專利名稱：一種雞傳染性法氏囊病基因工程亞單位疫苗的制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程和免疫學(xué)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種雞傳染性法氏囊病基因工程亞單位疫苗的制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
傳染性法氏囊病anfectious bursal disease, IBD)是一種由傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)引起的急性、高度接觸性傳染病，常導(dǎo)致雞群的大量死亡，同時(shí)導(dǎo)致免疫抑制，使得雞群疫苗接種免疫失敗和繼發(fā)、并發(fā)疾病大量增加，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。該病已成為危害我國養(yǎng)雞業(yè)最嚴(yán)重、最棘手的傳染病，目前沒有特效藥物治療。目前常用的防治手段是疫苗接種，包括減毒疫苗和滅活疫苗，但自IBDV發(fā)現(xiàn)至今，新的變異株、強(qiáng)毒株、超強(qiáng)毒株不斷出現(xiàn)，分子結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致病毒致病力的改變及宿主對(duì)疫苗應(yīng)答的改變，使得傳統(tǒng)的疫苗已不能控制其流行，給疾病的預(yù)防與治療帶來新的困難與挑戰(zhàn)。近年來，我國養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展迅速，特別是規(guī)?；B(yǎng)雞場的增多、養(yǎng)雞生產(chǎn)水平的提高，每年法氏囊病疫苗的需求也迅速增長，因此急需開發(fā)出一種安全有效的產(chǎn)品，能夠在低成本條件下大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用，以最快速度預(yù)防，控制病毒的傳播，從而保障養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)病毒基因結(jié)構(gòu)與功能的研究深入，傳染性法式囊病病毒基因重組研制日趨成熟，基因工程疫苗已經(jīng)是國內(nèi)外發(fā)展的主要方向。綜合比較各種基因工程疫苗，其中尤以蛋白亞單位疫苗更具獨(dú)特的優(yōu)勢。蛋白亞單位疫苗絕不含活毒成分，生產(chǎn)和使用過程無散毒可能，消除了污染的可能性，是值得積極推廣使用的安全疫
田ο在先專利《200410080065. 8，一種傳染性法氏囊病基因工程亞單位疫苗的制備方法和應(yīng)用》中，亞單位疫苗能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體并有效抵抗病毒的攻擊，但是原核表達(dá)系統(tǒng)需要對(duì)細(xì)胞沉淀進(jìn)行多次凍融超聲破碎等繁雜的程序，以及存在細(xì)菌體內(nèi)可能殘留內(nèi)毒素的危險(xiǎn)，在生產(chǎn)工藝流程簡化以及疫苗的安全性方面受到了限制。在先專利《200510135583. X，雞傳染性法氏囊病病毒VP2cDNA、其表達(dá)載體、所表達(dá)的重組蛋白及應(yīng)用》中，將目的基因VP2進(jìn)行了人工改造、全基因序列合成后在酵母中表達(dá)。但是，該專利中表達(dá)的目的蛋白C端殘留有載體上的一段序列，不具有天然性，且影響了其免疫原性。因此，仍然需要改良雞傳染性法氏囊病基因工程亞單位疫苗的制備技術(shù)，以提高表達(dá)量，獲得免疫原性強(qiáng)的疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種雞傳染性法氏囊病基因工程亞單位(VP》疫苗的制備和應(yīng)用。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種重組表達(dá)雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白亞單位的方法，該方法包括(1)提供改造的VP2蛋白亞單位編碼基因；其中，在所述的VP2蛋白亞單位編碼基因的5’端起始密碼子ATG之前添加蛋白酶KEX2的切割序列，在所述的VP2蛋白亞單位編碼基因的3’端添加終止密碼子序列；(2)將(1)所述的VP2蛋白亞單位編碼基因插入到酵母表達(dá)載體pPICZaA的 α -factor信號(hào)肽編碼序列下游，獲得重組表達(dá)載體；(3)將O)的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母，獲得重組的畢赤酵母細(xì)胞；(4)將(3)的重組的畢赤酵母細(xì)胞進(jìn)行重組表達(dá)，從表達(dá)上清中獲得雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白亞單位。在另一優(yōu)選例中，步驟(1)中，還在所述的蛋白酶KEX2的切割序列的5’端之前添加B10I酶切位點(diǎn)序列；在所述的終止密碼子序列的3’端添加NotI酶切位點(diǎn)序列。在另一優(yōu)選例中，步驟( 中，將所述的VP2蛋白亞單位編碼基因插入到酵母表達(dá)載體pPICZ α A的)(hoI/NotI酶切位點(diǎn)之間。在另一優(yōu)選例中，所述的改造的VP2蛋白亞單位編碼基因的序列如SEQ IDNO :1所
