專利名稱：家蠅對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑代謝抗性的分子檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及家蠅對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類代謝抗性的分子檢測(cè)方法，適合用于家蠅對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑由CYP6D1V1介導(dǎo)的代謝抗性的快速檢測(cè)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
家蠅(Musca domestica)是一種重要的疾病傳媒,據(jù)報(bào)道它可以傳播100多種人畜疾病。家蠅也是重要的畜牧業(yè)害蟲(chóng)，家蠅的發(fā)生可以導(dǎo)致畜禽產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量的降低。因此家蠅種群的控制對(duì)于人類的健康和國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展都具有十分重要的意義。家蠅的防治長(zhǎng)期以來(lái)主要依賴化學(xué)農(nóng)藥，抗藥性問(wèn)題突出。抗藥性導(dǎo)致殺蟲(chóng)劑殺蟲(chóng)效率的下降，由此引發(fā)諸如殺蟲(chóng)劑使用次數(shù)和劑量增加，蟲(chóng)媒人畜疾病的流行等問(wèn)題已給人類帶來(lái)巨大損失。擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑(如溴氰菊酯)已廣泛用于家蠅的防治，家蠅對(duì)這類殺蟲(chóng)劑普 遍產(chǎn)生了抗性?？顾幮缘臋z測(cè)是科學(xué)制定有效的防治措施的前提，對(duì)減少化學(xué)藥劑對(duì)環(huán)境的污染和合理制定抗藥性治理具有重要的指導(dǎo)意義。家蠅對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類的抗性的檢測(cè)常采用生物測(cè)定，這種方法存在如下缺點(diǎn)(I)試驗(yàn)周期長(zhǎng)一般需要24小時(shí)以上才能得到結(jié)果；(2)對(duì)試蟲(chóng)的數(shù)量和質(zhì)量要求高為保證生測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要使用特定生理狀態(tài)的試蟲(chóng)；(3)難于檢測(cè)早期抗性和預(yù)測(cè)抗性的發(fā)展趨勢(shì)生物測(cè)定的方法只能記錄殺蟲(chóng)劑劑量和試蟲(chóng)死亡率的信息,而無(wú)法測(cè)定個(gè)體的基因型。近年來(lái)，隨著對(duì)家蠅抗藥性抗性分子機(jī)制的了解，國(guó)內(nèi)外開(kāi)始嘗試家蠅抗性的分子檢測(cè)技術(shù)的研究。研究表明，細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的代謝解毒作用增強(qiáng)是家蠅對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類抗性的主要機(jī)制。在高抗性的家蠅品系如美國(guó)的LPR品系和中國(guó)的BJD品系，抗性都與家蠅的CYP6Dlvl等位基因相關(guān)聯(lián)，CYP6Dlvl抗性等位基因的序列特點(diǎn)是其5’啟動(dòng)子區(qū)存在一段15bp的插入片段。進(jìn)一步的研究結(jié)果表明CYP6Dlvl這一等位基因在美國(guó)和中國(guó)的自然家蠅種群中也普遍存在。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是針對(duì)目前家蠅對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑代謝抗性檢測(cè)方法的周期長(zhǎng)、對(duì)試蟲(chóng)的數(shù)量和質(zhì)量要求高，難于檢測(cè)早期抗性和預(yù)測(cè)抗性的發(fā)展趨勢(shì)的不足，提供一種高效、快速、對(duì)材料要求低、需要生物材料少的家蠅由細(xì)胞色素P450 CYP6Dlvl介導(dǎo)的對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑代謝抗性的分子檢測(cè)方法，從而能夠有效殺蠅，減少傳染疾病的傳播。針對(duì)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下—方面，本發(fā)明提供一種家蠅對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑代謝抗性分子檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟步驟I :單頭豕妮基因組DNA的提??；步驟2 :家蠅CYP6Dlvl抗性等位基因的分子檢測(cè)。優(yōu)選地，所述家蠅CYP6Dlvl抗性等位基因的序列如SEQ ID NO : I的序列所示。
