專利名稱：用于癌癥診斷和治療的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌癥的診斷，特別是通過檢測miR15和miR16拷貝數(shù)目，突變情況，或基因表達(dá)來診斷慢性淋巴性白血病或前列腺癌。本發(fā)明還涉及癌癥的治療，包括miR15或 miR16基因表達(dá)的減少或缺失，特別是通過施用miR15或miR16基因產(chǎn)物治療慢性淋巴性白血病或前列腺癌。
背景技術(shù)：
在美國和全世界癌癥都是死亡和發(fā)病的一個(gè)重要原因。特別是慢性淋巴性白血病 (“CLL”)和前列腺癌在臨床上是重要的成人腫瘤病。CLL是西方世界是最普遍的一種成人白血病形式。而且在美國的男人中，前列腺癌的年齡校正發(fā)病率目前超過了所有其它癌癥， 僅次于肺癌，是該國家所有男性癌癥死亡的第二大原因。在多于一半的報(bào)道CLL病例中都會(huì)發(fā)生13ql4的半合子丟失和/或純合子丟失， 這構(gòu)成了 CLL中最頻繁的染色體異常。CLL患者的組織樣品的染色體組型相對(duì)具有較少的染色體異常，這表明所觀察到的13ql4缺失的特異性和頻率具有病理學(xué)重要性。除此之外， 60%的前列腺癌中也具有13ql4缺失，表明CLL和前列腺癌的發(fā)病機(jī)理涉及位于13ql4的一種或多種腫瘤抑制基因。CLL和前列腺癌中同時(shí)存在克隆性純合和雜合性缺失，以及非常高的13q4丟失頻率，表明該區(qū)域的缺失與特定癌癥類型的病因有關(guān)。對(duì)幾種基因進(jìn)行位置克隆以鑒別缺失部位的基因。至今從突發(fā)性CLL和遺傳性CLL的13ql4的缺失區(qū)域共鑒別了八個(gè)基因，并檢測了其 DNA 和 / 或 RNA 水平的改變:Leul (BCMS 或 EST70/Leul)，Leu 2 (ALT1 或 1B4/Leu2)， Leu 5 (CAR)，CLLD6, KPNA3, CLLD7, L0C51131 (推測的鋅指蛋白 NY-REN-34 抗原)和 CLLD8。 但是，詳細(xì)的基因分析，包括大范圍的雜合性丟失(LOH)，突變和表達(dá)研究，卻沒能證明任何這些基因與致癌作用的關(guān)系。小分子RNA(miRNA)存在于超過一百種不同的生物體中，包括果蠅，線蟲和人。認(rèn)為在這些生物體中在多種發(fā)育調(diào)節(jié)過程中都涉及到miRNA，miRNA典型地是通過60到70個(gè)核苷酸的反饋RNA前體結(jié)構(gòu)的處理得到的，該反饋RNA前體結(jié)構(gòu)是由miRNA基因轉(zhuǎn)錄而來的。RNA前體或處理的miRNA產(chǎn)物很容易檢測，缺少這些分子表明相應(yīng)miRNA基因的缺失或功能丟失。目前CLL的治療典型地包括化學(xué)療法，單獨(dú)施用或與自體同源骨髓移植一起進(jìn)行。所使用的化學(xué)治療劑通常對(duì)患者具有毒性，在大部分患者中都只是達(dá)到部分緩解的效果。前列腺癌和其它癌癥治療的療法也包括化學(xué)療法，通常是在外科手術(shù)切除腫瘤以后。但是，對(duì)于CLL，化學(xué)治療劑(與外科手術(shù)一起進(jìn)行或不與其一起進(jìn)行)的治療受到限制。前列腺癌也可以用外部射線照射或近距離放射療法(例如使用具有放射活性的 “種子”)治療，也是單獨(dú)使用或與外科手術(shù)一起使用。這種治療的危險(xiǎn)是將患者的正常組織暴露在放射線之中，以及可能不是完全有效。CLL或前列腺癌需要有快速，經(jīng)濟(jì)和準(zhǔn)確的診斷性檢測。對(duì)于癌癥還需要有經(jīng)濟(jì)和有效的并且對(duì)患者沒有顯著的負(fù)面影響的治療，特別是CLL或前列腺癌。發(fā)明簡述現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在人中，miR15或miR16基因位于13ql4，而在很大一部分CLL或前列腺癌患者中13ql4區(qū)域都缺失。還發(fā)現(xiàn)miR15或miR16基因的RNA產(chǎn)物抑制CLL和前列腺癌細(xì)胞的贅生物或腫瘤生長。這些RNA產(chǎn)物可以用于癌癥治療，對(duì)miR15或miR16基因進(jìn)行負(fù)調(diào)控。miR15和miR16小分子RNA基因位于13ql4，在CLL和前列腺癌丟失的30kb區(qū)域中，在大部分CLL和前列腺癌中這兩個(gè)基因都缺失或受到負(fù)調(diào)控。因此，本發(fā)明提供了一種 CLL或前列腺癌的診斷性檢測，包括檢測這些基因的基因產(chǎn)物，檢測miR15或miR16基因的拷貝數(shù)，或測定其突變情況。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述診斷檢測包括從懷疑患有CLL或前列腺癌的患者中分離 RNA,用miR15或miR16前體或處理過的miRNA的探針用Northern blot雜交檢測miR15或 miR16基因產(chǎn)物，其中miR15或miR16前體或處理過的miRNA與正常樣品對(duì)照相比有所減少則診斷為CLL或前列腺癌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述診斷檢測包括從懷疑患有miR15或miR16介導(dǎo)的癌癥例如CLL或前列腺癌的患者中分離DNA，用miR15或miR16基因序列的探針用Southern blot雜交檢測miR15或miR16基因拷貝數(shù)，其中基因拷貝數(shù)減少到1或0則診斷為CLL或前列腺癌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述診斷檢測包括通過評(píng)價(jià)D13S273和D13S272標(biāo)記的雜合性丟失檢測miR15或miR16基因拷貝數(shù)的減少，其中有這些標(biāo)記的雜合性丟失診斷為CLL 或前列腺癌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述診斷檢測包括從懷疑患有CLL或前列腺癌的患者中分離DNA，用PCR擴(kuò)增miR15或miR16基因片段檢測miR15或miR16基因的缺失或突變并將該擴(kuò)增片段與正常樣品對(duì)照的擴(kuò)增片段相比較，其中在miR15或miR16基因的一個(gè)或多個(gè)拷貝中檢測到突變則診斷為CLL或前列腺癌?？梢杂脝捂湗?gòu)象多態(tài)性方法比較擴(kuò)增片段。在一方面，所述突變?yōu)閙iR15或miR16基因序列的部分缺失。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述診斷檢測包括從懷疑患有CLL或前列腺癌的患者中分離RNA，檢測到miR15或miR16基因產(chǎn)物的突變則診斷為CLL或前列腺癌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述診斷檢測包括從懷疑患有CLL或前列腺癌的患者中分離RNA，用逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增miR15或miR16前體或處理過的miRNA從而檢測miR15或miR16基因產(chǎn)物的水平，其中miR15或miR16前體或處理過的miRNA與內(nèi)對(duì)照的擴(kuò)增RNA相比有所減少則診斷為CLL或前列腺癌。本發(fā)明還提供了一種在需要治療的患者中治療miR15或miR16介導(dǎo)的癌癥的方法，包括將有效量的miR15或miR16基因產(chǎn)物給予患者，由此癌細(xì)胞的增殖受到抑制。
本發(fā)明還提供了一種在需要治療的患者中治療miR15或miR16介導(dǎo)的癌癥的方法，其中分離患者的細(xì)胞并在離體條件下用有效量的含有編碼miR15或miR16基因產(chǎn)物的序列的核酸轉(zhuǎn)染。然后將這些細(xì)胞重新植入到患者體內(nèi)，由此患者的癌細(xì)胞的增殖受到抑制。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種在患者中抑制miR15或miR16介導(dǎo)的癌癥的增殖的方法，包括向細(xì)胞遞送有效量的miR15或miR16基因產(chǎn)物。本發(fā)明進(jìn)一步還提供了一種治療患有miR15或miR16介導(dǎo)的癌癥的患者的藥物組合物，包括分離的miR15或miR16基因產(chǎn)物，或編碼miR15或miR16基因產(chǎn)物的核酸，以及藥學(xué)可接收的載體。附圖簡述圖IA和圖IB分別是預(yù)測的miR15和miR16前體RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的示意圖。用 “mfold”程序，3. 1 版，Matthews et al. (1999)，J. Mol. Biol. 288 :911_940 進(jìn)行 RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測，人工修飾以使螺旋區(qū)段內(nèi)包含G/U擺動(dòng)堿基對(duì)。處理的miR15和miR16 miRNA以下劃線表示。根據(jù) Lagos-Quintana et al. (2001), Science 294 :853_858 進(jìn)行了修改。圖2A是CLL中13ql4腫瘤抑制子位點(diǎn)內(nèi)的基因圖譜，顯示出miR15/16基因簇的定位。其中顯示了遺傳標(biāo)記和基因在圖譜上的位置。圖2B是已報(bào)道過的13ql4缺失圖譜，用水平條框標(biāo)記。圖2C是D13S1150和D13S272標(biāo)記之間的位點(diǎn)圖譜。在此位點(diǎn)上每個(gè)基因的方向都在基因名稱下方用箭頭標(biāo)出，彩色的垂直條表示每個(gè)基因相應(yīng)外顯子的位置。圖2D是Alu 18和D13S272標(biāo)記之間的位點(diǎn)圖譜。條和框表示LEU2/ALT1和LEUl 外顯子的位置。短垂直箭頭表示miR15或miR16基因的位置。圓點(diǎn)表示用于篩選衍生自兩種獨(dú)立的白血病細(xì)胞(CLL-A和CLL-B)的融合細(xì)胞的體細(xì)胞雜交克隆的PCR引物的位置。 填充框表示雜交體中的染色體13的部分?！耙?31. 4kb ―”表示在來自患有具有t (2 ；13) (ql2 ；ql3)移位的CLL，兩邊眼癌，潰瘍性結(jié)腸炎的患者的克隆CLL-A中大約31. 4kb的缺失區(qū)域。長垂直箭頭表示具有t(2;13)(q32;ql4)移位的克隆CLL-B的斷點(diǎn)位置，“一 29kb ―”表示該克隆中大約29kb的缺失區(qū)域。圖3A是正常人腎，前列腺，肝臟，骨骼肌(“Sk肌”)，睪丸，CD5+B細(xì)胞(CD5+)，白血病細(xì)胞("Per Bl Leuk")和骨髓(“BM”)中miR15和miR16基因表達(dá)的Northern blot 分析。圖3B是在18個(gè)CLL患者中微衛(wèi)星標(biāo)記D13S272和D13S273的雜合丟失(“L0H”) 分析。用來自正常人⑶5+細(xì)胞的DNA作為對(duì)照。樣品的LOH狀態(tài)用“+/+雜合”，“+/-L0H”， “-/_純合缺失”，“Ni，，(無意義)，“？”(沒有足夠材料)和“ND” (未實(shí)施)。用溴化乙錠染色的Northern凝膠作為歸一化對(duì)照。發(fā)明詳述本文給出的所有核酸序列都是5’到3’方向的。此外，核酸序列中的所有脫氧核糖核苷酸都用大寫字母表示(例如，脫氧胸腺嘧啶為“T”)，核酸序列中的核糖核苷酸用小寫字母表示(例如尿嘧啶為“U”)。CLL或前列腺癌可以通過檢測miR15或miR16基因拷貝數(shù)的減少，或者通過檢測 miR15或miR16基因的一個(gè)或多個(gè)拷貝的突變來診斷。miR15或miR16基因拷貝數(shù)從雙倍減少為單倍，或者減少到?jīng)]有拷貝，則診斷為CLL或前列腺癌。同樣地，miR15或miR16基因的一個(gè)或多個(gè)拷貝的突變表示基因功能的丟失，則診斷為CLL或前列腺癌。這里所用的“CLL細(xì)胞”是來自患有或懷疑患有CLL的患者的淋巴細(xì)胞，其中淋巴細(xì)胞的“CLL 分?jǐn)?shù)”至少為 4，這是根據(jù) Matutes et al. (1994)，Leukemia 8(10) 1640-1645 所述的評(píng)分系統(tǒng)確定的，在此引入其全文作為參考。這里所用的“前列腺癌細(xì)胞”是來源于的前列腺的贅生物或腫瘤細(xì)胞，不管其是否位于前列腺中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地鑒別CLL或前列腺癌細(xì)胞。miR15/miR16基因簇的位置在13ql4。這些基因的核酸序列包含在克隆317gll中， 其核苷酸序列的GenBank記錄號(hào)是AC069475。在此引入該記錄的全部內(nèi)容作為參考?？梢酝ㄟ^測定懷疑患有CLL或前列腺癌的患者組織中的這些基因的結(jié)構(gòu)或序列，并將其與該患者的未受影響的組織樣品中，或正常對(duì)照組織的樣品中的這些基因的結(jié)構(gòu)或序列進(jìn)行比較，從而檢測miR15或miR16基因的缺失或突變?？梢杂萌魏芜m當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行這種比較。根據(jù)本發(fā)明，要診斷miR15或miR16介導(dǎo)的癌癥，要從患者中獲取組織樣品。然后制備樣品并測定miR15或miR16基因產(chǎn)物的表達(dá)或miR15或miR16基因的缺失或突變。組織樣品包括感興趣的活組織，以及血液和體液樣品。這里所說的“miR15或miR16介導(dǎo)的癌癥”是指在至少一部分與該癌癥相關(guān)的腫瘤細(xì)胞或贅生物細(xì)胞中miR15或miR16基因減少或缺失的任何癌癥。miR15或miR16介導(dǎo)的癌癥的實(shí)例包括CLL和前列腺癌。miR15或miR16缺失或突變的存在可以通過患者基因組DNA的Southern blot雜交來檢測，使用miR15或miR16基因的探針，例如如下所述的。