7J\ ο在另一優(yōu)選例中，所述的畢赤酵母是X-33菌株。在另一優(yōu)選例中，將重組表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化畢赤酵母，電轉(zhuǎn)化條件為0.2cm電轉(zhuǎn)杯，電壓2. 0KV,電擊時(shí)間5ms，質(zhì)粒濃度為7-10ug/10 μ L，感受態(tài)細(xì)胞100 μ L ；電轉(zhuǎn)化后快速加入ImL IM山梨糖醇，30°C復(fù)蘇1小時(shí)。在另一優(yōu)選例中，步驟(4)中，表達(dá)條件為采用誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY，培養(yǎng)基PH值為 6. 5 士0. 5，誘導(dǎo)溫度為28. 5士 1°C，甲醇終濃度為0. 5 士0. 2% (ν/ν)。在另一優(yōu)選例中，采用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。較佳地，甲醇的終濃度為0. 5士0. 2% (ν/ν)；更佳地終濃度為0. 5 士0. (ν/ν)。在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白亞單位疫苗的方法，該方法包括以所述的方法獲得雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白亞單位，進(jìn)行乳化的步驟，獲得傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白亞單位疫苗。在另一優(yōu)選例中，將所述的雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白亞單位與白油司本進(jìn)行混合、乳化。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于重組表達(dá)雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白亞單位的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0:1所示。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于獲得所述的多核苷酸的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1、本發(fā)明改造后的VP2基因的cDNA序列。
圖2、重組表達(dá)質(zhì)粒雙酶切鑒定，除了最右側(cè)泳道為DNA Marker,其它泳道均為以 XhoI/NotI進(jìn)行酶切的電泳結(jié)果。圖3、重組表達(dá)質(zhì)粒PCR鑒定，以5’AOX和3’AOX引物擴(kuò)增后獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的電
泳鑒定。圖4、利用目的基因特異性引物進(jìn)行重組表達(dá)質(zhì)粒PCR鑒定的結(jié)果。圖5、重組酵母菌株P(guān)CR鑒定陽性克隆及其表型。圖6、重組VP2蛋白SDS-PAGE鑒定。圖7、重組VP2蛋白免疫印跡鑒定(Western-Blot)。圖8、間接ELISA法測定中和抗體水平的測定結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，優(yōu)化了雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的重組表達(dá)方法，有效提高了 VP2蛋白的表達(dá)產(chǎn)量，確保了表達(dá)產(chǎn)物與天然蛋白的一致性。本發(fā)明的方法工藝簡單、成本低廉，可高效穩(wěn)定地獲得可安全使用的雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白亞單位疫苗。表達(dá)系統(tǒng)以往，人們較多地采用原核表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)VP2蛋白，表達(dá)過程復(fù)雜，難操作，且蛋白產(chǎn)量難以提高。因此，本發(fā)明人致力于開發(fā)新的VP2蛋白表達(dá)系統(tǒng)，以期提高產(chǎn)量，并獲得免疫原性良好的蛋白，從而可直接應(yīng)用于制備疫苗。經(jīng)過多種表達(dá)系統(tǒng)的比較，本發(fā)明人最終選擇了畢赤酵母系統(tǒng)。比較原核細(xì)胞和酵母這兩種宿主細(xì)胞的特性，酵母的優(yōu)勢非常明顯。甲醇畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)能將表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行精確的翻譯后加工修飾，接近于天然蛋白。