pH值為6.3 6. 5，再添加0. 4 0. 6mg/mL亞硝酸鈉，在37°C培養(yǎng)32 48 h，獲得乳酸菌亞硝酸鹽還原酶發(fā)酵液；
(5)、通過常規(guī)的提取分離酶的方法從步驟(4)所得的乳酸菌亞硝酸鹽還原酶發(fā)酵液提取亞硝酸鹽還原酶，即離心收集菌體；
將菌體懸浮于濃度為20mM，pH為7. 0的磷酸緩沖液使用超聲波細(xì)胞破碎法，其工作參數(shù)為功率600 w，超聲時間lOmin，占空比為& :2s，然后離心收集上清液，向上清液加硫酸銨粉末使達(dá)到30%飽和度，離心收集上清液，再加硫酸銨粉末使達(dá)到60%飽和度使酶蛋白析出，用蒸餾水對酶蛋白沉淀透析得透析液；
(6)、將步驟(5)所得的透析液用聚乙二醇粉末濃縮5-6倍，冷凍干燥即得到亞硝酸鹽還原酶。本發(fā)明生產(chǎn)的乳酸菌亞硝酸鹽還原酶可用于除去食品、飼料和環(huán)境中的亞硝酸鹽殘留，提高食品安全質(zhì)量。本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明的一種乳酸菌亞硝酸鹽還原酶的生產(chǎn)方法，由于利用白菜和西紅柿汁代替?zhèn)鹘y(tǒng)的原料組份多、成本比較高，制備比較復(fù)雜的MRS培養(yǎng)基進(jìn)行乳酸菌亞硝酸鹽還原酶的種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)，因此，不僅能大大降低生產(chǎn)成本，而且本發(fā)明的生產(chǎn)方法也比傳統(tǒng)的使用MRS培養(yǎng)基的生產(chǎn)方法具有生產(chǎn)工藝簡單，操作更加簡便等優(yōu)點。


圖1是亞硝酸鈉含量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)描述，但并不限制本發(fā)明。本發(fā)明的實施例中所用的乳酸菌為植物乳桿菌{Lactobacillus plantarun), 短_1 桿菌(Lactobacillus brevis)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus) > BJ Φlif
洲COZ7O1SiOC人均從上海工業(yè)微生物所購買。本發(fā)明的實施例中所用的種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基中所用的白菜汁、西紅柿汁的制備方法如下
番茄汁
取新鮮番茄清洗，于95°C水中熱燙3 5 min，去皮，用組織搗碎機(jī)攪碎，再用2層紗布過濾，取汁液，即為番茄汁； 白菜汁
取新鮮白菜，加等量的水用高速組織打碎機(jī)中打碎，再用2層紗布過濾，取汁液即為白菜汁。亞硝酸鹽還原酶酶活測定方法(見Ldal S. Morita Y. phlant Cell physiol 1973.14:561)
測定過程所用的溶液為
(1)、0.1 mol / L Tris-HCl,ImL, pH7.5 ；
(2)、0.01 mol / L NaNO2,0. 3mL ；
(3)、0.02 mol / L C12H14C12N2,0. ImL ；
(4)、0.12mol / 1 NADPH，0. ImL ；
(5)、本發(fā)明所得的一種乳酸菌亞硝酸鹽還原酶，lmg/mL，0.5mL,
先將ImL的Tris-HCl、0. 3mL的NaN02、0. 3mL的C12HwC12N2 3種溶液加入試管，再加入本發(fā)明所得的一種乳酸菌亞硝酸鹽還原酶0. 5 mL，然后加入0. 1 mL的NADPH液在30. 0 下保溫20min，取出搖動至無色時立即吸出0. ImL反應(yīng)液，加入5. 9ml去離子水中，再加入1 mL對氨基苯磺酸和1 mL鹽酸萘乙二胺顯色，置半小時后在538 nm波長下比色測定亞硝酸鹽的變化，將所得數(shù)據(jù)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，求出亞硝酸鈉的含量后，通過如下公式計算酶活。上述測定過程中以等量的蒸餾水代替本發(fā)明所得的一種乳酸菌亞硝酸鹽還原酶，按上述方法處理，做空白對照。酶活計算公式如下。
Y:酶活力(U)
U為酶的活力單位，IU=I μ g亞硝酸鹽/mL. h即每小時降解1 μ g亞硝酸鈉的酶量為一個酶活力單位；
Xl 亞硝酸鈉初始值(ug/mL)； X2 亞硝酸鈉剩余值(ug/mL)； t 酶催化時間(h)； 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