另外，可以從懷疑患有CLL 或前列腺癌的患者中獲取血液樣品，分離白細(xì)胞進(jìn)行DNA提取。優(yōu)選血液或組織樣品是從還沒有開始放射療法或化學(xué)療法的患者中獲得的。作為對(duì)照的相應(yīng)的組織或血液樣品可以從該患者的未受影響的組織中，或者從正常的人個(gè)體中獲得。Southern blot雜交技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如將從懷疑患有CLL或前列腺癌的患者的組織或血液中分離的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶消化。消化產(chǎn)生基因組DNA的限制性片段，可以用電泳，例如瓊脂糖電泳分離。然后將限制性片段點(diǎn)樣在雜交膜(例如硝酸纖維素或尼龍)上，并與miR15或miR16基因特異的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交。與該患者的DNA樣品進(jìn)行了相同處理的對(duì)照DNA樣品相比，雜交膜上限制性片段類型的改變表示這些基因發(fā)生缺失或突變。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地確定適合于檢測miR15或 miR16基因拷貝數(shù)或突變的探針標(biāo)記和雜交條件。這里所用的術(shù)語“缺失”是指基因的部分缺失或全部基因缺失。用于Southern blot雜交的miR15和miR16核酸探針可以根據(jù)公開的 miR15 和 miR16 小分子 RNA 的序列用 Lagos-Quintana et al. (2001)，Science 294 853-858所述的方法設(shè)計(jì)，在此引入其全文作為參考。miR15小分子RNA的核苷酸序列是 uagcagcacauaaugguuugug(SEQ ID NO 3)。 miR16 小分子 RNA 的核昔酸序列是 uagcagcacguaaauauuggcg (SEQ ID NO 4)。檢測 miR15 和 miR16DNA 的合適探針分別是CACAAACCATTATGTGCTTGCTA(SEQ ID NO 5)GCCAATATTTACGTGCTGCTA(SEQ ID NO 6)SEQ ID NO :5禾PSEQ ID NO :6的互補(bǔ)序列也可以用作miR15和miR16 DNA的探針。
制備標(biāo)記的DNA和RNA探針的方法，以及與靶核苷酸序列雜交的條件如Molecular CloninR :A Laboratory Manual, J. Sambrook et al. , eds. , 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Chapters 10 and 11 所述,在此弓I入作為參考。例如，核酸探針可以用例如放射性核素如力，邛，吁，噸或 ；重金屬；或者能與標(biāo)記的配體特異性結(jié)合的配體(例如生物素，抗生物素蛋白或抗體)，熒光分子，化學(xué)發(fā)光分子，酶等物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。可以用Rigby et al. (1977)，J. Mol. Biol. 113 :237-251 所述的缺口平移法或 Fienberg et al. (1983)，Anal. Biochem. 132 :6_13所述的隨機(jī)引物法獲得高比活性的標(biāo)記探針，在此引入其全文作為參考。后者則是從單鏈DNA或RNA模板合成高比活性32P標(biāo)記的探針的方法。例如，根據(jù)缺口平移法，通過用具有高放射活性的核苷酸替換已存在的核苷酸，可以制備得具有超過108cpm/mg的比活性的32P標(biāo)記的核酸探針。然后將雜交膜曝光在膠片上，進(jìn)行放射自顯影檢測。對(duì)雜交膜曝光的膠片進(jìn)行光密度掃描，得到miR15或 miR16基因拷貝數(shù)的精確測量結(jié)果。而且miR15或miR16基因拷貝數(shù)還可以用計(jì)算機(jī)成像系統(tǒng)，例如 Amersham Biosciences, Piscataway, NJ 的 Molecular Dynamics 400-B 2D Phosphorimager進(jìn)行定量分析。如果無法用放射性核素對(duì)DNA或RNA探針進(jìn)行標(biāo)記，可以使用隨機(jī)引物法將dTTP 類似物5-(N-(N-生物素基一氨基己酸基)-3-氨基烯丙基)脫氧尿嘧啶三磷酸鹽引入到探針分子中。生物素化的探針寡核苷酸可以通過與與熒光染色或能產(chǎn)生顏色反應(yīng)的酶偶連的生物素結(jié)合蛋白如抗生物素蛋白，抗生物素蛋白鏈菌素，或抗生物素抗體反應(yīng)來檢測。miR15或miR16基因的缺失或突變還可以通過用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增這些基因的片段，用測序或電泳分析擴(kuò)增的片段以確定患者DNA樣品的擴(kuò)增片段的序列和/或長度是否和對(duì)照DNA樣品有所不同來檢測。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地確定DNA片段的PCR擴(kuò)增的合適反應(yīng)和循環(huán)條件。如下所述的實(shí)施例中使用的方法給出了典型的PCR反應(yīng)和循環(huán)條件。miR15或miR16介導(dǎo)的癌癥的診斷可以通過檢測不同染色體標(biāo)記，例如

圖1A，1B， 和2A-2D中所示的各標(biāo)記之間13ql4的缺失來進(jìn)行。例如，在含有miR15或miR16的微衛(wèi)星標(biāo)記D13S272和D13S273之間的13ql4區(qū)域的缺失表明存在miR15或miR16介導(dǎo)的癌癥。另外，如果13ql4的缺失是在微衛(wèi)星標(biāo)記D13S1150和D13S273之間或是在Alul8位點(diǎn)和微衛(wèi)星標(biāo)記D13S273之間，其中miR15或miR16缺失，則表明存在miR15或miR16介導(dǎo)的癌癥。另外一種確定組織樣品中每個(gè)二倍體基因組的miR15或miR16基因數(shù)目的方法是基于miR15/miR16基因簇位于13ql4并且與標(biāo)記D13S272和D13S273相連的事實(shí)。在與 D13S272和D13S273標(biāo)記相連的位點(diǎn)雜合的個(gè)體的miR15或miR16基因拷貝的丟失可以從這些標(biāo)記雜合的丟失推知。確定染色體標(biāo)記雜合丟失的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。下述實(shí)施例3中給出了雜合丟失研究的實(shí)例。另一種確定懷疑患有CLL或前列腺癌的患者中miR15或miR16基因是否突變的方法是單鏈構(gòu)象多肽性(SSCP)，例如Orita et al. (1989)，Genomics 5 :874-879和 Hayashi (1991), PCR Methods and Applic. 1 :34-38中所述的，在此引入其全文作為參考。 SSCP方法包括通過PCR擴(kuò)增感興趣的基因片段，使片段變性并在非變性條件下用兩條變性單鏈進(jìn)行電泳。單鏈呈現(xiàn)復(fù)雜的依賴于序列的鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)，影響鏈的電泳遷移率。miR15或miR16基因中一個(gè)或全部的缺失或突變還會(huì)引起miR15或miR16基因表達(dá)的減少。因此，CLL或前列腺癌還可以通過檢測miR15或miR16基因產(chǎn)生的RNA的表達(dá)水平來診斷，miR15或miR16基因表達(dá)的減少則診斷為CLL或前列腺癌。miR15和miR16基因每個(gè)都轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生 701Λ的前體RNA，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。前體RNA 不翻譯成蛋白質(zhì)，而是進(jìn)一步處理成為“小分子RNA”或“miRNA”，認(rèn)為這才是有功能的基因產(chǎn)物。這里所說的“miR15或miR16基因產(chǎn)物”是指由miR15和miR16基因而來的處理過的或是未處理的RNA轉(zhuǎn)錄物，下面將進(jìn)一步說明。術(shù)語“RNA”，"RNA轉(zhuǎn)錄物”和“基因產(chǎn)物” 在本文中述及miR15或miR16基因表達(dá)時(shí)可互換使用。miR15禾口miR16 前體RNA如 Lagos-Quintana et al. (2001), Science 294,853-858 所述，在此引入其全文作為參考。miR15和miR16前體RNA的序列如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2所示。預(yù)測的SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的莖環(huán)結(jié)構(gòu)分別如圖IA和圖IB所示。[SEQ ID NO 1]ccuuggaguaaaguagcagcacauaaugguuuguggauuuugaaaaggugcaggccauauugugcugcc ucaaaaauacaagg[SEQ ID NO:2]:gucagcagugccuuagcagcacguaaauauuggcguuaagauucuaaaauuaucuccaguauuaacugu g cugcugaagu aagguugac不受任何理論的限制，認(rèn)為miR15和miR16前體RNA是由miR15/miR16基因簇共表達(dá)的，由Dicer/Argonaute復(fù)合體處理成為功能性miRNA產(chǎn)物。參見，例如Lee et al. (2001), Science 294 :862。這些基因產(chǎn)生的兩個(gè)功能性miRNA產(chǎn)物都是長度為22個(gè)核苷酸的單鏈RNA分子，5’端具有單磷酸鹽，3’端具有羥基。處理過的miR15小分子RNA的核苷酸序列是uagcagcacauaaugguuugug (SEQ ID NO 3)。處理過的miR16小分子RNA的核苷酸序列是uagcagcacguaaauauuggcg(SEQ ID NO :4)。在本發(fā)明中，可以檢測到由miR15或 miR16基因產(chǎn)生的60-70nt的RNA前體分子。另外還可以檢測到由Dicer和Argonaute蛋白對(duì)前體RNA進(jìn)行處理產(chǎn)生的較短的miR15和miR16小分子RNA基因產(chǎn)物。確定RNA表達(dá)水平的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如，如上所述從懷疑患有 CLL或前列腺癌的患者中獲得組織或血液樣品。如上所述從患者的未受影響的組織中，或從正常人個(gè)體中獲得相應(yīng)的組織或血液樣品作為對(duì)照。對(duì)照組織或血液樣品與患者的樣品一同處理。然后將患者中miR15或miR16基因的表達(dá)水平與患者中未受影響的組織的相比， 或者與正常對(duì)照的組織或血液中的miR15或miR16表達(dá)水平相比。例如，CLL細(xì)胞或樣品前列腺癌細(xì)胞中的相對(duì)miR15或miR16表達(dá)水平可以相對(duì)于一種或多種標(biāo)準(zhǔn)容易地確定。 這些標(biāo)準(zhǔn)包括，例如，一種是表達(dá)水平為零，另一種是同一個(gè)患者的正常組織的基因表達(dá)水平，或正常對(duì)照組組織中的表達(dá)水平。所述標(biāo)準(zhǔn)還可以包括標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系中的miR15或miR16 表達(dá)水平。miR15或miR16表達(dá)與正常表達(dá)水平相比減少的量表示治療后將具有的臨床效果。
另外，還可以將懷疑患有CLL或前列腺癌的患者中的miR15或miR16基因表達(dá)水平與先前獲得的正常對(duì)照人群的miR15或miR16基因表達(dá)的平均水平相比較。