分泌型酵母表達(dá)載體能將目的蛋白分泌到發(fā)酵上清液中，而酵母自身的本底蛋白大部分都留在細(xì)胞沉淀中，免去了沉淀破碎和純化等繁雜的后續(xù)處理。本發(fā)明的方法獲得的發(fā)酵上清液可不作任何處理直接用于制作亞單位疫苗，結(jié)果表明該蛋白亞單位疫苗能夠有效地刺激雞產(chǎn)生中和抗體。相對(duì)于細(xì)菌等原核系統(tǒng)表達(dá)產(chǎn)物，應(yīng)用酵母生產(chǎn)的疫苗無任何毒副作用，工藝簡單，成本低廉，非常適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明對(duì)這多種酵母菌株都進(jìn)行了轉(zhuǎn)化篩選，根據(jù)轉(zhuǎn)化子生長情況和蛋白表達(dá)量的高低，來選擇最合適的酵母菌株。畢赤酵母常用的菌株有KM71H、GS115、X-33等，都為甲醇營養(yǎng)型酵母菌，在基因組型，外源基因插入時(shí)有不同的整合和重組方式，表達(dá)效果上有不同。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，采用X-33作為重組表達(dá)的宿主菌。基因改造本領(lǐng)域人員均了解，利用重組表達(dá)技術(shù)制備疫苗的關(guān)鍵在于表達(dá)出來的蛋白與天然蛋白具有接近的抗原性，也即重組蛋白最好具備“天然性”。以此為目的，本發(fā)明人對(duì)VP2 蛋白的表達(dá)構(gòu)建物進(jìn)行了序列改進(jìn)。酵母表達(dá)載體pPICZ α A上的α -factor信號(hào)肽包含83個(gè)氨基酸的前導(dǎo)肽及后面的一段由Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala氨基酸序列組成的間隔肽，α -factor成熟信號(hào)肽序列加工分兩步，先是膜結(jié)合蛋白酶KEX2在Lys-Arg*Glu-Ala-Glu-Ala中所示的星號(hào)位置即Arg及Glu之間進(jìn)行切割，接著蛋白酶STE13切割Glu-Ala重復(fù)序列，即序列
5Glu-Ala*Glu-Ala*中星號(hào)所示位置。前導(dǎo)肽和間隔肽對(duì)蛋白的正確切割和分泌至關(guān)重要， 但有時(shí)由于上述兩種基因產(chǎn)物的切割活力不同，會(huì)在外源蛋白的N端產(chǎn)生不同的切割位點(diǎn)，許多情況下，Stell3切割Glu-Ala重復(fù)序列的效率不高，使一些蛋白在分泌中會(huì)在N端殘留有(Glu-Ala) 1-2融合序列，即產(chǎn)生了所謂的酵母信號(hào)肽切割不完全現(xiàn)象，這可能會(huì)影響外源蛋白的活性。因此，為了獲得具有天然活性的目的蛋白，本發(fā)明人做了以下設(shè)計(jì)其一，在VP2 蛋白N端融合了酵母表達(dá)載體pPICZ α A上α -factor信號(hào)肽下游的四個(gè)氨基酸序列 (Leu-Glu-Lys-Arg)，前兩個(gè)氨基酸序列是限制性內(nèi)切酶BioI的酶切位點(diǎn)，后兩個(gè)氨基酸序列是膜結(jié)合蛋白酶KEX2的切割序列，即，本發(fā)明中VP2蛋白只融合了其中一個(gè)蛋白酶 KEX2的切割序列AAA-AGA (Lys-Arg)，這樣設(shè)計(jì)的目的是避免了 STE13可能導(dǎo)致的不完全切割，保證表達(dá)的VP2蛋白能從信號(hào)肽上完全切割下來，不會(huì)殘留多余氨基酸而影響其抗原性，保持蛋白的完整性和天然活性；其二，在VP2基因3’端添加終止子TAA，從而去除了載體上的兩段序列c-myc印itope和polyhistidine tag，同樣使得表達(dá)的目的蛋白不會(huì)殘留除了自身以外的其他多余序列?？v觀現(xiàn)有技術(shù)，未見報(bào)道有類似的序列改造，所以本發(fā)明的基因改造具有獨(dú)特的創(chuàng)新性。本發(fā)明中發(fā)酵上清液目的蛋白的表達(dá)量高達(dá)0. 766mg/ml，是目前利用酵母系統(tǒng)進(jìn)行基因工程疫苗研究所獲得的最高表達(dá)量。之所以獲得高表達(dá)量，與上述的基因序列改造有著直接的關(guān)系。表達(dá)方法本發(fā)明的重組表達(dá)雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白亞單位的方法主要包括(1)提供改造的VP2蛋白亞單位編碼基因；(2)將(1)所述的VP2蛋白亞單位編碼基因插入到酵母表達(dá)載體pPICZaA的 α -factor信號(hào)肽編碼序列下游，獲得重組表達(dá)載體；(3)將O)的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母，獲得重組的畢赤酵母細(xì)胞；(4)將(3)的重組的畢赤酵母細(xì)胞進(jìn)行重組表達(dá)，從表達(dá)上清中獲得雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白亞單位。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，甲醇被用于誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)。