專(zhuān)利名稱(chēng)：一種雞傳染性支氣管炎病毒的鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)，具體涉及一種雞傳染性支氣管炎病毒的鑒定方法。
背景技術(shù)：
雞傳染性支氣管炎(Avian Infectious Bronchitis, IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒anfectious Bronchitis Virus, IBV)引起的一種急性、高度接觸傳染性、病毒性疾病。雞傳染性支氣管炎于1930年在美國(guó)北達(dá)科塔州首次發(fā)現(xiàn)，主要危害2日齡到3周齡雛雞的呼吸道，特征是喘息、精神倦怠，死亡率為40% -90%。根據(jù)IBV感染雞群后引起的臨床癥狀，分為呼吸型、腎型、腸型等多種病型，還有一些變異的中間型。隨著多種IB疫苗的廣泛使用和臨床混合感染的普遍發(fā)生，IBV感染雞群后日益缺乏典型的臨床癥狀和病理變化，必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)室診斷才能最終確診，從而采取科學(xué)、有效的防治措施。IBV的基因組為單股正鏈RNA，由于RNA基因組的高突變率以及其具有的獨(dú)特轉(zhuǎn)錄合成機(jī)制，導(dǎo)致了新基因型和血清型IBV毒株不斷出現(xiàn)，而不同血清型毒株間的交叉保護(hù)力很低甚至沒(méi)有，如果所用的疫苗毒株與當(dāng)?shù)亓餍卸局甑难逍筒灰恢拢瑒t不能產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)。因此，對(duì)各地方流行病毒株的分離、鑒定和血清型劃分的研究一直是IBV的研究熱點(diǎn)，而如何快速、準(zhǔn)確地鑒定IBV是現(xiàn)在亟需解決的問(wèn)題。目前IB的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有病原分離鑒定、血清學(xué)技術(shù)以及近年來(lái)發(fā)展的分子生物學(xué)方法(核酸探針和RT-PCR技術(shù)等)。病原分離鑒定操作簡(jiǎn)單，是當(dāng)前應(yīng)用最為廣泛的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)，也是IB實(shí)驗(yàn)室診斷的主要標(biāo)準(zhǔn)。但大多數(shù)IBV野毒不適于雞胚生長(zhǎng)，需要至少2-4代盲傳(約12-16天)，才能使雞胚產(chǎn)生典型病變，因此，常常延誤最佳治療時(shí)機(jī)。而血清學(xué)方法由于IBV血清型繁多(據(jù)報(bào)道目前有30余種)導(dǎo)致鑒定程序繁瑣目前已很少應(yīng)用。目前發(fā)展的分子生物學(xué)方法雖然能夠快速診斷IBV，但需要特殊的儀器設(shè)備，一般基層實(shí)驗(yàn)室很難推廣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中IBV分離鑒定存在的費(fèi)時(shí)、缺乏客觀判定標(biāo)準(zhǔn)的問(wèn)題，提供了一種利用IBV病毒能夠在雞胚中干擾雞新城疫病毒(NDV)的特性而研究的快速、準(zhǔn)確的IBV鑒定方法，本方法主要采用將待檢樣品尿囊腔接種雞胚，之后接種雞新城疫病毒 (Newcastle disease virus, NDV)弱毒株LaSota并最終根據(jù)雞胚尿囊液血凝價(jià)的檢測(cè)結(jié)果來(lái)鑒定IBV是否存在，由于這種方法采用了間接測(cè)定的方式，較之現(xiàn)有技術(shù)有著檢測(cè)速度快，不需特殊培養(yǎng)的特點(diǎn)，且可以廣泛的用于雞傳染性支氣管炎的實(shí)驗(yàn)室診斷、抗體檢測(cè)和IBV血清型鑒定，以進(jìn)行IB疫苗免疫效果的評(píng)價(jià)、疫情監(jiān)測(cè)等，為制定科學(xué)的免疫程序并有效防控IB的發(fā)生提供理論依據(jù)。另外由于本方法無(wú)需特殊儀器設(shè)備，便于在一般基層實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。