確定細(xì)胞中特定基因的RNA轉(zhuǎn)錄物水平的適當(dāng)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。根據(jù)其中一種方法。用核酸提取緩沖液進(jìn)行勻漿從細(xì)胞中提取總細(xì)胞RNA，然后離心。使核酸沉淀，用DNA酶處理和沉淀除去DNA。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法用瓊脂糖凝膠電泳分離RNA分子， 用例如所謂的“Northerr^blotting技術(shù)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。然后通過加熱將RNA固定在膜上。用與所述RNA互補(bǔ)的具有適當(dāng)標(biāo)記的DNA或RNA探針對(duì)特定的RNA進(jìn)行檢測和定量。參見，例如，Molecular CloninR :A Laboratory Manual, J. Sambrook et al.，eds.， 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Chapter 7,在此弓|入其全文作為參考。用于miR15或miR16 RNA的Northern blot雜交的適當(dāng)探針包括SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO :6ο將雜交膜曝光在膠片上，對(duì)與miR15或miR16 RNA雜交的探針進(jìn)行放射自顯影檢測。對(duì)雜交膜曝光的膠片進(jìn)行光密度掃描可以精確地測量RNA轉(zhuǎn)錄水平。另外，還可以通過雜交結(jié)果的計(jì)算機(jī)成像對(duì)RNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行定量分析，例如用Amersham Biosciences, Piscataway, NJ 白勺 the Molecular Dynamics 400—B 2D Phosphorimager。除了 Northern和其它RNA blotting雜交技術(shù)，還可以用原位雜交技術(shù)檢測RNA 轉(zhuǎn)錄水平。這種技術(shù)比Northern blotting技術(shù)需要的細(xì)胞要少，包括將全細(xì)胞沉積在顯微鏡的蓋片上，用含有放射性標(biāo)記或其它標(biāo)記的cDNA或cRNA探針的溶液檢測細(xì)胞的核酸含量。這種技術(shù)特別適用于分析來自懷疑患有前列腺癌的患者的生物活組織樣品。更詳細(xì)的原位雜交的操作方法如美國專利序列號(hào)5，427，916所述，在此引入其全文作為參考。適用于miR15或miR16 RNA的原位雜交的探針包括SEQ ID NO 5和SEQ ID NO :6。miR15或miR16轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)數(shù)目還可以通過miR15或miR16轉(zhuǎn)錄物的反向轉(zhuǎn)錄， 然后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增(RT-PCR)來測定。miR15或miR16轉(zhuǎn)錄物水平可以與內(nèi)標(biāo)相比較定量，例如，相同樣品中“持家”基因的mRNA水平?？捎米鲀?nèi)標(biāo)的合適的“持家，，基因包括肌球蛋白或甘油醛-3-磷酸酯脫氫酶(G3PDH)。適用于定量RT-PCR的方法以及其它方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。測量miR15和miR16表達(dá)的其它方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括各種測量 RNA轉(zhuǎn)錄和降解速度的方法?？梢詫⒎蛛x的miR15或miR16基因產(chǎn)物，單獨(dú)或是組合給予miR15或miR16介導(dǎo)的癌癥細(xì)胞，從而治療miR15或miR16介導(dǎo)的癌癥。不希望受到任何理論的限制，認(rèn)為miR15 或miR16基因產(chǎn)物能夠抑制這些癌細(xì)胞的贅生物或腫瘤生長。特別是，可以將分離的miR15或miR16基因產(chǎn)物單獨(dú)或是組合給予CLL或前列腺癌細(xì)胞，來治療CLL或前列腺癌。這里所說的“miR15或miR16介導(dǎo)的癌癥細(xì)胞”是指從患有miR15或miR16介導(dǎo)的癌癥的患者中分離得到的腫瘤或是贅生物細(xì)胞。miR15或miR16介導(dǎo)的癌癥細(xì)胞可以通過檢測細(xì)胞中miR15或miR16基因產(chǎn)物的減少或缺失，或者通過檢測細(xì)胞中的癌癥或贅生物表型來識(shí)別。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地識(shí)別具有癌癥或贅生物表型的細(xì)胞。例如，培養(yǎng)物中的細(xì)胞對(duì)于接觸誘導(dǎo)的生長抑制不敏感，繼續(xù)培養(yǎng)的時(shí)候聚集在一起。癌癥或贅生物細(xì)胞還表現(xiàn)出特有的形態(tài)學(xué)變化，細(xì)胞集落無組織生長以及不貼壁生長。癌癥或贅生物細(xì)胞還具有在易感動(dòng)物中形成侵入性腫瘤的能力，這可以用本領(lǐng)域的技術(shù)通過將細(xì)胞注射到無胸腺小鼠中來評(píng)價(jià)。
這里所說的“分離的”基因產(chǎn)物是通過人為介入使得與其自然狀態(tài)不同或從其自然狀態(tài)中分離出來的基因產(chǎn)物。例如，天然存在于活的動(dòng)物中的RNA不是“分離的”。合成的RNA，或者從其自然狀態(tài)的共存物中部分或全部分離出來的RNA是“分離的”。分離的RNA 可以基本上純的形式存在，也可以存在于RNA遞送到其中的細(xì)胞中。因此，遞送到細(xì)胞中， 或者在細(xì)胞，例如CLL或前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)的miR15或miR16基因產(chǎn)物認(rèn)為是“分離的” 基因產(chǎn)物。可以用多種標(biāo)準(zhǔn)方法得到miR15或miR16基因產(chǎn)物。例如，基因產(chǎn)物可以化學(xué)合成或者用本領(lǐng)域公知的方法重組產(chǎn)生。優(yōu)選地，所述RNA產(chǎn)物用適當(dāng)保護(hù)的核糖核苷亞磷酰胺和傳統(tǒng)DNA/RNA合成儀化學(xué)合成。合成RNA分子或合成試劑的供應(yīng)商包 括 Proligo(Hamburg, Germany), Dharmacon Research (Lafayette, CO, USA), Pierce Chemical(part of Perbio Science, Rockford, IL, USA), Glen Research(Sterling, VA, USA)，ChemGenes (Ashland, MA, USA)禾口 Cruachem (Glasgow，UK)。另外，miR15和miR16基因產(chǎn)物可以用任何適當(dāng)?shù)膯?dòng)子用重組環(huán)形或線性DNA 質(zhì)粒表達(dá)。用于在質(zhì)粒中表達(dá)RNA的適當(dāng)啟動(dòng)子包括TO或Hl RNA pol III啟動(dòng)子序列， 或巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知如何選擇其它合適的啟動(dòng)子。本發(fā)明的重組質(zhì)粒還可以包括誘導(dǎo)型或調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子，用以在CLL，前列腺癌，或其它細(xì)胞中表達(dá)miR15和 miR16基因產(chǎn)物。重組質(zhì)粒表達(dá)的miR15和miR16基因產(chǎn)物可以用標(biāo)準(zhǔn)方法從培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中分離出來。重組質(zhì)粒表達(dá)的miR15和miR16基因產(chǎn)物還可以遞送到CLL或前列腺癌細(xì)胞中或直接在其中表達(dá)。用重組質(zhì)粒將miR15和miR16基因產(chǎn)物遞送到CLL或前列腺癌細(xì)胞中將在下面詳細(xì)討論。miR15和miR16基因產(chǎn)物可以分別在單獨(dú)的重組質(zhì)粒中表達(dá)，或者也可以在同一個(gè)重組質(zhì)粒中表達(dá)。優(yōu)選地，miR15和miR16基因產(chǎn)物在單個(gè)質(zhì)粒中作為RNA前體分子表達(dá)，然后用適當(dāng)?shù)奶幚硐到y(tǒng)將前體分子處理成為功能性miRNA分子。適當(dāng)?shù)奶幚硐到y(tǒng)包括體外果蠅細(xì)胞溶出液系統(tǒng)，如Tuschl等的美國公開申請(qǐng)2002/0086356中所述的，在此引入其全文作為參考。適于表達(dá)miR15和miR16基因產(chǎn)物的質(zhì)粒的選擇，向質(zhì)粒中插入核酸序列并表達(dá)基因產(chǎn)物的方法，以及將重組質(zhì)粒遞送到感興趣細(xì)胞中的方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。參見，例如 kng et al. (2002), Molecular Cell 9 :1327-1333 ；Tuschl (2002), Nat. Biotechnol，20 :446-448 ；Brummelkamp et al. (2002), Science 296 :550-553 ；Miyagishi et al. (2002), Nat.Biotechnol. 20 :497-500 ；Paddison et al. (2002), Genes Dev.16 948-958 ；Lee et al. (2002)，Nat. Biotechnol. 20 :500-505 ；禾口 Paul et al. (2002)，Nat. Biotechnol. 20 :505_508，在此引入其全文作為參考。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于表達(dá)miR15或miR16基因產(chǎn)物的質(zhì)粒包括處于CMV中早期啟動(dòng)子控制之下的編碼miR15或miR16前體RNA的序列。這里所述的“處于啟動(dòng)子控制之下”表示編碼miRNA產(chǎn)物的的核酸序列位于該啟動(dòng)子的3’端，使得該啟動(dòng)子可以起始 miRNA產(chǎn)物編碼序列的轉(zhuǎn)錄。miR15或miR16基因產(chǎn)物還可以用重組病毒載體表達(dá)。miR15和miR16基因產(chǎn)物可以用兩個(gè)單獨(dú)的重組病毒載體表達(dá)，或者可以用同一個(gè)病毒載體表達(dá)。重組病毒載體表達(dá)的RNA可以用標(biāo)準(zhǔn)方法從培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中分離出來?；蛘呖梢灾苯釉贑LL或前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)。使用重組病毒載體將miR15或miR16基因產(chǎn)物遞送到CLL或前列腺癌細(xì)胞中將在下面詳細(xì)討論。本發(fā)明的重組病毒載體包括編碼miR15和miR16基因產(chǎn)物的序列和用于表達(dá)RNA 序列的任何合適的啟動(dòng)子。合適的啟動(dòng)子包括，例如U6或Hl RNA pol III啟動(dòng)子序列，或巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知如何選擇其它合適的啟動(dòng)子。本發(fā)明的重組質(zhì)粒還可以包括誘導(dǎo)型或調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子，用以在CLL或前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)miR15和miR16基因產(chǎn)物?？梢允褂媚軌蚪邮躮iR15和miR16基因產(chǎn)物的編碼序列的任何病毒載體；例如，來自腺病毒(AV)；腺相關(guān)病毒(AAV)；逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如慢病毒(LV)，棒狀病毒，鼠白血病毒)；皰疹病毒等的載體。還可以用包被蛋白或其它病毒的其它表面蛋白修飾載體從而改變病毒載體的趨向性。例如，可以用皰疹性口炎病毒(VSV)，狂犬病毒，埃博拉病毒，莫科拉病毒等修飾本發(fā)明的AAV載體。適用于本發(fā)明的重組病毒載體的選擇，向載體中插入核酸序列并表達(dá)基因產(chǎn)物的方法，以及將病毒載體遞送到感興趣細(xì)胞中的方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。參見，例如，Dornburg(1995)，Gene Therap. 2 =301-310 ； Eglitis(1988)，Biotechniques 6 :608-614 ；Miller(1990), Hum. Gene Therap. 1 :5-14 ；禾口 Anderson(1998)，Nature 392 :25_30，在此引入其全文作為參考。優(yōu)選的病毒載體是來自于AV和AAV的載體。適用于表達(dá)本發(fā)明的miRNA的AV載體，構(gòu)建重組AV載體的方法，和將載體遞送到靶細(xì)胞中的方法，在Xia et al. (2002), Nat. Biotech. 20 :1006-1010中有描述，在此引入其全文作為參考。適于表達(dá)本發(fā)明的miRNA 的AAV載體，構(gòu)建重組AAV載體的方法，和將載體遞送到靶細(xì)胞中的方法，在Samulski et al. (1987)，J. Virol. 61 :3096-3101 ；Fisher et al. (1996)，J. Viral. ,70 :520-532 ； Samulski et al. (1989)，J. Virol. 63 :3822-3826 ；美國專利序列號(hào) 5，252，479 ；美國專利序列號(hào)5，139,941 ；國際專利申請(qǐng)WO 94/13788 ；和國際專利申請(qǐng)WO 93Λ4641，在此引入其全文作為參考。優(yōu)選地，miR15和miR16基因產(chǎn)物用含有CMV中早期啟動(dòng)子的單個(gè)重組AAV 載體表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組AAV病毒載體包括編碼miR15或miR16前體RNA 的核酸序列，可操作地與PolyT終止序列相連，并處于人TO RNA啟動(dòng)子的控制之下。這里所述的“可操作地與PolyT終止序列相連”是指編碼有義鏈或反義鏈的核酸序列在5’方向緊鄰PolyT終止信號(hào)。在miR15或miR16序列在載體中轉(zhuǎn)錄的過程中，polyT終止信號(hào)用于終止轉(zhuǎn)錄。在本發(fā)明中，miR15或miR16基因產(chǎn)物用于抑制miR15或miR16介導(dǎo)的癌細(xì)胞，特別是CLL或前列腺癌細(xì)胞的贅生物或腫瘤生長。不希望受到任何理論的限制，認(rèn)為處理過的miR15和miR16 miRNA與這些細(xì)胞中起始和/或維持贅生物或腫瘤細(xì)胞生長所必需的一個(gè)或多個(gè)靶mRNA中的互補(bǔ)序列相結(jié)合。因此，本發(fā)明提供了一種在需要這種治療的患者中治療miR15或miR16介導(dǎo)的癌癥，例如CLL或前列腺癌的方法。