較佳地，甲醇的終濃度為 0.5士0.2% (ν/ν)；更佳地終濃度為 0. 5士0. (ν/ν)。因電轉(zhuǎn)時(shí)電壓的設(shè)置，電轉(zhuǎn)時(shí)間及質(zhì)粒的濃度，感受態(tài)細(xì)胞狀態(tài)都對(duì)電轉(zhuǎn)化效果有影響，所以本發(fā)明人還摸索了電轉(zhuǎn)化的電轉(zhuǎn)儀參數(shù)，選擇較適宜的質(zhì)粒濃度和感受態(tài)細(xì)胞濃度。經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)摸索，本發(fā)明人獲得了較佳的電轉(zhuǎn)參數(shù)質(zhì)粒濃度為7-10ug/10y L， 感受態(tài)細(xì)胞IOOyL ；電轉(zhuǎn)化后快速加入ImL IM山梨糖醇，30°C復(fù)蘇1小時(shí)。在操作時(shí)，控制最后加入IM sorbitol的量，使得細(xì)胞濃度稍微有些粘稠為好。另外，在加入ImL 0°C的 IM sorbitol，30°C靜置復(fù)蘇1小時(shí)后，再加入ImL YPD液體培養(yǎng)基，30°C、200rpm振蕩復(fù)蘇 1小時(shí)，這樣電轉(zhuǎn)效果會(huì)更好。以上電轉(zhuǎn)條件的優(yōu)化解決了產(chǎn)生假陽性克隆，陽性克隆少，質(zhì)粒穩(wěn)定性低，拷貝數(shù)低等在轉(zhuǎn)化時(shí)較常出現(xiàn)的問題。根據(jù)畢赤酵母的特性，可在常溫下進(jìn)行蛋白表達(dá)，較佳地，在30士5°C的溫度下表達(dá)。
在本發(fā)明的實(shí)施例中，本發(fā)明人從國內(nèi)雞傳染性法氏囊病(IBV)眾多流行株中分離出超強(qiáng)毒株(vvIBDV)，應(yīng)用RT-PCR方法，擴(kuò)增得到IBDV主要保護(hù)性抗原VP2基因的開放編碼框，并將VP2基因克隆至畢赤酵母表達(dá)載體pPICZ α A，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZaA-VP2，然后將該重組表達(dá)質(zhì)粒以電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入畢赤酵母Χ-33感受態(tài)細(xì)胞中，通過PCR鑒定、表型篩選和抗生素濃度梯度篩選，獲得高拷貝陽性重組酵母菌株 X-33-pPICZ α A-VP2。搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)試驗(yàn)獲得穩(wěn)定高效表達(dá)的酵母工程菌，經(jīng)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) (ADIT)，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及免疫印跡(western-blot)鑒定表明，重組VP2 蛋白具有雞傳染性法氏囊病病毒天然蛋白的生物活性和免疫原性。疫苗制備采用本發(fā)明的上述方法重組表達(dá)獲得的VP2蛋白，可在經(jīng)過純化后用于制備疫苗；或者將培養(yǎng)上清(發(fā)酵上清)不作任何處理直接用于制備疫苗。制備疫苗的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的?？刹捎枚喾N制備方法或選擇多種佐劑，這些均被包含在本發(fā)明中。在本發(fā)明的實(shí)施例中，將表達(dá)獲得的IBDV重組VP2蛋白制成油佐劑亞單位疫苗， 免疫SPF雞。采集雞血清，間接ELISA法檢測中和抗體，結(jié)果表明本發(fā)明中得到的雞傳染性法氏囊病VP2基因工程亞單位疫苗能夠有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答。另外，攻毒試驗(yàn)也表明，IBDV重組VP2蛋白免疫SPF雞，可以產(chǎn)生抵抗超強(qiáng)毒(vvIBDV)致死攻擊的免疫保護(hù)(免疫組雞存活率90%以上，未免疫組雞存活率15% )。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。材料和試劑雞傳染性法氏囊病超強(qiáng)毒株(vvIBDV)分離自感染了雞傳染性法氏囊超強(qiáng)病毒的病雞(采自浙江海寧雞場)。大腸桿菌JM109購自大連寶生物工程公司，受體菌株P(guān)ichia. Pastoris X-33 (His-Mut+)、表達(dá)載體 pPICZ α A 和抗生素 kocin 購自 hvitrogen 公司。限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶，高保真Taq DNA聚合酶，DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均購自大連寶生物工程公司。配制培養(yǎng)基用酵母抽提物、水解乳蛋白、YNB、生物素等分別購自英國OXIOD公司與Sigma公司。其它試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。