本發(fā)明提供的具體技術(shù)方案是將待檢樣品尿囊腔接種SPF雞胚，同時(shí)設(shè)接種PBS 緩沖液的SPF雞胚做為對(duì)照，將兩組雞胚分別于37°C孵化M_30h后接種200-2000EID5Q的雞新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)弱毒株，之后再于37°C分別孵化48_72h后檢測(cè)雞胚尿囊液血凝價(jià)(HA)，根據(jù)血凝價(jià)(HA)判定結(jié)果當(dāng)對(duì)照組雞胚尿囊液HA效價(jià)為 9-lllog2時(shí)，若接種待檢樣品的雞胚尿囊液HA效價(jià)為0-21og2，則為IBV陽(yáng)性，若接種待檢樣品的雞胚尿囊液HA效價(jià)為9-lllog2，則為IBV陰性。由于NDV和IBV在9-11日齡SPF雞胚中生長(zhǎng)良好，一般待檢樣品接種后需要 20-30h再接種NDV，所以綜合考慮，選用9-10日齡SPF雞胚進(jìn)行接種。將上述接種后的SPF 雞胚在37°C孵化M-30h，時(shí)間過(guò)短，IBV在雞胚中尚未增殖，對(duì)NDV無(wú)干擾作用；時(shí)間過(guò)長(zhǎng)， IBV含量過(guò)高，可能導(dǎo)致雞胚死亡，無(wú)法再接種NDV，孵化時(shí)間優(yōu)選Mh。為了生物安全，避免強(qiáng)毒對(duì)環(huán)境的污染，本發(fā)明選用弱毒株疫苗，例如C30或LaSota進(jìn)行接種。作為國(guó)內(nèi)最常用的弱毒疫苗株，優(yōu)選最具代表性的LaSota，上述的弱毒株疫苗均為市售疫苗。NDV的接種量在200-2000EID5(1都可以，因?yàn)楸景l(fā)明中和試驗(yàn)中的病毒量為200EID5(1，為了易于試驗(yàn)，本發(fā)明選用劑量為200EID5(1。接種NDV后，再在37°C孵化48_7池，優(yōu)選48h，使得雞胚尿囊液 HA效價(jià)最高，從而根據(jù)HA判定結(jié)果。由于對(duì)照組雞胚只接種PBS緩沖液，不含有IBV，所以不會(huì)對(duì)NDV的增殖造成干擾， 如果接種待檢樣品的雞胚尿囊液HA效價(jià)與對(duì)照組相同，則說(shuō)明待檢樣品中沒(méi)有IBV，反之， 則待檢樣品中有IBV。本發(fā)明中，NDV和IBV接種的先后順序不能顛倒，否則IBV對(duì)NDV增殖無(wú)干擾作用， 無(wú)法檢測(cè)。本發(fā)明所采用的待檢樣品，其處理過(guò)程是當(dāng)選用病變組織作為待檢樣品時(shí)，將病變組織用研磨器磨碎后，加入含青霉素2000IU/mL、鏈霉素ang/mL的0. OlMPBS pH為7. 4的緩沖液，混勻，-20°C反復(fù)凍融3次，SOOOrpm離心后取上清，4°C作用2_4h，即可用于雞胚接種；病變組織為臨床上懷疑感染IBV的病死雞的內(nèi)臟器官，主要包括雞的氣管或肺臟或腎臟或輸卵管或腸道或肝臟或脾臟。當(dāng)選用病雞喉氣管棉拭子樣品和泄殖腔棉拭子樣品作為待檢樣品時(shí)，在PBS緩沖液中加入青霉素10000IU/mL、鏈霉素10mg/mL、丁胺卡那霉素5000IU/mL、制霉菌素5000IU/ mL后進(jìn)行上述制備。本發(fā)明所涉及的技術(shù)方案主要是針對(duì)IBV接種后雞胚孵化時(shí)間、NDV弱毒株的選擇及接種劑量、接種NDV后的雞胚孵化時(shí)間、NDV和IBV接種的先后順序等進(jìn)行了條件優(yōu)化。 在此優(yōu)化條件下所獲得的雞胚尿囊液的HA效價(jià)在雞胚間的離散度最低，陽(yáng)性樣品HA效價(jià)為0-21og2，陰性樣品HA效價(jià)為9-lllog2，兩者差異顯著(P < 0. 01)，從而使結(jié)果的判定更加準(zhǔn)確。綜上所述，本發(fā)明的IBV鑒定方法與病毒分離、RT-PCR方法比較，本發(fā)明采用了間接測(cè)定的方式，較現(xiàn)有的技術(shù)有著檢測(cè)速度快，結(jié)果準(zhǔn)確度高，不需特殊的儀器設(shè)備等特點(diǎn)，一般72h即可獲得檢測(cè)結(jié)果(見(jiàn)表1)，可以廣泛用于雞傳染性支氣管炎的實(shí)驗(yàn)室診斷、 抗體檢測(cè)和IBV血清型鑒定，從而進(jìn)行IB疫苗免疫效果的評(píng)價(jià)、疫情監(jiān)測(cè)等，為制定科學(xué)的免疫程序并有效防控IB的發(fā)生提供理論依據(jù)。表1本發(fā)明方法與病毒分離、RT-PCR方法比較