優(yōu)選地，所述步驟2中通過(guò)PCR擴(kuò)增進(jìn)行CYP6Dlvl抗性等位基因分子檢測(cè)。優(yōu)選地，所述PCR擴(kuò)增中所用的特異引物為qxh6dlF 5/ -ATTTGCCCCGTCATTTACAA-3'qxh6dlR 5/ -GCCGGCTTGAAGAACAAATA-3'。另一方面，本發(fā)明提供一種用于家蠅對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑代謝抗性分子檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包括單頭家蠅基因組DNA提取的試劑；及家蠅CYP6Dlvl抗性等位基因分子檢測(cè)的試劑。優(yōu)選地，所述家蠅CYP6Dlvl抗性等位基因的序列如SEQ ID NO : I的序列所示。優(yōu)選地，用于對(duì)家蠅CYP6Dlvl抗性等位基因的分子檢測(cè)的試劑包括以下特異引物 qxh6dlF 5/ -ATTTGCCCCGTCATTTACAA-3'qxh6dlR 5/ -GCCGGCTTGAAGAACAAATA-3'。再一方面，本發(fā)明提供一種用于家蠅對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑代謝抗性檢測(cè)的試劑盒在家蠅對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑代謝抗性分子檢測(cè)中的應(yīng)用。本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明建立的抗性分子檢測(cè)技術(shù)與傳統(tǒng)生物測(cè)定相比具有如下優(yōu)點(diǎn)⑴需要生物材料少，數(shù)量在50-200頭就可以滿足檢測(cè)要求；(2)對(duì)材料的要求低可以采用任何蟲(chóng)態(tài)的試蟲(chóng)，可以用活體，也可以用保存的樣品，可以用整頭家蠅，也可以用蟲(chóng)體的某一部位(如雙翅)；(3)可以區(qū)分種群的雜/純合狀態(tài)有利預(yù)測(cè)種群抗性基因頻率的變化趨勢(shì)，便于抗性的早期診斷；(4)快速?gòu)腄NA的提取到PCR產(chǎn)物的檢測(cè)，數(shù)小時(shí)就可以完成。本發(fā)明提供了的方法準(zhǔn)確性高運(yùn)用限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA序列設(shè)計(jì)的特異性，結(jié)果的準(zhǔn)確性高。


以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中圖I為單頭家蠅PCR擴(kuò)增的試驗(yàn)結(jié)果示意圖，圖中1-6為PCR擴(kuò)增的樣品，M為DNA分子量標(biāo)記(DNA Marker)；圖2為單頭家蠅CYP6Dlvl抗性等位基因檢測(cè)的試驗(yàn)結(jié)果示意圖，圖中SS為敏感純合子；SR為雜合子；RR為抗性純合子⑷為IOObp DNA分子量標(biāo)記(DNA Marker)；圖3為北京自然種群家蠅樣品CYP6Dlvl抗性等位基因檢測(cè)的試驗(yàn)結(jié)果示意圖，圖中1-10為樣品，M為IOObp DNA分子量標(biāo)記(DNA Marker)；圖4為吉林長(zhǎng)春自然種群家蠅樣品CYP6Dlvl抗性等位基因檢測(cè)的試驗(yàn)結(jié)果示意圖，圖中1-10為檢測(cè)樣品，M為IOObp DNA分子量標(biāo)記(DNAMarker)；圖5為山東濟(jì)南自然種群家蠅樣品CYP6Dlvl抗性等位基因檢測(cè)的試驗(yàn)結(jié)果示意圖，圖中1-15為檢測(cè)樣品，M為IOObp DNA分子量標(biāo)記(DNAMarker)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I 單頭家蠅基因組DNA的提取(參考 Rinkevich FD et al. Frequencies of the pyrethroid resistancealleles of Vsscland CYP6Dlin house flies from the eastern United States. InsectMolecular Biology (2006)，15 (2)，157-167)本發(fā)明所用家蠅分別為實(shí)驗(yàn)室保存的擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑敏感純合品系(SS)、抗性純合品系(RR基因型)、敏感與抗性品系的雜交一代雜合子(SR基因型)，前述家蠅品系為BJD系，均可得自中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所(北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院-5號(hào))，以及分別采自山東、北京與吉林的野生家蠅，也可得自中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所。I.單頭家蠅基因組DNA的提取方法(參考Rinkevich et al 2006)(I)取單頭家蠅(去腹部)置于1.5mL體積的離心管(印pendorf管)中，加入
0.5mL裂解緩沖液，碾磨將蟲(chóng)體搗碎，置60度溫浴，20分鐘后取出；(2)加75 μ L的8Μ醋酸鉀，混勻，置冰上10分鐘； (3) 14000g離心5min，取400 μ L上清液(避免取到沉淀)轉(zhuǎn)至新的離心管；(4)加入800 μ L (上清液的2倍體積)100%冰冷乙醇，室溫放置IOmin ；(5)離心10分鐘，棄上清，沉淀用0. 5mL70%乙醇清洗；(6)離心5分鐘,沉淀干燥后,加入50 μ L水重溶。制備的DNA樣品可直接用于后續(xù)的PCR，也可以將樣品保存在4°C下備用，或在-20°C條件下長(zhǎng)期保存。以上方法中使用的試劑配制方法如下(I)溶液A :含 IOOmM Tris HCl pH 8. O, IOmM EDTA, 50mM NaCl (高壓滅菌，室溫保存)；(2) 0. 15M 精胺(spermine)(過(guò)濾滅菌，分裝保存在 _20°C ) ； (Fluka 公司)(3) 0. 5M亞精胺(spermidine)(過(guò)濾滅菌,分裝保存在_20°C ) ； (Fluka公司)(4) 20mg/mL蛋白酶K(過(guò)濾滅菌,分裝保存在-20°C ) ； (Merck公司)(5)10% SDS，用溶液A配制，無(wú)須滅菌；(6) 8M醋酸鉀(室溫保存，IOOmL水中溶解醋酸鉀78. 51g)；(7)裂解緩沖液(現(xiàn)配現(xiàn)用):為溶液A含I % SDS ；0. 15mM精胺，O. 5mM亞精胺和
0.lmg/mL(20U/mg)蛋白酶 K。實(shí)施例2 CYP6Dlvl抗件等位基因檢測(cè)采用PCR-RFLP方法，分兩步，第一步為PCR，第二步酶切。(I)設(shè)計(jì)特異引物qxh6dlF 5/ -ATTTGCCCCGTCATTTACAA-3' (SEQ ID NO :3)qxh6dlR 5/ -GCCGGCTTGAAGAACAAATA-3' (SEQ ID NO :4)。(2) PCR PCR 反應(yīng)體系 20 μ L，含 IOxbuffer 2. O μ L, dNTP(各 2. 5mM 混合物)1.5 μ L，引物(10 μ Μ) qxh6dlF O. 5 μ L，qxh6dlR 0. 5 μ L ;家蠅基因組 DNA 2μ L ； Taq SIO. 5μ L(tiangen)，滅菌水 8· 5μ L。PCR 條件94°C 3min，30 循環(huán) 94°C 30s, 57°C 30s, 72°C45s)，延伸72°C 5min。取5yL PCR產(chǎn)物2. 0%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，在約470bp處有條帶(圖I)。⑶酶切取 2_δμ L 的 DNA 產(chǎn)物，加 Buffer 4 (New England BioLabs) 2. O μ L,Hpy188 III (New England BioLabs) 0. 2 μ L, 100X BSA (New England BioLabs) 0. 2 μ L,加滅菌水至20 μ L，37°C溫育1-2小時(shí)。取10 μ L酶切產(chǎn)物在2. 0%瓊脂糖凝膠電泳，紫外檢測(cè)。