實(shí)施例1、目的基因的獲得1、病毒基因組總RNA的抽提法氏囊組織取自感染雞傳染性法氏囊病超強(qiáng)毒株(vvIBDV)的SPF雞，將法氏囊組織研磨和勻漿，凍融三次。取0. 02g組織于DEPC處理過的1. 5mL EP管中，加入ImL Trizol， 混勻，室溫放置5min。加200 μ L氯仿(一般按0. 2mL氯仿/mL Trizol比例加)于已處理過的樣品中，輕搖15秒，冰浴;3min。4°C，12，OOOrpm離心15min。取上清無色水相到新的EP 管(DEPC預(yù)處理)中，加入500yL預(yù)冷的異丙醇，混勻，室溫靜置lOmin。4°C, 12, OOOrpm, 離心lOmin。小心棄上清，加入ImL 95% (ν/ν)乙醇(用DEPC水新配制)，輕微混勻。4°C， 7500rpm離心5min。棄上清，吸干液體，汽干沉淀5_10min。最后加入DEPC預(yù)處理無RNAase 的雙蒸水15-20 μ L，打勻，于55-60°C水浴中溶解總RNA，-20°C或_80°C保存?zhèn)溆?。這就是 IBDV的基因組總RNA。2、引物設(shè)計(jì)和目的基因的克隆(1)引物設(shè)計(jì)參考已報(bào)道的VP2基因序列，應(yīng)用01igo5. O軟件在基因上下游設(shè)計(jì)一對(duì)引物。上游引物中引入酶切位點(diǎn)》ιοΙ和蛋白酶KEX2的切割序列，下游引物中引入NotI酶切位點(diǎn)和終止密碼子TAA。引物序列分別是上游引物5'-CACTCGAG AAAAGA ATGACAAACCTGCAA-3 ‘ (SEQ ID NO 2)；下游引物5'-TAGCGGCCGC |TTA| CCTTAGGGCCCGGATTATGT-3 ’ (SEQID NO :3)。下劃線分別是Biol、Not I酶切位點(diǎn)；斜體為蛋白酶KEX2的切割序列；方框內(nèi)為終止密碼子(TAA)的反向序列。以上構(gòu)建原因一當(dāng)重組蛋白由信號(hào)肽引導(dǎo)從胞內(nèi)分泌至胞外時(shí)，經(jīng)信號(hào)肽蛋白切割酶(該蛋白切割酶天然存在于酵母體內(nèi))切割后，在目的蛋白的 N端不會(huì)殘留多余的氨基酸，從而不影響其天然免疫原性。原因二 在下游引物中添加TAA 終止密碼子，使得重組蛋白只表達(dá)VP2蛋白，而不帶有酵母載體自身的c-myc epitope抗原表位和六組氨酸標(biāo)簽polyhistidine tag，使目的蛋白保持天然活性。使用以上引物擴(kuò)增后獲得的基因序列見圖1 (SEQ ID NO 1)。(2)目的基因克隆首先，以上述提取的病毒基因組總RNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒I^rimer Script 1st Strand cDNA Synthesis kit獲得cDNA，簡要過程如下取一 DEPC處理的無菌EP管，按照順序逐一力口入反應(yīng)液，分另Ij是 Random 6Primers 1 μ L, dNTP Mixture (IOmM each) 1 μ L， 總RNA 8 μ L，將上述反應(yīng)液混勻后，65°C，5min(PCR儀中進(jìn)行)，然后冰上急冷，再于上述混合液中加入下列試劑5xRT 緩沖液 4μ L，RNase Inhibitor (40U/μ L) 0. 5 μ L, Primer Script RTase 1 μ L，(MH2O 4. 5 μ L 混勻后，在 PCR 儀中按如下程序反應(yīng)30°C，IOmin ； 42°C，60min ；72°C, 15min ；4°C放置。然后，再以上述反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為ddH20 11. 8 μ L，IOXTaq PCR緩沖液2 μ L，d NTP 2 μ L，上游弓丨物1 μ L，下游弓丨物1 μ L，RT產(chǎn)物 2 μ L，Taq DNA聚合0. 2 μ L。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C熱變性5min后，按94°C變性50s，56°C 退火60s，72°C延伸90s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，于72°C保溫lOmin，最后在4°C放置。PCR擴(kuò)增得到的目的片段經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳割膠回收，再進(jìn)行純化。實(shí)施例2、重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定將上述純化后的目的基因VP2與表達(dá)載體pPICZ α A分別都用)(h0I/N0tI進(jìn)行雙酶切，經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠回收純化，用T4連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，得到的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pPICZaA-VP2。將該重組表達(dá)質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞。在含有抗生素 Zeocin的低鹽LB培養(yǎng)基中分離單克隆。試劑盒提取質(zhì)粒，利用Biol/Notl對(duì)pPICZ α A-VP2 重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定(大小分別是3.61Λ和1.41Λ的基因片段)(見圖2)，利用PPICZaA載體兩端的5'、3' AOXl引物(擴(kuò)增得到約2. 01Λ基因片段)以及目的基因上下游引物(擴(kuò)增得到約1.41Λ基因片段)進(jìn)行PCR鑒定(見圖3，4)。將鑒定正確的重組質(zhì)粒送至hvitrogen公司測序。測序結(jié)果表明，目的基因序列完全正確，符合預(yù)期設(shè)計(jì)，并且插入到載體的方向也無誤，與載體讀碼框吻合。實(shí)施例3、重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)畢赤酵母以及高抗性重組酵母菌株的篩選(1)重組質(zhì)粒的線性化及其純化重組質(zhì)粒pPICZ α A-VP2用&icl單酶切，37°C水浴2小時(shí)，然后65°C 20分鐘，使酶失活。加入等體積的苯酚/氯仿混勻，12000rpm離心兩分鐘，上清液加入2. 5倍體積的無水乙醇和1/10體積的3M乙酸鈉，混勻，_20°C放置10分鐘以沉淀DNA。4°C、12000rpm離心5 分鐘，棄去上清，沉淀用80% (ν/ν)乙醇洗滌，室溫干燥后用10 μ L滅菌的ddH20重懸，即為純化的線性化重組質(zhì)粒，存_20°C備用。(2)畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備感受態(tài)制備方法如下接種畢赤酵母X-33單克隆于3mL YPD液體培養(yǎng)基中，30°C、 270rpm搖床振蕩培養(yǎng)過夜。將此過夜菌1 100接種IOOmLYPD液體培養(yǎng)基中，30°C、270rpm 搖床振蕩培養(yǎng)至OD6tltl = 1. 3-1. 5，大約需要20小時(shí)。4°C、1500g離心5分鐘。細(xì)胞沉淀用 IOOmL 0°C、滅菌的ddH20重懸。同上述步驟4°C、1500g離心5分鐘，細(xì)胞沉淀用50mL 0°C、 滅菌的ddH20重懸。4°C、1500g離心5分鐘，細(xì)胞沉淀用^iL 0°C、滅菌的IM sorbitol (山梨糖醇)重懸。同上述步驟離心后沉淀再重懸于0. 2mL 0°C、滅菌的IM sorbitol中，至最終體積為0. 3mL,即制成酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞。將其放置在冰上當(dāng)天使用。(3)電轉(zhuǎn)入畢赤酵母經(jīng)過條件優(yōu)化，本實(shí)驗(yàn)采取以下電轉(zhuǎn)參數(shù)0. 2cm電轉(zhuǎn)杯，電壓2. 0KV,電擊時(shí)間 5ms，最佳質(zhì)粒濃度為7ug到IOug (體積控制在10 μ L)，感受態(tài)細(xì)胞100 μ L。電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)在BIO-RAD電轉(zhuǎn)儀中進(jìn)行，電轉(zhuǎn)化后快速加入ImL IMsorbitol (山梨糖醇)，30°C復(fù)蘇1小時(shí)，再涂布含有hoc in的YPDS平板，將平板倒置，放置在恒溫培養(yǎng)箱中， 30°C培養(yǎng)2-3天。(4)高抗性(拷貝)重組菌株的篩選載體pPICZaA中含有kocin 抗性基因，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道重組酵母菌株抵抗 kocin 的能力與其整合質(zhì)?？截悢?shù)成正比，因此，用含有不同kocin 濃度(100 μ g/ mL-3000yg/mL)的瓊脂平板可以快速篩選含多拷貝外源基因轉(zhuǎn)化株。具體操作方法是用滅菌的牙簽挑取在kocin 濃度為100 μ g/mL的電轉(zhuǎn)平板上的單菌落，將其分別點(diǎn)種在kocin 濃度分別為1000 μ g/mL,2000 μ g/mL,3000 μ g/mL的 YPDS平板上。將平板倒置，放置在恒溫培養(yǎng)箱中，30°C培養(yǎng)2-3天。按菌落長勢大小，從大到小挑取kocin 濃度為3000 μ g/mL的YPDS平板上的20株單克隆。將此20株單克隆分別劃線kocin 濃度為100 μ g/mL的YPDS平板，以純化單克隆。(5) PCR鑒定陽性克隆及其表型外源基因整合酵母染色體的方式有兩種，分別是置換重組和交叉重組，這兩種重組方式相應(yīng)產(chǎn)生兩種不同的菌株分別是甲醇利用緩慢型菌株(Muts)和甲醇利用快速型菌株(Mut+)。鑒定這兩種表型，較為簡便的鑒別方式是PCR方法。利用表達(dá)載