所述方法包括給予患者有效量的miR15或miR16基因產(chǎn)物，使得miR15或miR16介導(dǎo)的癌細(xì)胞的增殖受到抑制。如上所述，miR15或miR16介導(dǎo)的癌癥是指其中在與該疾病相關(guān)的腫瘤或贅生物細(xì)胞的至少一部分中miR15或miR16基因中的任何一個(gè)或兩者都減少或缺失的癌癥。在CLL或前列腺癌的腫瘤或贅生物細(xì)胞中miR15或miR16基因的表達(dá)減少或缺失；因此，CLL 和前列腺癌被認(rèn)為是miR15或miR16介導(dǎo)的癌癥。在其它癌癥中也發(fā)現(xiàn)miR15或miR16基因表達(dá)的減少或缺失；這些癌癥也被視為是miR15或miR16介導(dǎo)的癌癥。例如，至少在下述組織分型的癌癥的初級(jí)或轉(zhuǎn)移性腫瘤或贅生物細(xì)胞中miR15或 miR16基因表達(dá)減少或缺失肉瘤(中表層的結(jié)締組織和其他組織癌癥)；黑色素瘤(源于黑色素細(xì)胞的癌癥)；癌(上皮癌癥)；腺癌(腺上皮癌癥)；神經(jīng)系統(tǒng)癌癥(神經(jīng)膠質(zhì)瘤/ 成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和星狀細(xì)胞瘤)；和血液瘤，例如白血病和淋巴瘤(例如，急性淋巴細(xì)胞白血病和慢性骨髓性白血病)。在來源于至少下述器官或組織的癌癥中miR15或miR16基因表達(dá)也減少或缺失， 不管其組織分型如何乳腺；男性和女性泌尿生殖組織(例如輸尿管，膀胱，前列腺，睪丸， 卵巢，子宮頸，子宮，陰道)；肺；胃腸系統(tǒng)組織(例如，胃，大腸和小腸，結(jié)腸，直腸)；外分泌腺例如胰腺和腎上腺；口腔和食道組織；腦和脊髓；腎(腎臟)；胰腺；肝膽系統(tǒng)(例如，肝， 膽囊)；淋巴系統(tǒng)；平滑肌和橫紋肌；骨骼和骨髓；皮膚和眼部組織。在癌癥或腫瘤的預(yù)后階段miR15或miR16基因表達(dá)也減少或缺失，例如可用"Overall Stage Groupings，，(也稱為"Roman Numeral，，)或"Tumor, Nodes, and Metastases" (TNM)分期系統(tǒng)測量。對(duì)于給定癌癥的適合的預(yù)后分期系統(tǒng)和分期描述是本領(lǐng)域公知的,例如在National Cancer Institute的“CancerNet”國際互聯(lián)網(wǎng)站上所述的。需要治療miR15或miR16介導(dǎo)的癌癥的患者可以通過下述方法鑒別從該患者獲得腫瘤或贅生物細(xì)胞(或者懷疑是腫瘤或贅生物的細(xì)胞)樣品，測定其中至少一部分細(xì)胞與得自該患者正常組織的細(xì)胞相比miR15或miR16的表達(dá)是否減少或缺失。檢測細(xì)胞中 miR15或miR16基因表達(dá)水平的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(如上所述)。另外，得自患者的細(xì)胞中的miR15或miR16表達(dá)還可以與這些基因在正常人群的細(xì)胞中的平均表達(dá)水平相比較。醫(yī)生可以容易地用標(biāo)準(zhǔn)診斷技術(shù)鑒別需要治療CLL的患者。參見，例如"Chronic lymphocytic leukemia recommendations for diagnosis, staging, and response criteria. International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia," (1989)Annals of Internal Medicine 110(3) :236_238，在此引入其全文作為參考。例如，患有CLL的患者具有循環(huán)的CLL細(xì)胞，表現(xiàn)出淋巴細(xì)胞增多(即血液中的淋巴細(xì)胞數(shù)目等于或大于每立方毫米10，000個(gè)細(xì)胞)，以及CLL細(xì)胞在骨髓和淋巴組織中逐漸積累。患者血液或其它組織中CLL細(xì)胞的鑒定可以通過直接目測觀察血液樣品，和/或測定淋巴細(xì)胞的“CLL分?jǐn)?shù)”來驗(yàn)證。CLL分?jǐn)?shù)表示是否存在CLL細(xì)胞的五個(gè)淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記⑶5+，⑶23+，F(xiàn)MC7-，和表面免疫球蛋白(SmIg)的微弱表達(dá)(+/-)和⑶22。該評(píng)分系統(tǒng)對(duì)這五個(gè)標(biāo)記中的每一個(gè)都給出1或0的值，依據(jù)是其對(duì)CLL是典型的還是非典型的。CLL 細(xì)胞的CLL分?jǐn)?shù)為4或5，而其它白血病的淋巴細(xì)胞的CLL分?jǐn)?shù)為< 1到3。參見Matutes et al. (1994), Leukemia 8 10 :1640-1645 and Moreau et al. (1997) ,American Journal of Clinical Pathology，108 :378_82，在此引入其全文作為參考。CLL細(xì)胞與正常外周血B 細(xì)胞相比膜表面的免疫球蛋白水平較低。淋巴細(xì)胞膜表面的免疫球蛋白水平可以容易地用標(biāo)準(zhǔn)方法檢測；參見,例如Rozman et al. (1995),New England Journal of Medicine 333 1052-1057，在此引入其全文作為參考。醫(yī)生也可以容易地根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)診斷技術(shù)鑒別出需要治療前列腺癌的患者，所用的標(biāo)準(zhǔn)例如患者年齡，用肛門觸診檢查出前列腺增大，前列腺特異的抗原(“PSA”)水平，組織的格里森分?jǐn)?shù)，以及存在在免疫組織化學(xué)水平上可檢測到的遺傳標(biāo)記，例如前列腺組織細(xì)胞上的p53，p21，和細(xì)胞周期蛋白。血清PSA水平為20ng/ml或更高并且前列腺組織分化不佳(例如格里森分?jǐn)?shù)為8或更高)表示患有前列腺癌?；颊咧星傲邢倌[瘤的存在也可以通過非侵入性的成像技術(shù)驗(yàn)證，例如CT掃描，對(duì)前列腺的經(jīng)直腸的超聲檢查(“TRUSP”)，以及磁共振成像(“MRI”)，這些技術(shù)都是本領(lǐng)域公知的。這里所述的miR15或miR16基因產(chǎn)物的“有效量”是指足以抑制患有miR15或 miR16介導(dǎo)的癌癥的患者中miR15或miR16介導(dǎo)的癌細(xì)胞的量。例如，miR15或miR16基因產(chǎn)物的有效量可以是足以抑制患有CLL的患者中CLL細(xì)胞增殖的量，或患有前列腺癌的患者中前列腺癌細(xì)胞增殖的量。應(yīng)當(dāng)理解，“前列腺腫瘤細(xì)胞”不一定存在于前列腺中，而是包括來源于前列腺的轉(zhuǎn)移腫瘤的細(xì)胞。這里所說的“抑制miR15或miR16介導(dǎo)的癌細(xì)胞的增殖”是指殺死細(xì)胞，或永久性或暫時(shí)性地使細(xì)胞停止生長。如果在施用了 miR15或miR16產(chǎn)物以后患者中的這些細(xì)胞保持不變或減少，那么則可以推斷出miR15或miR16介導(dǎo)的癌細(xì)胞的增殖受到了抑制。如果這些細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量增加，但是腫瘤生長的速度降低了，那么也認(rèn)為miR15或miR16介導(dǎo)的癌細(xì)胞的增殖受到了抑制?；颊唧w內(nèi)miR15或miR16介導(dǎo)的癌細(xì)胞的數(shù)量可以通過直接測量確定，或者從原始或轉(zhuǎn)移腫瘤塊的尺寸估計(jì)確定。例如，患者CLL細(xì)胞的數(shù)目可以容易地確定，例如通過全血或白細(xì)胞計(jì)數(shù)。CLL細(xì)胞的數(shù)目還可以通過免疫組織化學(xué)方法，流式細(xì)胞術(shù)，或其它用于檢測CLL細(xì)胞的特征性表面標(biāo)記容易地測定。前列腺腫瘤塊可以通過直接目測觀察，或者通過診斷性成像方法例如X射線，磁共振成像，超聲波，和閃爍照相法來測定。用于確定腫瘤塊尺寸的診斷性成像方法可以與對(duì)照試劑一起使用或者不與其一起使用，如本領(lǐng)域公知的。腫瘤塊的尺寸還可以用物理方法測定，例如組織塊的觸診或者用測量儀器例如測徑器對(duì)組織塊進(jìn)行測量。對(duì)于前列腺腫瘤， 優(yōu)選的確定腫瘤塊尺寸的物理方法是肛門觸診。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定給特定患者施用的miR15或miR16基因產(chǎn)物的有效量，其是根據(jù)下列參數(shù)，如患者的個(gè)頭和體重；疾病的程度；患者的年齡，健康狀況和性別；給藥方式；以及給藥是局部的還是全身性的。例如，本發(fā)明的化合物的有效量可以是基于要治療的腫瘤塊的近似重量。腫瘤塊的近似重量可以通過計(jì)算腫瘤塊的近似體積測定，其中一立方厘米的體積重約一克。基于腫瘤塊重量的miR15或miR16基因產(chǎn)物的有效量可以是至少10mg/g腫瘤塊，優(yōu)選是 10-500mg/g腫瘤塊。更優(yōu)選地，有效量是至少60mg/g腫瘤塊。特別優(yōu)選的是，有效量是至少100mg/g腫瘤塊。優(yōu)選將基于腫瘤塊重量的有效量直接注射到腫瘤中。miR15或miR16基因產(chǎn)物的有效量可以是基于要治療的患者的近似或估計(jì)體重。 優(yōu)選地，該有效量是腸胃外或腸給藥，如下所述。例如，給予患者的miR15或miR16基因產(chǎn)物的有效量是5-3000mg/kg體重，優(yōu)選是700-1000mg/kg體重，更優(yōu)選是大于1000mg/kg體重。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定對(duì)給定患者給予miR15或miR16基因產(chǎn)物的合適的給藥方案。例如miR15或miR16基因產(chǎn)物可以一次性給予患者(例如單次注射或沉積)。 另外，該基因產(chǎn)物還可以每天給予患者一到兩次，給藥時(shí)間持續(xù)大約三到大約二十八天，更優(yōu)選是大約七到大約十天。在優(yōu)選的給藥方案中，miR15或miR16基因產(chǎn)物每天給藥一次， 持續(xù)七天。如果給藥方案是多次給藥，應(yīng)當(dāng)理解給予患者的miR15或miR16基因產(chǎn)物的有效量是在整個(gè)給藥方案中給予的基因產(chǎn)物的總量。miR15或miR16基因產(chǎn)物可以通過任何適于將該基因產(chǎn)物遞送到患者細(xì)胞，例如造血干細(xì)胞(HSC)，CLL細(xì)胞或前列腺癌細(xì)胞中的方式給予患者。例如miR15或miR16基因產(chǎn)物可以用適合于用miR15或miR16基因產(chǎn)物，或者用含有編碼miR15或miR16基因產(chǎn)物的序列的核酸轉(zhuǎn)染患者細(xì)胞的方式給藥。細(xì)胞可以直接用miR15或miR16基因產(chǎn)物(當(dāng)其是核酸的時(shí)候)轉(zhuǎn)染，或者可以用含有編碼miR15或miR16基因產(chǎn)物的序列的核酸轉(zhuǎn)染。優(yōu)選地，細(xì)胞用含有編碼miR15或miR16基因產(chǎn)物的序列的質(zhì)?；虿《据d體轉(zhuǎn)染，如上所述。真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法是本領(lǐng)域公知的，包括將核酸直接注射到細(xì)胞核或細(xì)胞原核中；電穿孔；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化或者由親脂性物質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化；受體介導(dǎo)的核酸遞送，生物彈或粒子加速；磷酸鈣沉淀，病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。例如，細(xì)胞可以用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化化合物，例如D0TAP(N-[1_(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N, N-三甲基-甲硫酸銨，Boehringer-Mannheim)或其等同物例如LIP0FECTIN轉(zhuǎn)染。所使用的核酸的量對(duì)于本發(fā)明的實(shí)施并不重要；用0. I-IOOmg核酸/IO5個(gè)細(xì)胞都能得到滿意的結(jié)果。例如，使用的量可以是每IO5個(gè)細(xì)胞:3mg D0TAP，其中含有0. 5mg質(zhì)粒載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，從患者中分離出miR15或miR16介導(dǎo)的癌細(xì)胞，例如CLL或前列腺癌，用編碼miR15或miR16基因產(chǎn)物的核酸轉(zhuǎn)染，并重新植入患者中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)染的和重新植入的細(xì)胞是CLL細(xì)胞。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)染的和重新植入的細(xì)胞是診斷為CLL的患者的HSC。從患者中提取CLL細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，例如下述實(shí)施例7中所述的。 從患者中提取、鑒別、分離和培養(yǎng)HSC的技術(shù)也是本領(lǐng)域公知的，例如美國專利序列號(hào) 5，635，387 和 5，643，741，以及 Campana et al. (1995)Blood 85 :1416-1434 中所述的，在此引入其全文作為參考。