權(quán)利要求
1.一種雞傳染性支氣管炎病毒的鑒定方法，其特征在于步驟如下將待檢樣品尿囊腔接種SPF雞胚，同時(shí)設(shè)接種PBS緩沖液的SPF雞胚做為對(duì)照，將兩組雞胚分別于37°C孵化M_30h后接種200-2000EID5(1的雞新城疫病毒弱毒株，之后再于37°C 分別孵化48-7 后檢測(cè)雞胚尿囊液血凝價(jià)，根據(jù)血凝價(jià)判定結(jié)果當(dāng)對(duì)照組雞胚尿囊液血凝價(jià)效價(jià)為9-lllog2時(shí)，若接種待檢樣品的雞胚尿囊液血凝價(jià)效價(jià)為0-21og2，則為IBV陽(yáng)性；若接種待檢樣品的雞胚尿囊液血凝價(jià)效價(jià)為9-lllog2，則為IBV陰性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于所述的SPF雞胚為9-10日齡雞胚。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于所述的接種待檢樣品或PBS緩沖液后雞胚的孵化時(shí)間為Mh。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于所述的雞新城疫病毒弱毒株采用C30 或 LaSota,優(yōu)選 LaSota0
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于所述的雞新城疫病毒弱毒株的接種量為 200EID5Q。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于所述的接種雞新城疫病毒后孵化的時(shí)間為48h。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于所述的待檢樣品處理過(guò)程是當(dāng)選用病變組織作為待檢樣品時(shí)，將病變組織用研磨器磨碎后，加入含青霉素2000IU/ mL、鏈霉素2mg/mL的0. OlMPBS pH為7. 4的緩沖液，混勻，_20°C反復(fù)凍融3次，8000rpm離心后取上清，4°C作用2-4h，即可用于雞胚接種；當(dāng)選用病雞喉氣管棉拭子樣品和泄殖腔棉拭子樣品作為待檢樣品時(shí)，在PBS緩沖液中加入青霉素10000IU/mL、鏈霉素10mg/mL、丁胺卡那霉素5000IU/mL、制霉菌素5000IU/mL后進(jìn)行上述制備。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的鑒定方法，其特征在于所述的病變組織為臨床上懷疑感染 IBV的病死雞的內(nèi)臟器官，主要包括雞的氣管或肺臟或腎臟或輸卵管或腸道或肝臟或脾臟。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)的鑒定方法，該方法是將待檢樣品尿囊腔接種SPF雞胚，同時(shí)設(shè)接種PBS緩沖液的SPF雞胚做為對(duì)照，將兩組雞胚分別于37℃孵化24-30h后接種200-2000倍雞胚半數(shù)感染量(EID50)的雞新城疫病毒弱毒株，之后再于37℃分別孵化48-72h后檢測(cè)雞胚尿囊液血凝價(jià)，根據(jù)血凝價(jià)判定結(jié)果。本方法利用了IBV病毒能夠在雞胚中干擾雞新城疫病毒(NDV)增殖的特性，可用于雞傳染性支氣管炎的實(shí)驗(yàn)室診斷、抗體檢測(cè)和IBV血清型鑒定，以進(jìn)行雞傳染性支氣管炎疫苗免疫效果的評(píng)價(jià)、疫情監(jiān)測(cè)等，為制定科學(xué)的免疫程序并有效防控該病的發(fā)生提供理論依據(jù)。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102286638SQ20111021245
公開(kāi)日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月27日
發(fā)明者任海松, 張琳, 張秀美, 楊少華, 胡北俠, 許傳田, 黃艷艷 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所