9體的兩端引物 5，AOXl 5 ‘ -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3 ‘ (SEQ ID NO 4)、3，AOXl 5' -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3‘ (SEQ ID NO :5)，進(jìn)行 PCR 鑒定。若 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為單一片段，大小為2. 01Λ，則為慢速生長型轉(zhuǎn)化子，緩慢利用甲醇。若PCR擴(kuò)增產(chǎn)物除了 2. 01Λ片段外，還有一條約2. 2kb大小的基因片段，則為快速型轉(zhuǎn)化子，能夠快速利用甲醇(見圖5)。 這種PCR鑒定方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，它同時(shí)能夠檢出陽性克隆子，簡化了試驗(yàn)步驟。選出快速型轉(zhuǎn)化子。上述PCR反應(yīng)所用的模板，一般較常用的是直接抽提酵母基因組DNA，但是通過這種方法獲得PCR模板較為耗時(shí)繁瑣，對(duì)于大量的轉(zhuǎn)化子篩選來說，不僅不經(jīng)濟(jì)，而且工作量很大。本發(fā)明研究了更為簡便的方法，直接采用酵母菌落進(jìn)行PCR。將酵母菌落經(jīng)過冷熱處理的方法使其細(xì)胞壁裂解，再改變通常PCR反應(yīng)液的一些組成成分和體積，實(shí)踐表明，這種方法準(zhǔn)確率高，也非常省時(shí)有效。實(shí)施例4、重組酵母工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)以及目的蛋白的鑒定(1)搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)挑取克隆于25mL BMGY 中 Q50mL搖瓶)，30°C，270rpm，培養(yǎng)約 16-18 小時(shí)至 0D600 為2-6，2000g, 5min,離心收集細(xì)胞沉淀，將沉淀重懸于IOOmLBMMY中(500mL搖瓶)，開始誘導(dǎo)表達(dá)。每隔12-24小時(shí)加入終濃度為0.5% (ν/ν)的甲醇。培養(yǎng)至120h收集發(fā)酵液，最大轉(zhuǎn)速離心2-3分鐘，棄沉淀，上清先保存在超低溫冰柜。在搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)試驗(yàn)過程，本發(fā)明人對(duì)各個(gè)表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，以最優(yōu)的條件進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。優(yōu)化的表達(dá)條件為工程菌的生長培養(yǎng)基BMGY的PH值為6. 0，生長期溫度為30°C;誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY的PH值為6. 5，誘導(dǎo)溫度為28. 5°C，誘導(dǎo)物甲醇終濃度為0. 5%， 表達(dá)量高達(dá)0. 766mg/ml。查閱文獻(xiàn)得知，該表達(dá)量是目前利用酵母系統(tǒng)進(jìn)行基因工程疫苗研究所獲得的最高表達(dá)量。(2)表達(dá)蛋白的鑒定常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE和flfestern-blot鑒定結(jié)果表明，重組質(zhì)粒在酵母系統(tǒng)中獲得成功表達(dá)，并且目的蛋白與IBDV多抗血清發(fā)生能夠特異性反應(yīng)，證實(shí)了目的蛋白具有免疫反應(yīng)性。結(jié)果見圖6-7。實(shí)施例5、VP2蛋白亞單位疫苗的制備及動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)按照水油比例為2 3(體積比)進(jìn)行乳化，即兩份重組蛋白發(fā)酵上清(含0. 5% (ν/ν)吐溫-80，蛋白濃度為0. 766mg/ml)加3份白油司本(白油購自山東搏潤工業(yè)技術(shù)有限公司，司本購自北京希凱創(chuàng)新有限公司)充分乳化均勻，即成VP2蛋白亞單位疫苗。取7-9日齡SPF雞40只，分三組，每組10只，每只免疫劑量均為0. 5mL,免疫方式為皮下注射。A組為本發(fā)明的VP2蛋白亞單位疫苗，B組為常規(guī)雞傳染性法氏囊凍干疫苗 (法氏囊B87凍干苗)，C組陰性對(duì)照。15天后進(jìn)行二免(劑量同第一次免疫，均為0.5mL 每只雞)。免疫期間每隔一周采血，間接ELISA法測定中和抗體水平。A組的抗體滴度測定結(jié)果見圖8。結(jié)果表明，本發(fā)明中VP2蛋白亞單位疫苗完全能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生高滴度的保護(hù)性中和抗體。實(shí)施例6、攻毒試驗(yàn)如實(shí)施例5的方法以本發(fā)明的VP2蛋白亞單位疫苗免疫SPF雞，第二次免疫后10