優(yōu)選地，在轉(zhuǎn)染HSC之前從收集的骨髓中提取出腫瘤或贅生物細(xì)胞。合適的提取技術(shù)包括，例如固定化外周血細(xì)胞的白細(xì)胞去除，基于免疫親和的選擇或殺死腫瘤細(xì)胞，或者使用細(xì)胞毒性或者光敏試劑選擇性地殺死腫瘤細(xì)胞，都是本領(lǐng)域公知的。參見，例如，Bone Marrow Processing and Purging, Part 5 (A. Gee, ed. ), CRC Press, Boca Raton,Fla.，1991 ；Lydaki et al. (1996)J. Photochem. and Photobiol. 32 :27-32 ；和 Gazitt et al. (1995)，Blood，86 :381_389，在此引入其全文作為參考。分離的CLL細(xì)胞或HSC可以用任何適當(dāng)?shù)募夹g(shù)轉(zhuǎn)染，如上所述。轉(zhuǎn)染之后檢查一部分CLL細(xì)胞或HSC以驗(yàn)證所述基因產(chǎn)物是否具有適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)水平。一旦驗(yàn)證了 miR15或 miR16基因產(chǎn)物具有適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)，就將其余的轉(zhuǎn)染細(xì)胞重新引入到患者中。轉(zhuǎn)染的CLL細(xì)胞或HSC可以通過腸胃外方法重新引入到患者中，包括靜脈輸注或向骨髓中直接注射。轉(zhuǎn)染細(xì)胞優(yōu)選以鹽溶液或其它藥學(xué)可接收的載體重新引入患者。重新引入的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的合適的數(shù)量是每kg患者體重大約IO5到大約IO8個(gè)細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染之前可在培養(yǎng)基中擴(kuò)張細(xì)胞從而增加可用于重新引入的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的數(shù)量。優(yōu)選地，CLL細(xì)胞或HSC用含有編碼miR15或miR16基因產(chǎn)物的序列的核酸，例如能穩(wěn)定整合到CLL細(xì)胞或HSC基因組中以長期表達(dá)該化合物的質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染。穩(wěn)定的整合和表達(dá)可以用本領(lǐng)域公知的技術(shù)驗(yàn)證，例如用miR15或miR16 cDNA(或其片段)作為探針對(duì)基因組DNA進(jìn)行Southern blot。miR15或miR16基因產(chǎn)物的表達(dá)還可以用標(biāo)準(zhǔn) Northern blot技術(shù)來檢測。用編碼miR15或miR16基因產(chǎn)物的序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CLL細(xì)胞或HSC在重新植入患者中以后會(huì)繼續(xù)表達(dá)該化合物。從患者中分離HSC，用表達(dá)miR15或 miR16基因產(chǎn)物的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，并將轉(zhuǎn)染的HSC重新植入到患者中的示例性方法如下述實(shí)施例8所示。miR15或miR16基因產(chǎn)物還可以通過任何適當(dāng)?shù)哪c或腸胃外給藥方式給予患者。 適用于本發(fā)明的適當(dāng)?shù)哪c給藥方式包括口服，直腸，或鼻內(nèi)遞送。適當(dāng)?shù)哪c胃外給藥方式包括血管內(nèi)給藥(例如靜脈高劑量注射，靜脈輸注，動(dòng)脈內(nèi)高劑量注射，動(dòng)脈內(nèi)輸注和經(jīng)導(dǎo)管輸注到脈管系統(tǒng)中)；組織外和組織內(nèi)注射(例如腫瘤外和腫瘤內(nèi)注射，視網(wǎng)膜內(nèi)注射， 或視網(wǎng)膜下注射)；皮下注射或沉積，包括皮下輸注(例如滲透泵)；直接應(yīng)用到感興趣的組織上，例如通過導(dǎo)管或其它放置裝置(例如視網(wǎng)膜顆?；蛩▌┗蚝卸嗫祝瑹o孔，或膠狀物質(zhì)的植入物)；以及吸入。優(yōu)選地，miR15或miR16基因產(chǎn)物通過注射或輸注給藥。對(duì)于 miR15或miR16介導(dǎo)的含有腫瘤塊的癌癥，優(yōu)選miR15或miR16基因產(chǎn)物通過直接注射到腫瘤中給藥。在本文的方法中，miR15或miR16基因產(chǎn)物可以作為裸露的RNA，或者和遞送試劑一起，或者作為含有能表達(dá)該基因產(chǎn)物的序列的核酸(例如重組質(zhì)?；虿《据d體)給藥。 適用于miR15或miR16基因產(chǎn)物給藥的合適的遞送試劑包括Mirus Transit TKO親脂性試劑；Iipofectin ；Iipofectamine ；cellfectin ；或聚陽離子(例如聚賴氨酸)，或脂質(zhì)體。含有能表達(dá)miR15或miR16基因產(chǎn)物的序列的重組質(zhì)粒如上所述。含有能表達(dá) miR15或miR16基因產(chǎn)物的序列的重組病毒載體也如上所述，將這些載體遞送到患者的CLL 或前列腺癌細(xì)胞中的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂質(zhì)體可用于將miR15或miR16基因產(chǎn)物，或含有編碼該基因產(chǎn)物的序列的核酸遞送到患者中。脂質(zhì)體還可以增加該基因產(chǎn)物或核酸在血液中的半衰期。在本發(fā)明的該實(shí)施方案的實(shí)踐中，所述的miR15或miR16基因產(chǎn)物，或含有編碼該基因產(chǎn)物的序列的核酸可以在給患者施用之前裝入到脂質(zhì)體中。適用于本發(fā)明的脂質(zhì)體可以用標(biāo)準(zhǔn)的可形成載體的脂類制備，通常包括中性的或具有負(fù)電荷的磷脂和留醇例如膽固醇。脂類的選擇通?？梢砸罁?jù)各種因素例如所希望的脂質(zhì)體大小和脂質(zhì)體在血管中的半衰期。已知多種制備脂質(zhì)體的方法，例如et al. (1980)，Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9 :467 ；和美國專利序列號(hào) 4，235，871,4, 501，728， 4，837，028，和5，019，369中所述的，在此引入其全文作為參考。包含有miR15或miR16基因產(chǎn)物，或含有編碼該基因產(chǎn)物的序列的核酸的脂質(zhì)體可以包含能夠?qū)⑺鲋|(zhì)體靶定到miR15或miR16介導(dǎo)的癌細(xì)胞，例如CLL或前列腺癌細(xì)胞上的配體分子。在這些癌細(xì)胞中普遍能與受體結(jié)合的配體，例如能與腫瘤細(xì)胞抗原或CLL 細(xì)胞表面標(biāo)記的單克隆抗體是優(yōu)選的。還可以對(duì)包含有miR15或miR16基因產(chǎn)物，或含有編碼該基因產(chǎn)物的序列的核酸的脂質(zhì)體進(jìn)行修飾以避免被單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)(“匪S”)和網(wǎng)狀內(nèi)皮組織系統(tǒng)(“RES”) 清除。這種修飾的脂質(zhì)體的表面上或其脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)中具有調(diào)理作用抑制分子。在特定的優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)體可以同時(shí)包含調(diào)理作用抑制分子和配體。用于制備本發(fā)明的脂質(zhì)體的調(diào)理作用抑制分子典型地是能與脂質(zhì)體膜結(jié)合的大分子的親水性聚合物。這里所述的調(diào)理作用抑制分子與脂質(zhì)體膜“結(jié)合”是指其與膜發(fā)生化學(xué)或物理連接，例如脂溶性錨定物插入到膜中，或者直接與膜脂的活性基團(tuán)結(jié)合。這些調(diào)理作用抑制親水性聚合物形成具有保護(hù)作用的表面層，能顯著減少脂質(zhì)體被MMS和RES吸收，例如美國專利序列號(hào)4，920，016中所述的，在此引入其全文作為參考。適用于修飾脂質(zhì)體的調(diào)理作用抑制分子優(yōu)選是水溶性聚合物，其平均分子量是大約500到大約40，OOODa,更優(yōu)選是大約2，000到大約20，OOODa0這種聚合物包括聚乙二醇 (PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如甲氧PET或PPG，以及PET或PPG硬脂酸鹽；合成聚合物例如聚丙烯酰胺或聚N-聚乙烯吡咯烷酮；直鏈，枝鏈和分枝聚酰胺基胺；聚丙烯酸；多元醇，例如聚乙烯醇和聚木糖醇，其中羧基和氨基以化學(xué)方法連接，以及神經(jīng)節(jié)苷脂，例如神經(jīng)節(jié)苷脂GM1。也可以使用PEG，甲氧PEG，或甲氧PPG，或其衍生物的共聚物。此外，調(diào)理作用抑制聚合物可以是PEG和聚氨基酸，多聚糖，聚酰胺，聚乙烯胺，或聚核苷酸中的任一個(gè)的嵌段共聚物。所述調(diào)理作用抑制聚合物還可以是天然的含有氨基酸或羧酸，例如半乳糖醛酸，葡萄糖醛酸，甘露糖醛酸，透明質(zhì)酸，果膠酸，神經(jīng)氨酸，褐藻酸，角叉膠的多糖；胺化多糖或寡糖(直鏈或枝鏈)；或羧化多糖或寡糖，例如可與碳酸衍生物反應(yīng)最終連接羧基基團(tuán)。優(yōu)選地，所述調(diào)理作用抑制分子是PEG，PPG，或其衍生物。用PEG或PEG衍生物修飾的脂質(zhì)體有時(shí)被稱為“PEG化的脂質(zhì)體”。調(diào)理作用抑制分子可以通過多種已知方法與脂質(zhì)體膜結(jié)合。例如，PEG的N-羥基琥珀酰亞胺酯可與磷脂酰乙醇胺的脂溶性錨定物相結(jié)合，然后結(jié)合到膜上。類似地，右旋糖苷聚合物可以與十八胺脂溶性錨定物通過用Na (CN) BH和溶劑混合物如30 12的四氫呋喃水在60°C進(jìn)行的還原性胺化作用來衍生化。用調(diào)理作用抑制分子修飾的脂質(zhì)體在循環(huán)系統(tǒng)中保留的時(shí)間比未修飾的脂質(zhì)體長。鑒于此原因，這些脂質(zhì)體有時(shí)稱為“隱形”脂質(zhì)體。隱形脂質(zhì)體已知可在由多孔的或 “有滲漏的”微脈管系統(tǒng)反饋的組織中積累。因此，具有微脈管系統(tǒng)毛病的組織，例如腫瘤土夬，可有效積累這些脂質(zhì)體；參見 Gabizon，et al. (1988)，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA, 18 6949-53。此外，RES吸收的減少由于阻止了該脂質(zhì)體在肝和脾中的積累從而降低了隱形脂質(zhì)體的毒性。因此，用調(diào)理作用抑制分子修飾的脂質(zhì)體適用于將miR15或miR16基因產(chǎn)物， 或含有編碼該基因產(chǎn)物的序列的核酸遞送到腫瘤細(xì)胞中。miR15或miR16基因產(chǎn)物優(yōu)選在給患者施用之前根據(jù)本領(lǐng)域公知的技術(shù)制成藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物至少是無菌的和不含熱源的。這里所說的“藥物制劑”包括用于人的和獸醫(yī)使用的制劑。制備本發(fā)明的藥物組合物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，例如 Remington' s Pharmaceutical Science, 17th ed. , Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)中所述的，在此引入其全文作為參考。本發(fā)明的藥物制劑含有miR15或miR16基因產(chǎn)物，或含有編碼該基因產(chǎn)物的序列的核酸(例如按重量計(jì)0. 1到90 % )，或其生理學(xué)可接收的鹽，并與藥學(xué)可接收的載體相混和。本發(fā)明的藥物制劑還可以包括包含在脂質(zhì)體中的miR15或miR16基因產(chǎn)物，或含有編碼該基因產(chǎn)物的序列的核酸，以及藥學(xué)可接收的載體。優(yōu)選藥學(xué)可接收的載體是水，緩沖液，生理鹽水，0.4%鹽水，0.3%甘氨酸，透明質(zhì)酸等。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包括能抵抗核酸酶降解的miR15或 miR16基因產(chǎn)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地合成具有核酸酶抗性的miR15和miR16基因產(chǎn)物，例如在miR15和miR16基因產(chǎn)物的2’位置加入一種或多種核糖核苷酸。合適的2’ 修飾的核糖核苷酸包括在2’位置具有氟，氨基，烷基，烷氧基，和0-烯丙基修飾的核糖核苷酸。例如，本發(fā)明的藥物組合物含有加入了一個(gè)或多個(gè)具有2' AR-核苷酸的通式的 2，修飾的核糖核苷酸的miR15或miR16基因產(chǎn)物，其中A是氧或鹵素(優(yōu)選氟，氯或溴)；以及R是氫或直鏈或枝鏈CV6烷基；其中當(dāng)A是鹵素的時(shí)候，沒有X和R。優(yōu)選的修飾的2-核糖核苷酸是2’ _0甲基核糖核苷酸。優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物組合物包括其中每個(gè)核糖核苷酸都是2’ -修飾的核糖核苷酸的miR15或miR16基因產(chǎn)物。本發(fā)明的藥物組合物還可以包括傳統(tǒng)的藥物賦形劑和/或添加劑。合適的藥物賦形劑包括穩(wěn)定劑，抗氧化劑，調(diào)節(jié)摩爾滲透壓濃度的試劑，緩沖液，和PH調(diào)節(jié)試劑。合適的添加劑包括生理學(xué)的生物相容的緩沖液(例如鹽酸緩血酸胺)，加入螯合劑(例如DTPA或 DTPA-雙酰胺)或者鈣螯合復(fù)合物(例如DTPA鈣，CaNaDTPA-雙酰胺)，或者，可選擇地，加入鈣鹽或鈉鹽(例如，氯化鈣，抗壞血酸鈣，葡萄糖酸鈣或乳酸鈣)。本發(fā)明的藥物組合物可以以液體形式使用，也可以以凍干形式使用。對(duì)于本發(fā)明的固體藥物組合物，可以使用傳統(tǒng)的無毒的固體的藥學(xué)可接收的載體；例如藥物級(jí)的甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，纖維素，葡萄糖，蔗糖，碳酸鎂等。例如，用于口服給藥的固體藥物組合物可以含有上述的任何載體以及10-95%，優(yōu)選25%-75%的miR15或miR16基因產(chǎn)物。用于噴霧(吸入)給藥的藥物組合物可以含有按重量計(jì)0. 01-20 %，優(yōu)選按重量計(jì)1 % -10 %的包含于上述脂質(zhì)體中的miR15或miR16基因產(chǎn)物，和推進(jìn)劑。還可以包含其它載體；例如用于鼻內(nèi)遞送的卵磷脂。下述非限制性實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明作出說明。