準(zhǔn)確稱取0. IOOOg于干燥器中干燥24h的亞硝酸鈉，加水溶解移入500mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。此溶液每毫升相當(dāng)于200ug的亞硝酸鈉。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
準(zhǔn)確吸取0，0. 2，0. 4，0. 6，0. 8，1. 0，1. 5，2. 0，2. 5mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液(相當(dāng)于0,1, 2,3,4. 5,7. 5，10，12. 5ug亞硝酸鈉)，分別置于50mL容量瓶中，加水40mL左右，搖勻，滴加 2mL對氨基苯磺酸溶液，混勻，避光靜置3min，再加入ImL鹽酸萘乙二胺溶液，定容至50mL， 混勻，避光靜置15min，在波長538nm處測定吸光值，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)作亞硝酸鈉含量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。本發(fā)明除培養(yǎng)基外所使用的各種原料亞硝酸鈉、NADPH、C12H14C12N2、鹽酸萘乙二胺、對氨基苯磺酸、均為分析純，由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。實施例1
(1)、菌種活化
將植物乳桿菌按5%接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，在30°C條件下培養(yǎng)24h得第一代菌種，再將第一代菌種以3% (V/V)接種量接到MRS培養(yǎng)基，在30°C培養(yǎng)24h得第二代菌種；
(2)、將步驟(1)所得的第二代菌種以5%(V/V)接種量接到種子培養(yǎng)基中，在溫度33 37°C下培養(yǎng)10-15 h，獲得生產(chǎn)菌種；
所述種子培養(yǎng)基由白菜汁、西紅柿汁和水組成，白菜汁、西紅柿汁和水按體積比計算， 即白菜汁西紅柿汁水為0. 35 0. 35 0. 30，其中還含有0. 2 0. 3g/100mL KH2PO4,培養(yǎng)基于121°C滅菌15 min ；
(3)、將步驟(2)所得的生產(chǎn)菌種以5%(V/V)接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在33°C培養(yǎng) Mh，獲得乳酸菌發(fā)酵液；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基由白菜汁、西紅柿汁和水組成，白菜汁、西紅柿汁和水按體積比計算， 即白菜汁西紅柿汁水比例為0. 35 0. 35 0. 30，其中還含有0. 2 0. 6g/100mL KH2PO4 ； 培養(yǎng)基于121°C滅菌15min ；
(4)、用lmol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)步驟(3)所得的乳酸菌發(fā)酵液的pH值至6.3，再添加 0. 4mg/mL NaNO2，在37°C培養(yǎng)32 h，獲得乳酸菌亞硝酸鹽還原酶發(fā)酵液；
(5)、通過常規(guī)的提取分離酶的方法從步驟(4)所得的乳酸菌亞硝酸鹽還原酶發(fā)酵液提取亞硝酸鹽還原酶，即離心收集菌體；
將菌體懸浮于濃度為20mM，pH為7. 0的磷酸緩沖液中，在冰水浴中用常規(guī)超聲波細(xì)胞破碎法進(jìn)行細(xì)胞破碎，控制功率為600w，時間8min，然后離心收集上清液，向上清液加硫酸銨粉末使達(dá)到30%飽和度，離心收集上清液，再加硫酸銨粉末使達(dá)到60%飽和度使酶蛋白析出，用蒸餾水對酶蛋白沉淀透析得透析液；
7(6)、將步驟(5)所得的透析液用聚乙二醇粉末濃縮5倍，冷凍干燥即得到亞硝酸鹽還原酶，經(jīng)測定酶活為2. IXlO3U /g。實施例2
(1)、菌種活化
將短乳桿菌按5%接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，在30°C條件下培養(yǎng)24h得第一代菌種， 再將一代菌種以5% (V/V)接種量接到MRS培養(yǎng)基，在30°C培養(yǎng)24h得第二代菌種；
(2)、將步驟(1)所得的第二代菌種以5%(V/V)接種量接到種子培養(yǎng)基中，在溫度37°C 下培養(yǎng)15 h，獲得生產(chǎn)菌種；