(4)結(jié)果解讀如圖2所示,如果在476bp—條帶,為抗性純合，即家蠅CYP6Dlvl抗性等位基因(如SEQ ID N0:1所示);如果在476bp、328bp、133bp有三條帶，為雜合型；如果在328bp和133bp有條帶，為敏感基因型(如SEQ ID NO 2所示)。具體試駘實(shí)施例試駘實(shí)施例I取北京自然種群家蠅樣品1-10按上述實(shí)施例所述方法進(jìn)行檢測(cè)，如圖3所示，除7號(hào)樣品為雜合體外，其它樣品為敏感純合個(gè)體。試駘實(shí)施例2取吉林長(zhǎng)春自然種群家蠅樣品1-10，并以實(shí)驗(yàn)室保存的擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑純合品系(SS)、抗性純合品系(RR基因型)、敏感與抗性品系的雜交一代雜合子(SR基因型)為 對(duì)照，按上述實(shí)施例所述方法進(jìn)行檢測(cè)，如圖4所示,樣品2、3、4、6、8、9、13、14、15為敏感純合基因型個(gè)體；樣品1、5、7、10、11、12位雜合基因型個(gè)體。試駘實(shí)施例3取山東濟(jì)南自然種群家蠅樣品1-10按上述實(shí)施例所述方法進(jìn)行檢測(cè)，并以實(shí)驗(yàn)室保存的擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑純合品系(SS)、抗性純合品系(RR基因型)、敏感與抗性品系的雜交一代雜合子(SR基因型)為對(duì)照，如圖5所示，所有檢測(cè)的山東樣品為敏感(SS)純
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權(quán)利要求
1.一種家蠅對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑代謝抗性分子檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟 步驟I :單頭家蠅基因組DNA的提??； 步驟2 :家蠅CYP6Dlvl抗性等位基因的分子檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分子檢測(cè)方法，其特征在于，所述家蠅CYP6Dlvl抗性等位基因的序列如SEQ ID NO I的序列所不。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟2中通過(guò)PCR擴(kuò)增進(jìn)行CYP6Dlvl抗性等位基因分子檢測(cè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分子檢測(cè)方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增中所用的特異引物為qxh6dlF 5/ -ATTTGCCCCGTCATTTACAA-3'qxh6dlR 5/ -GCCGGCTTGAAGAACAAATA-3'。
5.一種用于家蠅對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑代謝抗性分子檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包括單頭家蠅基因組DNA提取的試劑；及家蠅CYP6Dlvl抗性等位基因分子檢測(cè)的試劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述家蠅CYP6Dlvl抗性等位基因的序列如SEQ ID NO 1的序列所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的試劑盒，其特征在于，用于對(duì)家蠅CYP6Dlvl抗性等位基因的分子檢測(cè)的試劑包括以下特異引物qxh6dlF 5/ -ATTTGCCCCGTCATTTACAA-3'qxh6dlR 5/ -GCCGGCTTGAAGAACAAATA-3'。
8.權(quán)利要求5至7任一項(xiàng)所述的試劑盒在家蠅對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑代謝抗性分子檢測(cè)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種家蠅對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑代謝抗性分子檢測(cè)方法及試劑盒，所述方法包括以下步驟單頭家蠅基因組DNA的提??；家蠅CYP6D1v1抗性等位基因的分子檢測(cè)；所述試劑盒包括單頭家蠅基因組DNA提取的試劑；及家蠅CYP6D1v1抗性等位基因分子檢測(cè)的試劑。本發(fā)明的方法需要生物材料少；對(duì)材料的要求低；可以區(qū)分種群的雜/純合狀態(tài)有利預(yù)測(cè)種群抗性基因頻率的變化趨勢(shì)，便于抗性的早期診斷；快速、準(zhǔn)確。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102899391SQ20111021197
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2011年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月27日
發(fā)明者邱星輝, 李梅, 邸妙詞, 潘婧, 周云輝 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所