實(shí)施例在實(shí)施例中使用下述方法患者樣品和細(xì)胞系-患者樣品是在得到了被CLL Research Consortium institutions診斷為CLL的患者的知情同意后獲取的。簡短來說，外周血是從CLL患者 Φ I^il W, #- !: Ficoll-Hypaque(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway，NJ)分離的，然后進(jìn)行處理以便按標(biāo)準(zhǔn)方法提取RNA和DNA，如Sambrook J et al. (1989), Molecular cloning :A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)中所述的，在此引入其全文作為參考。將相應(yīng)患者的口腔粘膜DNA放置在小片(l-2mm2)紙上，作為LOH研究中的正常對(duì)照。三十個(gè)人的細(xì)胞系是得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC ；Manassas, VA)并根據(jù) ATCC 的說明培養(yǎng)。這些細(xì)胞系是 AS283, BL2, Bla, BJAB, CA46, Namalva, P3HRI, PAPB 682， PABm，Raji (Burkitt' s 淋巴瘤)，Dell，SKDHL，ST486 (T-細(xì)胞淋巴瘤)，JM(免疫母細(xì)胞 B細(xì)胞淋巴瘤)，MCl 16 (未分化的淋巴瘤)，Molt3, Supt 11 (T-ALL)，似66 (多發(fā)性骨髓瘤)， A549, H1299 (肺癌)，TE2，TElO (食道癌)，HeLa (子宮頸癌)，RC48 (腎癌)和 2220，2221， 11609，11611，LNCAP, TSUR(前列腺癌)。⑶5+B-細(xì)胞的分離-從兒科組(3-9歲)通過常規(guī)的扁桃腺切除術(shù)獲得扁桃腺。用唾液酸苷酶處理過的綿羊紅血球使單核細(xì)胞散開，得到純化的B細(xì)胞。將B細(xì)胞用不連續(xù) Percoll 梯度(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)進(jìn)一步分級(jí)，如 Dono M et al. (2000)，J. Immunol. 164 :5596-5604中所述，在此引入其全文作為參考。從50%的 Percoll級(jí)分中收集B細(xì)胞，并與抗CD5 mAb—起培育，然后與和微磁珠結(jié)合的羊抗鼠Ig — 起培育。收集細(xì)胞并置于磁性柱MS上，用MiniMACS系統(tǒng)(Miltenyi Biotec)通過正選擇獲得⑶5+B細(xì)胞。體細(xì)胞雜交-用傳統(tǒng)方法進(jìn)行體細(xì)胞雜交，在次黃嘌呤-氨喋呤-胸苷(HAT)介質(zhì)上選擇，如 Negrini M et al. (1994)，Cancer Res. 54 1818-18 中所述的，在此引入其全文作為參考。從單個(gè)細(xì)胞克隆和亞克隆中得到的DNA用DNeasy組織試劑盒^jiagen)分離并用PCR檢測是否存在染色體13和染色體2標(biāo)記(引物序列見下述表1)。從一種帶有 t(2;13) (q32 ；ql4)移位的CLL細(xì)胞(CLL-B)中分離得到十五個(gè)克隆，從另一種帶有t (2 ； 13) (ql2 ；ql3)移位的CLL細(xì)胞(CLL-A)中分離得到一個(gè)克隆。十二個(gè)來自CLL-B的克隆帶有染色體13和2的完全互補(bǔ)序列，另外三個(gè)帶有del (13q)和染色體2的完全互補(bǔ)序列。 來自CLL-A的一個(gè)克隆含有在13ql4位置具有染色體13的小缺失并且不含部分染色體2。Northern blottinR-用 Tri Reagent 方法(Molecular Research Center, Inc)分離總RNA。將RNA樣品(每個(gè)30g)在15 %丙烯酰胺變形(脲)Criterion預(yù)制凝膠(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)上分離并轉(zhuǎn)移到 Hybond-N+膜(Amersham Pharmacia Biotech)上。在 42°C在 7% SDS，0. 2M Na2PO4 pH 7. O 的條件下與-32P ATP 雜交過夜。在42°C將膜用h SSPE，0. 1% SDS洗滌兩次，用0. 5x SSPE，0. 1% SDS洗滌兩次。 用于檢測miR15和miR16 RNA的探針分別是CACAAACCATTATGTGCTTGCTA(SEQ ID NO 5)GCCAATATTTACGTGCTGCTA(SEQ ID NO 6)在0. 1% SDS水溶液/0. Ix SSC中煮沸10分鐘剝離雜交膜并重新雜交幾次。用溴化乙錠染色的5S rRNA作為對(duì)照。反向轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)-通過RT-PCR分析正常CD5+細(xì)胞和23 個(gè)B-CLL樣品中的基因表達(dá)水平。用Advantage PCR試劑盒(Clontech)每次擴(kuò)增反應(yīng)用一微升cDNA，每種基因特異性引物IOpmol進(jìn)行35次循環(huán)，94°C 20秒，65°C 30秒， 680C 1分鐘(引物列表見下述表1)。為了保證RT-PCR中使用的RNA具有足夠的純度，用 G3PDH cDNA(Clontech, Palo Alto, CA)特異的引物進(jìn)行 PCR 檢測。用上述 Sambrook J et al. (1989)中的標(biāo)準(zhǔn)方法用瓊脂糖凝膠電泳分離RT-PCR產(chǎn)物。Western blottinR-對(duì)9個(gè)B-CLL患者的細(xì)胞溶解物的SDS/PAGE凝膠產(chǎn)物用 GST-SLUG Middle 抗體(Dr. Thomas Look-Harvard，MA贈(zèng)與)和 SNX2 (附7)抗體(Santa Cruz Biotechnology, CA) @UlJ。 ffi ECL Western Blotting ^111 ^ (Amersham Pharmacia, UK)進(jìn)行檢測，根據(jù)制造商的說明操作。數(shù)據(jù)庫分析-用由National Institutes of Health and the National Libraryof Medicine 維護(hù)的 National Center for Biotechnology Information 網(wǎng)站提供的 BLAST排列工具搜索“nr”和“dbEST”數(shù)據(jù)庫，搜索短的幾乎完全匹配的序列。還可參見 Altschul et al. (1990)，J. Mol. Biol. 215 :403-10 和 Altschul et al. (1997)，Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402,在此引入其全文作為參考。也可以用Biology workBench網(wǎng)站提供的FASTA排列工具搜索短序列的同源序列。表1-用于檢測體細(xì)胞雜交株的引物
名稱引物序列SEQ ID NO:D2S396LATA CAC CTC TAA ATA TCT GTT CCA G7D2S396RAAG TAG GAC CAT TCT AAT AGC C8D2S112LGAG TGG CGG TGA GAA GGT AT9D2S112RAGC CAT TGC TAT CTT TGA GG10D2S2243LTGG GAT ATG CTT CAG GGA C11D2S2243RAGC TGA CCT TGG AAT CTG GTT12D13S260LAGA TAT TGT CTC CGT TCC ATG A13D13S260RCCC AGA TAT AAGl GAC CTG GCT A14D13S263LCCT GGC CTG TTA GTT TTT ATT GTT A15D13S263RCCC AGT CTT GGG TAT GTT TTT A16D13S165LGTT TCG CCAAGC CTG TT17D13S165RGTT GAC AAT AAA ATA CGC CAC A18D13S273LCTG NGG CAAAAA CAA CTC TT19D13S273RATC TGT ATG TCC TCC TTT CAA TG20D13S1168LAAC CTC ATT TAA ATG TAA AGC ATC A21D13S1168RGTA ATG TCA TTG CTT TTG ATT TGC22D13S1150LCTC TTG AGG GAA AAA AAA AAT CA23D13S1150RCCA GGC AAC CAA CCA GTC24D13S272LATA CAG ACT TCC CAG TGG CT25
D13S272RAGC TAT TAAAGT TCC CTG GAT AAA T26GCT16C05LAAG GAA TCA GAG AAA TGG GG27GCT16C05RGCT GAG TCA GAG GGA TTT GA28D13S25FORAGA GGT AAA CAA ACC AAA CCC29D13S25REVGCT GAC AAT CAA GAG AAG ATG30D13S284LAAA ATC AGG TGG AAA CAG AAT31D13S284RAAA GGC TAA CAT CGA AGG GA32OlALU 18CAG AAC CAG AGA AAC AGC3302ALU18ATG GCA CAA CAG CTT AAC34AFMA301WB5GAA TGC AGG TGT ACC TAT CAA C35AFMA301WB5ACT GAG TGA CTG CTA CCC AG36D13S272L1AGC TAG CCC TAT CAG GGT37D13S272R1GTAAGT GGA GGT TAC CTG385279FGAA TCA TTC GTG CTA AGT GGA T395451RTGC CAA CTG CTT GAA GAA TCT C407130FACA CCT AAC TCC TGG GTT GTT C417371RACT AAA TGC CAG CGT TTG CAT G429530FGGT CTT ACT CTG GTT AAA TCT439757RCAT TGG TAG CTA AGG AAA CAC4411521FCCA TTC AAG CCT GGA CAA TCT T4511802RGAA ACT TGA GAC AAT AAG GAG C4612440FCAT GTA ACC AAG ATA AAT CCG T4712558RCTG GAA AAT GTA TGT GAT GAG G4817261FCTG TTG CTA TCT GTA ATA ACA C4917494R
CTT GGA ATT TTC CAC TGA ATC5018701RTCA TCA GAA GAA ATC AAG GCA G 51
18560FCAG TGT TAG GAA TAC GCA TTC A 52
GSP2F4CCT TGC CAG TAC GCC CAC AAG CTG 53
GSPlRlCCC CAC CTA TGG TTG TAG TGA GCA 54