所述種子培養(yǎng)基由白菜汁、西紅柿汁和水組成，其中還含有0. 3g/100mL KH2PO4 ； 白菜汁、西紅柿汁和水的比例為0. 50 0. 40 0. 10 ； 培養(yǎng)基于121°C滅菌15 min ；
(3)、將步驟(2)所得的生產(chǎn)菌種以10%(V/V)接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在35°C培養(yǎng)Mh，獲得乳酸菌發(fā)酵液；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基由白菜汁、西紅柿汁和水組成，其中還含有0. 6g/100mLKH2P04 ； 白菜汁、西紅柿汁和水的比例為0. 50 0. 35 0. 15 培養(yǎng)基于121°C滅菌15min ；
(4)、用lmol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)步驟(3)所得的乳酸菌發(fā)酵液的pH值至6.5，再添加 0. 6mg/mL NaNO2，在37°C培養(yǎng)48 h，獲得乳酸菌亞硝酸鹽還原酶發(fā)酵液；
(5)、通過常規(guī)的提取分離酶的方法從步驟(4)所得的乳酸菌亞硝酸鹽還原酶發(fā)酵液提取亞硝酸鹽還原酶，即離心收集菌體；
將菌體懸浮于濃度為20mM，pH為7. 0的磷酸緩沖液中，在冰水浴中用常規(guī)超聲波細(xì)胞破碎法進(jìn)行細(xì)胞破碎，控制功率為600w，時間8min，然后離心收集上清液，向上清液加硫酸銨粉末使達(dá)到30%飽和度，離心收集上清液，再加硫酸銨粉末使達(dá)到60%飽和度使酶蛋白析出，用蒸餾水對酶蛋白沉淀透析得透析液；
(6)、將步驟(5)所得的透析液用聚乙二醇粉末濃縮6倍，冷凍干燥即得到亞硝酸鹽還原酶，經(jīng)測定酶活為2. 5 X IO3U /g。應(yīng)用實施例1
選取經(jīng)室溫保持半年的市售腌制臘肉，稱取5g的倒入高速組織勻漿搗碎機(jī)中，加入 IOOml去離子水，12，000r/min運(yùn)行;3min，然后將勻漿液全部倒入三角瓶中，密封靜置lh， 取10 ml 3，000離心lOmin，吸取5ml上清采用國標(biāo)法(中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/T 5009. 33 — 2003,食品中亞硝酸鹽和硝酸鹽的測定·北京，2003年·)測定亞硝酸鈉含量。結(jié)果，臘肉中的亞硝酸鈉含量最高到達(dá)42. 8 mg/kg(比1996國家標(biāo)準(zhǔn)高出42. 6%)； 我國1996年頒布的《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定肉制品不得超過30mg/kg。稱取40g臘肉倒入高速組織勻漿搗碎機(jī)中，加入IOOml去離子水，12，000r/min運(yùn)行3min，然后將勻漿液全部倒入三角瓶中，加入實施例2所得的亞硝酸鹽還原酶5mg，搖勻， 密封30°C培養(yǎng)12h。吸取5ml測定亞硝酸鈉剩余量，結(jié)果是5. 2 mg/kg。結(jié)果表明本發(fā)明所得的亞硝酸鹽還原酶能有效去除臘肉中亞硝酸鈉。以上所述內(nèi)容僅為本發(fā)明構(gòu)思下的基本說明，而依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案所作的任何等效變換，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種乳酸菌亞硝酸鹽還原酶的生產(chǎn)方法，其特征在于包括如下步驟(1)、菌種活化將-20°c以下冰箱保存的乳酸菌用常規(guī)MRS液體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)2 3代；所述的乳酸菌包括植物乳桿菌{Lactobacillus plantarun)、短乳桿菌 (Lactobacillus brevis)> 戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)或明串球菌 (Leuconostoc)；(2)、將步驟(1)活化后的乳酸菌按接種量3 6% (V/V)接種于種子培養(yǎng)基中，在溫度33 37°C下培養(yǎng)10-15 h，獲得生產(chǎn)菌種；所述種子培養(yǎng)基由白菜汁、西紅柿汁和水組成，其中還含有0. 