10天IBDV超強(qiáng)毒株攻毒，攻毒后10天觀察保護(hù)率及法氏囊組織變化。攻毒后10天試驗(yàn)雞法氏囊組織學(xué)檢查結(jié)果法氏囊的淋巴濾泡均無損傷，皮質(zhì)和髓質(zhì)界限清晰，法氏囊整體結(jié)構(gòu)正常。攻毒后10天，免疫雞組保護(hù)率為95%，未免疫雞組保護(hù)率僅為15%。這表明了， 本發(fā)明表達(dá)的IBDV重組VP2蛋白亞單位疫苗能夠完全保護(hù)免疫雞抵抗超強(qiáng)毒株的致死性攻擊。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種重組表達(dá)雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白亞單位的方法，其特征在于，該方法包括(1)提供改造的VP2蛋白亞單位編碼基因；其中，在所述的VP2蛋白亞單位編碼基因的 5’端起始密碼子ATG之前添加蛋白酶KEX2的切割序列，在所述的VP2蛋白亞單位編碼基因的3’端添加終止密碼子序列；(2)將(1)所述的VP2蛋白亞單位編碼基因插入到酵母表達(dá)載體pPICZaA的 α -factor信號(hào)肽編碼序列下游，獲得重組表達(dá)載體；(3)將O)的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母，獲得重組的畢赤酵母細(xì)胞；(4)將(3)的重組的畢赤酵母細(xì)胞進(jìn)行重組表達(dá)，從表達(dá)上清中獲得雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白亞單位。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，還在所述的蛋白酶KEX2的切割序列的5’端之前添加BioI酶切位點(diǎn)序列；在所述的終止密碼子序列的3’端添加NotI酶切位點(diǎn)序列。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟⑵中，將所述的VP2蛋白亞單位編碼基因插入到酵母表達(dá)載體pPICZ α A的Biol/Notl酶切位點(diǎn)之間。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的改造的VP2蛋白亞單位編碼基因的序列如SEQ ID NO 1所示。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的畢赤酵母是X-33菌株。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將重組表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化畢赤酵母，電轉(zhuǎn)化條件為0. 2cm電轉(zhuǎn)杯，電壓2. OKV,電擊時(shí)間5ms，質(zhì)粒濃度為7_10ug/10 μ L，感受態(tài)細(xì)胞 100 μ L ；電轉(zhuǎn)化后快速加入ImL IM山梨糖醇，30°C復(fù)蘇1小時(shí)。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟中，表達(dá)條件為采用誘導(dǎo)培養(yǎng)基 BMMY，培養(yǎng)基PH值為6. 5 士 0. 5，誘導(dǎo)溫度為28. 5 士 1°C，甲醇終濃度為0. 5 士 0. 2% (ν/ν)。
8.一種制備傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白亞單位疫苗的方法，其特征在于，該方法包括以權(quán)利要求1所述的方法獲得雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白亞單位，進(jìn)行乳化的步驟，獲得傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白亞單位疫苗。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，將所述的雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白亞單位與白油司本進(jìn)行混合、乳化。
10.一種用于重組表達(dá)雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白亞單位的多核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雞傳染性法氏囊病基因工程亞單位疫苗的制備和應(yīng)用。本發(fā)明人優(yōu)化了雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的重組表達(dá)方法，有效提高了VP2蛋白的表達(dá)產(chǎn)量，確保了表達(dá)產(chǎn)物與天然蛋白的一致性。本發(fā)明的方法工藝簡單、成本低廉，可高效穩(wěn)定地獲得可安全使用的雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白亞單位疫苗。
文檔編號(hào)C12N15/40GK102277374SQ20111021221
公開日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2011年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月27日
發(fā)明者吳桃芬, 徐素珍, 藍(lán)勝芝, 趙艷敏, 黃芳 申請(qǐng)人:浙江諾倍威生物技術(shù)有限公司