TCCt施例I-CLL患者的體細(xì)胞奪株中的一段30kb的缺失Kfet至今還沒有確定CLL患者13ql4處丟失的最小區(qū)域。已經(jīng)描述了 CLL中13ql4 處缺失的多種以及相對(duì)較大的(在130到5501Λ)區(qū)域(參見圖2B)。用LOH和Southern blot分析鑒別Alul8位點(diǎn)純合子丟失的著絲粒邊界，該位點(diǎn)位于D13S1150和D13S272之間小于651Λ著絲粒到LEU2基因的外顯子5處。但是，沒有發(fā)現(xiàn)能使靶腫瘤抑制子定位的小的或重疊的純合子缺失。為了更好的定義CLL中的丟失區(qū)域，制備鼠LM-TK-的體細(xì)胞雜交株和帶有13ql4 移位和/或缺失的CLL細(xì)胞。對(duì)得到的雜交克隆的PCR檢測可以分開腫瘤中存在的染色體 13的兩個(gè)拷貝。用這種方法可以識(shí)別一種細(xì)胞中的31. 4kb的缺失，以及另一種細(xì)胞中染色體斷點(diǎn)的精確定位(圖2D)。這些結(jié)果表明13ql4腫瘤抑制基因位于LEU2基因的外顯子2 和5之間的^lcb的區(qū)域中。用于檢測體細(xì)胞雜交株的引物如表1所示。如圖2所示，體細(xì)胞雜交株中缺失的區(qū)域與所有已報(bào)道的丟失區(qū)域相同，包括幾年前由 Liu et al. (1997)Oncogene 15 :2463-2473 報(bào)道的 IOkb 的區(qū)域。LEU2 的外顯子 1 和2也在此區(qū)域內(nèi)，并且也在本文所定義的區(qū)域內(nèi)。但是LEU2并不是B-CLL的可能的候選腫瘤抑制子基因(參見 Bullrich et al. (2001), Cancer Res. 61 :6640-6648 ；Migliazza et al. (2001) ,Blood 97 :2098-2104 ；Wolf et al. (2001), Hum. Mol. Genet. 10:1275-1285; 和 Mertens et al. (2002)Blood 99 :4116-4121)實(shí)施例2-miR15和miR16基因位于染餼體13的最小缺失區(qū)域內(nèi)，并且在⑶5+細(xì)胞中高表達(dá)在已公開可用的序列信息和數(shù)據(jù)庫中篩選13ql4處的最小丟失區(qū)域中的新的調(diào)控基因。最近被克隆的兩個(gè)miRNA基因簇，miR15和miR16正是位于該缺失區(qū)域內(nèi)(圖2A)。 為了評(píng)價(jià)miR15和miR16在正常組織中的表達(dá)水平，對(duì)一組正常組織，包括分離自正常個(gè)體的扁桃腺的CD5+B細(xì)胞進(jìn)行miR15和miR16 RNA的Northern blot分析(圖3A)。用CD5+B 細(xì)胞做對(duì)照，這是因?yàn)锽-CLL具有逐漸積累⑶5+B淋巴細(xì)胞的特性。發(fā)現(xiàn)普遍存在miR15 和miR16基因的表達(dá)，并且在正常⑶5+淋巴細(xì)胞中表達(dá)量最高。此外，在正常組織中miR16 始終比miR15表達(dá)水平高。這些數(shù)據(jù)表明miR15和miR16基因在正常⑶5+B細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡中具有重要作用。實(shí)施例3-在13ql4缺失的CLL樣品中miR15和miR16基因常常缺失或受到負(fù)調(diào)控為了研究miR15和miR16基因是否與CLL的發(fā)病有關(guān)，用Northern blotting分析了 60個(gè)CLL樣品和30個(gè)人癌細(xì)胞系的miR15和miR16基因表達(dá)(圖3A)。CLL患者中的68% (41/60)，以及分析的6個(gè)前列腺癌細(xì)胞系中的5個(gè)與其正常組織對(duì)應(yīng)物相比顯示出表達(dá)顯著減少。這些發(fā)明證明miR15和miR16基因在所檢測的大部分B-CLL和前列腺癌細(xì)胞中受到負(fù)調(diào)控。此外，60個(gè)CLL樣品中的23個(gè)(38% )顯示出明顯可識(shí)別的代表miR15前體RNA 的大約70nt的條帶。而除了骨髓之外的任何所分析的正常組織中都沒有發(fā)現(xiàn)70nt的miR15 條帶(圖3A)，這表明CLL細(xì)胞對(duì)miR15前體RNA的處理效率較低。為了確定所觀察到的表達(dá)的負(fù)調(diào)控是否與CLL的等位基因缺失有關(guān)，用微衛(wèi)星標(biāo)記D13S272和D13S273對(duì)46個(gè)CLL患者進(jìn)行了 LOH研究，從這些患者可以獲得正常DNA (圖 3B)。我們發(fā)現(xiàn)有義樣品的68%都在至少一個(gè)標(biāo)記中表現(xiàn)出LOH(35個(gè)中的對(duì)個(gè))。在除了 4個(gè)樣品以外的所有樣品(75%)中miR15/16基因產(chǎn)物的表達(dá)都有所減少。有12個(gè)樣品由于起始物質(zhì)的問題不能得到可重復(fù)的結(jié)果。此外，在沒有明顯LOH的11個(gè)樣品中的6 個(gè)(55%)中表達(dá)水平也有所減少。在這些實(shí)驗(yàn)中，可能由于缺失片段太小而不能被所用的標(biāo)記檢測到。Northern blot分析表明在在13ql4處具有已知的較大純合子缺失的細(xì)胞和少于 5%的正常細(xì)胞中都表達(dá)miR15和miR16基因產(chǎn)物，表明在基因組中存在其它高度類似的小分子RNA基因。實(shí)際上，已有報(bào)道有一個(gè)與miR15/miR16基因簇非常類似的基因簇位于染色體 3q25-26. 1 處(參見 Lagos-Quintana et al. (2002)，Curr. Biol. 12 :735-739)。為了表明miR15/16基因表達(dá)的變化確實(shí)與染色體13q的缺失有關(guān)，設(shè)計(jì)了對(duì)染色體13上的 miR16前體RNA特異的和對(duì)染色體3上的基因產(chǎn)生的miRNA前體RNA特異的探針，用于進(jìn)行 Northern blot。染色體13的miR16前體RNA只檢測到很低的水平，在相同樣品中用染色體3探針卻沒有發(fā)生特異性的雜交。此外，用兩個(gè)跨越位于該基因簇著絲粒的2Mb區(qū)域的微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行LOH研究。17個(gè)有義樣品中的4個(gè)在至少一個(gè)標(biāo)記中顯示出了 L0H，并且沒有發(fā)現(xiàn)其與miR15/16的表達(dá)水平之間的關(guān)系。這些數(shù)據(jù)明顯證明CLL中miR15和miR16基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控與13ql4處的等位基因丟失相關(guān)，表明miR15和miR16基因產(chǎn)物在CLL的發(fā)病中具有重要作用。實(shí)施例4-在小鼠中miR15和miR16也與CLL發(fā)病有關(guān)為了進(jìn)一步研究miR15和miR16基因是否與CLL發(fā)病有關(guān)，繼續(xù)用患有CLL的 E-TCLl 轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行研究(Bichi et al.，(2002)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 :10 6955-6960)。檢測E-TCLl轉(zhuǎn)基因小鼠中細(xì)胞和基因的變化。如上所述進(jìn)行Northern blot 分析(參見實(shí)施例-"Northern blotting”，和實(shí)施例3)。在大約80 %的轉(zhuǎn)基因小鼠中，與正常鼠脾淋巴細(xì)胞相比，CLL細(xì)胞中miRl5和 miR16的鼠同系物都有所降低。這些結(jié)果與實(shí)施例3中所述的人CLL與正常人細(xì)胞相比較
的結(jié)果一致。還將小鼠染色體15和人染色體12進(jìn)行了比較。轉(zhuǎn)基因小鼠的白血病的比較基因雜交(CGH)顯示出大約35%擴(kuò)增出了小鼠染色體15的一個(gè)區(qū)域，相應(yīng)于人染色體12的區(qū)域。這些小鼠白血病的細(xì)胞分析也表明小鼠染色體15具有三倍體性或四倍體性。已知大約有25%的人CLL的染色體12具有三倍體性。比較基因雜交還顯示了小鼠染色體14(51. 6-78. 5Mb)具有丟失的區(qū)域，相應(yīng)于人的13ql4區(qū)域。
這些研究結(jié)果表明CLL小鼠模型重現(xiàn)了人CLL發(fā)病中發(fā)生的事件。綜合來說，實(shí)施例1-4的數(shù)據(jù)表明在哺乳動(dòng)物中miR15和miR16在CLL發(fā)病中具有重要作用。 _7] t施例5-突奪分析沒有、兒示出在CLL和胃腸癌中miR15和miR16某因Jl有點(diǎn)突變?yōu)榱诉M(jìn)一步評(píng)價(jià)miR15和miR16基因在CLL中的作用，用對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序的方法檢測了 120個(gè)B-CLL以及80個(gè)結(jié)腸直腸癌和胃癌中是否具有突變。擴(kuò)增了含有全部基因簇的720bp的染色體區(qū)域。在這三種情況下，發(fā)現(xiàn)miR16前體RNA具有同樣的變化；在位點(diǎn)2具有T到C的置換。這種變化不會(huì)改變miRNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。還發(fā)現(xiàn)了幾種非遺傳性的多肽性。由于miR16基因較小(70bp)，miR16基因僅具有極少的突變并不令人驚訝。為了識(shí)別在顯示出LOH的CLL中其余的等位基因失活的可能機(jī)制，用“in silico”克隆鑒別位于miR16基因下游大約2Mbp的可能的啟動(dòng)子區(qū)域。已報(bào)道有幾種癌相關(guān)基因具有啟動(dòng)子高度甲基化反應(yīng)的負(fù)調(diào)控，包括pl6INK4a，p73，hMLHl，或VHL(參見 Esteller (2002)，Oncogene 21 =5427-5440)。因此使用甲基化特異的PCR分析位于可能的 miR16啟動(dòng)子的5’的一個(gè)富含CpG區(qū)域的甲基化狀態(tài)。在十個(gè)CLL樣品中，與miR15或 miR16基因表達(dá)的水平(八個(gè)表達(dá)減少，兩個(gè)具有高表達(dá))無關(guān)，在任何所分析的CpG位點(diǎn)都沒有檢測到甲基化模式的差別。但是，也不能排除甲基化特異的PCR沒有檢測到CpG位點(diǎn)的不同區(qū)域或較小區(qū)域的甲基化。實(shí)施例6_miR15和miR16基因產(chǎn)物在人細(xì)胞中的表汰將編碼全長70個(gè)核苷酸的miR15和miR16 RNA前體的cDNA序列分別克隆到無關(guān)的mRNA中，該mRNA處于巨細(xì)胞立即早期(CMV-IE)啟動(dòng)子的控制之下，根據(jù)kng et al. (2002), Mol. Cell 9 :1327-1333中所述的方法操作，在此引入其全文作為參考。簡短來說，將Bio I連接子置于編碼miR15和miR16 RNA前體的雙鏈cDNA序列的末端，并將這些構(gòu)建體分別克隆到PBC12/CMV質(zhì)粒的Β ο I位點(diǎn)。pBC12/CMV質(zhì)粒如Cullen， (1986), Cell 46 :973-982所述，在此引入其全文作為參考。含有miR15前體RNA序列的所述質(zhì)粒稱為pCMV-miR15，含有miR16前體RNA序列的所述質(zhì)粒稱為pCMV_miR16。用FuGene 6試劑(Roche)用標(biāo)準(zhǔn)方法將pCMV_miR15和pCMV_miR16分別轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的人細(xì)胞。如上所述提取總RNA，用miR15和miR16特異的探針用Northern blot 分析檢測是否存在處理過的miR15或miR16 RNA。再使pCMV-miR15和pCMV_miR16分別轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的人前列腺癌細(xì)胞系2220,2221， 11609，11611，LNCAP, TSUR0如上所述提取總RNA，用miR15和miR16特異的探針用Northern blot分析檢測前列腺癌細(xì)胞中是否存在處理過的miR15或miR16 RNA。同時(shí)評(píng)估轉(zhuǎn)染的前列腺癌細(xì)胞在形態(tài)上的變化，克服接觸抑制的能力，以及能指示轉(zhuǎn)化表型的其它標(biāo)記。實(shí)施例7-用miR15和miR16基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)染CLL細(xì)胞從診斷患有CLL的患者中分離CLL細(xì)胞，如下所述用編碼miR15和miR16小分子 RNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。如上所述分離CD5+B細(xì)胞，用目測觀察或者通過用Matutes et al. (1994), Leukemia 8(10) :1640-1645的評(píng)分系統(tǒng)測定CLL分?jǐn)?shù)來鑒別CLL細(xì)胞，在此引入其全文作為參考。CLL分?jǐn)?shù)至少為4的⑶5+B細(xì)胞視為是CLL細(xì)胞。證實(shí)了在分離的CLL細(xì)胞中具有13ql4區(qū)域的缺失，從而除去了 miR15/miR16基因簇。通過標(biāo)準(zhǔn)方法用pCMV-miR15和pCMV_miR16轉(zhuǎn)染分離的CLL細(xì)胞。如上所述提取總RNA，用miR15和miR16特異的探針用Northern blot分析檢測是否存在處理過的miR15 或miR16 RNA。用miR15和miR16基因序列特異的探針進(jìn)行Southern blot雜交也證實(shí)了 miR15和miR16基因的穩(wěn)定整合。實(shí)施例8-用miR15和miR16基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)染造血干細(xì)胞如下所述從診斷為CLL的患者的骨髓中獲得造血干細(xì)胞(HSC)。在手術(shù)室用標(biāo)準(zhǔn)方法在常規(guī)麻醉狀態(tài)下在從患者的髂骨中收集骨髓。用肝素化注射器進(jìn)行多次抽吸，得到總量為大約750到IOOOml的骨髓。將抽出的骨髓立刻轉(zhuǎn)移到運(yùn)送介質(zhì)(TC-199, Gibco, Grand Island, New York)中，每 100ml 該介質(zhì)含有 10，000 單位的不含防腐劑的肝素。將抽出的骨髓通過三次逐漸精細(xì)的分篩過濾得到不含細(xì)胞聚集物，細(xì)胞碎片和骨骼顆粒的細(xì)胞懸液。然后將過濾得到的骨髓進(jìn)一步用自動(dòng)細(xì)胞分離器(例如Cobe 2991 Cell Processor)得到“血沉棕黃層”(即不含紅細(xì)胞和血小板的白細(xì)胞)。如下所述用免疫磁珠(Dynal A. S.