2 0. 3g/100mL KH2PO4, 于 121°C 滅菌 15min ；其中白菜汁、西紅柿汁和水按體積比即白菜汁西紅柿汁水為0. 35 0. 50 0. 35 0. 40 0. 10 0. 30 ；(3)、將步驟(2)所得的生產(chǎn)菌種按接種量為5 10% (V/V)接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在 33 37°C培養(yǎng)Mh，獲得乳酸菌發(fā)酵液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基由白菜汁、西紅柿汁和水組成，其中還含有0. 2 0. 6g/100mL KH2PO4, 于 121°C 滅菌 15min ；白菜汁、西紅柿汁和水按體積比即白菜汁西紅柿汁水為0. 35 0. 50 0. 35 0. 40 0. 10 0. 30 ；(4)、用氫氧化鈉調(diào)節(jié)步驟(3)所得的乳酸菌發(fā)酵液的pH值為6.3-6. 5，再添加0. 4 0. 6mg/mL亞硝酸鈉，在37°C培養(yǎng)32 48h，獲得乳酸菌亞硝酸鹽還原酶發(fā)酵液；(5)、通過常規(guī)的提取分離酶的方法從步驟(4)所得的乳酸菌亞硝酸鹽還原酶發(fā)酵液提取亞硝酸鹽還原酶，即離心收集菌體；將菌體懸浮于濃度為20mM，pH為7. 0的磷酸緩沖液中，在冰水浴中用常規(guī)超聲波細(xì)胞破碎法進(jìn)行細(xì)胞破碎，超聲過程控制功率600w，時間8 min，然后離心收集上清液，向上清液加硫酸銨粉末使達(dá)到30%飽和度，離心收集上清液，再加硫酸銨粉末使達(dá)到60%飽和度使酶蛋白析出，用蒸餾水對酶蛋白沉淀透析得透析液；(6)、將步驟(5)所得的透析液用聚乙二醇粉末濃縮5-6倍，冷凍干燥即得到亞硝酸鹽還原酶。
2.如權(quán)利要求1所述的一種乳酸菌亞硝酸鹽還原酶的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟(2)中所述的種子培養(yǎng)基中所述的白菜汁的制備方法為取新鮮白菜，加等量的水用高速組織打碎機(jī)中打碎，再用2層紗布過濾，所得的汁液即為白菜汁；所述的番茄汁的制備方法為取新鮮番茄清洗，于95°C水中熱燙3 5min，去皮，用組織搗碎機(jī)攪碎，再用2層紗布過濾，所得的汁液即為番茄汁。
3.如權(quán)利要求1或2所述的一種乳酸菌亞硝酸鹽還原酶的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟 (3)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中所述的白菜汁的制備方法為取新鮮白菜，加等量的水用高速組織打碎機(jī)中打碎，再用2層紗布過濾，所得的汁液即為白菜汁；所述的番茄汁的制備方法為取新鮮番茄清洗，于95°C水中熱燙3 5 min，去皮，用組織搗碎機(jī)攪碎，再用2層紗布過濾，所得的汁液即為番茄汁。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種乳酸菌亞硝酸鹽還原酶的生產(chǎn)方法，即將乳酸菌用MRS液體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)2～3代后所得的活化菌種用白菜汁與西紅柿汁等組成的種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)后獲得乳酸菌發(fā)酵液，將乳酸菌發(fā)酵液用氫氧化鈉調(diào)pH值至6.3-6.5，再添加0.4～0.6mg/mL亞硝酸鈉，37℃培養(yǎng)32～48h后得到的乳酸菌亞硝酸鹽還原酶發(fā)酵液離心分離收集菌體，再進(jìn)一步破碎菌體細(xì)胞，收上清液，再經(jīng)沉淀、透析、冷凍干燥等步驟最終得到亞硝酸鹽還原酶。本發(fā)明的一種乳酸菌亞硝酸鹽還原酶的生產(chǎn)方法，不僅生產(chǎn)成本低，而且具有生產(chǎn)工藝簡單，操作更加簡便等優(yōu)點。
文檔編號C12R1/24GK102286438SQ20111020797
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月25日
發(fā)明者丁少南, 何婷婷, 呂玉濤, 管世敏, 龔鋼明 申請人:上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院