，Oslo, Norway)進(jìn)行CD34+細(xì)胞的正選擇使血沉棕黃層制備物部分富集造血干細(xì)胞(HSC)。將血沉棕黃層制備物重懸于加入添加物的介質(zhì)中，并與小鼠抗HPCA-I抗體以1 20的稀釋比率共培育，在4°C輕輕顛倒試管45分鐘。 用加入添加物的介質(zhì)洗滌細(xì)胞三次，然后與包覆有羊抗鼠IgG1 (75 1免疫珠/107CD34+細(xì)胞)的Fc片段的微珠共培育。在4°C培育45分鐘以后，用磁性微粒集中器對(duì)粘附在微珠上的細(xì)胞進(jìn)行正選擇，根據(jù)制造商的說明書操作。將富集HSC的制備物中的2xl04個(gè)細(xì)胞在5ml聚丙烯管(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)中的含有2 %人AB血清和IOmM Hepes緩沖液的總體積為0. 4ml的 Iscove ‘ s修改的Dulbecco ‘ s培養(yǎng)基(IMDM)中培育，并用標(biāo)準(zhǔn)方法用pCMV_miR15和 pCMV-miR16轉(zhuǎn)染。用一部分轉(zhuǎn)染的HSC通過Northern blot分析證實(shí)其中表達(dá)miR15或 miR16 RNA，用一部分HSC通過Southern blot分析證實(shí)其中穩(wěn)定整合了 miR15或miR16基因序列。將其余的轉(zhuǎn)染細(xì)胞以大約^io7kg體重到大約8x107kg體重的比率用標(biāo)準(zhǔn)骨髓移植方法重新植入到患者體內(nèi)。重復(fù)該實(shí)驗(yàn)，除了用在轉(zhuǎn)染和重新移植之前用電離輻射除去骨髓中的贅生物細(xì)胞，如下所述。調(diào)整血沉棕黃層制備物中的細(xì)胞至細(xì)胞濃度為在含有大約20%的自體血漿的TC-199中是hl07ml。向細(xì)胞懸液中加入重組人造血生長因子rH IL-3或rH GM-CSF以刺激造血贅生物的生長，從而增加其對(duì)電離輻射的敏感性。然后將這些細(xì)胞暴露于5-10Gy 的電離輻射中，在4°C用含有大約20%的自體血漿的TC-199洗滌一次，然后如上所述用 pCMV-miR15 和 pCMV_miR16 轉(zhuǎn)染。實(shí)施例9-含有miR15或miR16的脂質(zhì)體的制備脂質(zhì)體的制備1-由乳酰腦苷酯，磷脂酰甘油，卵磷脂和膽固醇以摩爾比率 1:1:4: 5組成的脂質(zhì)體通過美國專利序列號(hào)4，235，871中所述的反相蒸發(fā)方法制備，在此引入其全文作為參考。在100g/ml的處理的miR15或miR16 RNA或500g/ml的 pCMV-miR15或pCMV-miR16水溶液中制備脂質(zhì)體，因此制備得到的脂質(zhì)體含處理的miR15或 miR16 RNA,或 pCMV_miR15 或 pCMV_miR16 質(zhì)粒。然后將脂質(zhì)體通過0. 4聚碳酸酯膜，重懸于鹽水中，用135mM氯化鈉，IOmM磷酸鈉PH 7. 4通過柱層析與未包覆的物質(zhì)分離開來。所述脂質(zhì)體無需修飾即可進(jìn)一步使用，或者如下所述進(jìn)行修飾。將一些如上所述制備的脂質(zhì)體加入到適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)容器中，并邊攪拌邊加入含有 20mM偏高碘酸鈉，135mM氯化鈉和IOmM磷酸鈉(pH 7.4)的溶液。將得到的混合物在黑暗中在溫度為大約20°C的條件下放置90分鐘。將反應(yīng)混合物用250ml鹽水緩沖液(135mM氯化鈉，IOmM磷酸鈉，pH 7.4)透析2小時(shí)除去過量的高碘酸鹽。得到的產(chǎn)品是表面碳水化合物的羥基被氧化成乙醛基的脂質(zhì)體。目標(biāo)基團(tuán)或調(diào)理作用抑制分子可以通過這些乙醛基團(tuán)與脂質(zhì)體表面結(jié)合。脂質(zhì)體的制備2-如下所述制備由馬來酰亞胺苯甲酰-磷脂酰乙醇胺(MBPE)，卵磷脂和膽固醇組成的第二種脂質(zhì)體。MBPE是能使含有巰基的化合物，包括蛋白質(zhì)與脂質(zhì)體偶合的活性磷脂。將十四酰磷脂酰乙醇胺(DMPE) (IOOmmol)溶解于含有2當(dāng)量的三乙胺和50mg m-馬來酰亞胺苯甲酰N-羥基琥珀酰亞胺酯的5ml無水甲醇中，如Kitagawa et al. (1976)， J. Biochem. 79 :233-236中所述，在此引入其全文作為參考。在氮?dú)鈿夥障略谑覝乩^續(xù)反應(yīng)過夜，然后用氯仿/甲醇/水(65/25/4)在硅膠H上進(jìn)行薄層層析，這可以定量顯示出DMPE 向更快的遷移產(chǎn)物的轉(zhuǎn)變。減壓除去甲醇，將產(chǎn)物重新溶于氯仿中。用氯化鈉提取氯仿相兩次，用氯仿/甲醇a/i)作為溶劑用硅酸層析純化馬來酰亞胺苯甲酰-磷脂酰乙醇胺 (MBPE)。純化以后，薄層層析指示出含有茚三酮陰性斑點(diǎn)的純磷酸鹽。在100g/ml 處理的 miR15 或 miR16 RNA 水溶液或 500g/ml pCMV_miR15 或 pCMV-miR16溶液中，用上述美國專利序列號(hào)4，235，871中的反相蒸發(fā)方法制備由MBPEjP 磷脂和膽固醇以摩爾比為1 9 8組成的脂質(zhì)體。用IOOmM氯化鈉-2mM磷酸鈉(pH 6.0) 通過柱層析使脂質(zhì)體與未包覆的物質(zhì)分離開來。實(shí)施例10-使抗CD5+或抗前列腺腫瘤抗體與含有miR15或miR16的脂質(zhì)體結(jié)合將1. Iml (含有大約IOmrnol)的帶有活性乙醛基團(tuán)的脂質(zhì)體制備物1，或上述脂質(zhì)體制備物2裝入適當(dāng)?shù)娜萜髦?。向該制備物中邊攪拌邊加?. 2ml的200mM氰硼氫鈉溶液和1. Oml的3mg/ml的直接針對(duì)CD5+細(xì)胞表面標(biāo)記或前列腺腫瘤細(xì)胞抗原的單克隆抗體溶液。在室溫繼續(xù)反應(yīng)過夜。將得到的混合物在Biogel A5M瓊脂糖柱(Biorad，Richmond, Ca. ；1. 5X37cm)上分離。實(shí)施例11-在體內(nèi)用miR15或miR16基因產(chǎn)物抑制人前列腺腫瘤給裸鼠接種激素抗性人前列腺腺癌細(xì)胞系(PC-3)，將小鼠分為處理組和對(duì)照組。 當(dāng)小鼠中的腫瘤達(dá)到100到250立方毫米的時(shí)候，將包裹在脂質(zhì)體中的處理過的miR15和 miR16直接注射到處理組的腫瘤中。對(duì)照組的腫瘤中只注射包裹有載體溶液的脂質(zhì)體。研究過程中一直測量腫瘤體積。還評(píng)價(jià)了 miR15和miR16基因產(chǎn)物在Dunning R-3327鼠前列腺腺癌模型中抑制前列腺腫瘤生長的功效，如下所述。將Dunning R-3327前列腺腺癌細(xì)胞的高度轉(zhuǎn)移性的和惡性克隆(RT-3. 1)接種到Copenhagen鼠中，然后將其分為處理組和對(duì)照組。大約一周后兩組都形成實(shí)體腫瘤塊。然后向處理組的腫瘤中注射包裹在脂質(zhì)體中的處理過的miR15和miR16，兩周一次，一共注射5周。對(duì)照組的腫瘤只注射含有載體溶液的脂質(zhì)體。研究過程中一直測量腫瘤體積。所有本文所涉及的參考文獻(xiàn)在此都引入作為參考。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)容易理解，本發(fā)明非常適于實(shí)施并達(dá)到本文所提及的以及其所固有的發(fā)明目的和優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明還可以以其它特定方式實(shí)施而不背離其精神和基本屬性，相應(yīng)地可作為下述權(quán)利要求而不是上述說明書的參考，表征本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.用于檢測miR15或miR16基因產(chǎn)物的試劑在制備一種診斷藥物中的應(yīng)用，所述診斷藥物用于診斷慢性淋巴性白血病(CLL)和前列腺癌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，所述試劑是一種核酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中，所述核酸是DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中，所述核酸是RNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中，所述核酸包括SEQID NO :5或者SEQ ID NO 6.
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，所述試劑是被標(biāo)記的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，miR15或者miR16基因產(chǎn)物選自由具有SEQID NO =USEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示序列的基因產(chǎn)物所組成的組中。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，所述診斷藥物在一種實(shí)驗(yàn)中被使用，所述實(shí)驗(yàn)選自由northern blot分析、原位雜交和定量反轉(zhuǎn)錄聚合物酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所組成的組中。
9.用于檢測miR15或miR16基因產(chǎn)物或其突變體的試劑在制備一種診斷藥物中的應(yīng)用，所述診斷藥物用于診斷慢性淋巴性白血病(CLL)和前列腺癌。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中，所述試劑是一種核酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其中，所述核酸是DNA。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其中，所述核酸是RNA。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中，所述試劑是被標(biāo)記的。
14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中，miR15或者miR16基因產(chǎn)物選自由具有SEQID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示序列的基因產(chǎn)物所組成的組中。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，所述診斷藥物在一種實(shí)驗(yàn)中被使用，所述實(shí)驗(yàn)選自由northern blot分析、原位雜交和定量反轉(zhuǎn)錄聚合物酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所組成的組中。
16.用于檢測miR15或miR16基因拷貝數(shù)或其突變體的試劑在制備一種診斷藥物中的應(yīng)用，所述診斷藥物用于診斷慢性淋巴性白血病(CLL)和前列腺癌。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的應(yīng)用，其中，所述試劑用于分析13ql4處的D13S273或 D13S272微衛(wèi)星標(biāo)記的雜合丟失。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其中，所述試劑用于分析D13S1150或D13S273微衛(wèi)星標(biāo)記的雜合丟失。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的應(yīng)用，其中，所述試劑用于分析位點(diǎn)AlulS或D13S273微衛(wèi)星標(biāo)記的雜合丟失。
20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的應(yīng)用，其中，所述試劑是一種核酸。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的應(yīng)用，其中，所述核酸是DNA。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的應(yīng)用，其中，所述核酸是RNA。
23.根據(jù)權(quán)利要求16所述的應(yīng)用，其中，所述試劑是被標(biāo)記的。
24.根據(jù)權(quán)利要求16所述的應(yīng)用，其中所述診斷試劑用于Southernblot雜交。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于癌癥診斷和治療的組合物和方法。miR15和miR16小分子RNA基因位于13q14，在特定癌細(xì)胞，例如慢性淋巴性白血病或前列腺癌的丟失的30kb區(qū)域內(nèi)。慢性淋巴性白血病或前列腺癌可以通過檢測miR15或miR16基因拷貝數(shù)目的減少，確定miR15或miR16基因突變的情況，或者通過檢測由這些基因轉(zhuǎn)錄的RNA的減少來診斷。當(dāng)對(duì)患有這些疾病的患者給藥的時(shí)候，miR15或miR16基因產(chǎn)物能抑制癌癥例如慢性淋巴性白血病或前列腺癌細(xì)胞的贅生物生長或腫瘤生長。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102304570SQ201110214039
公開日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2003年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月13日
發(fā)明者喬治·A·卡林, 卡洛·M·克羅西 申請(qǐng)人:托馬斯杰斐遜大學(xué)