專利名稱：不對稱病毒納米顆粒的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在分子水平上用一種可控的方法操縱生物大分子的自組裝，尤其涉及一種不對稱病毒納米顆粒(asymmetric VNPs)的制備方法，屬于納米生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
納米技術(shù)，是指在0. 1 100納米的尺度里，研究電子、原子和分子運動規(guī)律和特性以及對物質(zhì)和材料進行處理的技術(shù)被稱為納米技術(shù)。1981年科學(xué)家發(fā)明研究納米的重要工具一掃描隧道顯微鏡，原子、分子世界從此可見。1990年首屆國際納米科技會議在美國巴爾的摩舉辦，納米技術(shù)形式誕生。納米顆粒因其獨特的光、電、磁和力學(xué)等性質(zhì)，又因其具有尺寸小、比表面積大、表面能高、表面原子比例大等特點，在生物傳感、材料科學(xué)、能源和信息技術(shù)等領(lǐng)域得到了廣泛關(guān)注，是研究得最早和最為成熟的納米材料，可用于發(fā)展具有特殊性質(zhì)和功能的納米器件。然而，由于表面化學(xué)各向同性，納米顆粒作為構(gòu)筑基元缺乏多樣性和穩(wěn)定性，因此在功能和應(yīng)用上受到一定限制。故發(fā)展納米材料和器件的關(guān)鍵問題之一轉(zhuǎn)變成控制納米構(gòu)筑單元的組裝。近年來發(fā)展了一系列針對納米顆粒的不對稱修飾方法，為組裝納米顆粒的可控性提供了一些新穎而有效的策略。這些方法可以將本身各向同性的納米顆粒修飾成各向異性，使得常見的功能性納米顆粒成為所需的構(gòu)筑單元。近年來，基于各向異性的組裝由于其優(yōu)異的可控性而受到廣泛關(guān)注。對于形貌不對稱的納米材料，以及有性質(zhì)顯著不同的晶面的納米晶，它們很容易依靠本身的各向異性進行修飾與組裝。很多計算模擬結(jié)果表明， 對納米顆粒進行不對稱修飾可以使其由各向同性變?yōu)楦飨虍愋?，進而能夠進行更復(fù)雜、可控和定向的組裝。但正是因為納米顆粒本身形貌和表面性質(zhì)具有球?qū)ΨQ性，一般的方法只能形成均勻的修飾層。最近幾年，陸續(xù)報道了一系列有效的對納米顆粒不對稱修飾的方法，使得此瓶頸得以突破，同時也為可控組裝提供了更好的策略和發(fā)展空間。蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子是天然的納米材料，它們結(jié)構(gòu)多樣，可以自我復(fù)制，高度均質(zhì)，易于人為操縱和大量制備。DNA在納米技術(shù)發(fā)展中已表現(xiàn)出了獨特優(yōu)勢；與DNA相比， 蛋白質(zhì)攜帶的結(jié)構(gòu)信息更加豐富，因而有望為納米技術(shù)提供更靈活的操作平臺。其中，蛋白籠形結(jié)構(gòu)，像病毒衣殼，鐵蛋白，熱擊蛋白，已經(jīng)被廣泛用于研究大分子自組裝的模型，以及材料合成的納米反應(yīng)器。但是，在分子水平上用一種可控的方法操縱他們的自組裝，以及準確分析他們的組裝產(chǎn)物，仍然是具有挑戰(zhàn)性的工作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種不對稱病毒納米顆粒的制備方法，其可在分子水平上實現(xiàn)生物大分子的可控自組裝，從而克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案 一種不對稱病毒納米顆粒的制備方法，其特征在于，該方法為對病毒衣殼蛋白表面進行基因改造，使病毒衣殼蛋白同時帶有耦合的功能基團和分離基團，然后將該改造后的病毒衣殼蛋白與野生型病毒衣殼蛋白充分混合，并控制該兩種病毒衣殼蛋白的比例，同時根據(jù)病毒衣殼蛋白的總量加入相應(yīng)無機納米顆粒，實現(xiàn)病毒樣納米顆粒的可控組裝，獲得不對稱功能化的納米顆粒，即目標產(chǎn)物。進一步的講，所述病毒衣殼蛋白包括SV40衣殼蛋白VP1，所述功能基團包括半胱氨酸，所述分離基團包括His-tag。該方法包括如下步驟
i .在SV40衣殼蛋白的VPl Loop中引入Cys，即，在第74位氨基酸突變?yōu)镃ys，并在第139位插入His-tag，構(gòu)建載體His-mvpl，并在生物體中實現(xiàn)表達，經(jīng)純化，獲得改造后的病毒衣殼蛋白His-mvpl ；
.取改造后的病毒衣殼蛋白His-mvpl與原野生型SV40衣殼蛋白wtvpl充分混合， 通過調(diào)節(jié)該兩種衣殼蛋白的比例，實現(xiàn)對組裝體病毒納米顆粒個體中該兩種衣殼蛋白成分比例的控制，根據(jù)衣殼蛋白總量與納米顆粒物質(zhì)的量比60:廣180:1添加無機納米顆粒，在低鹽溶液中透析完成共組裝；
iii.用金屬螯合親和層析法分離純化組裝產(chǎn)物，除去同種病毒衣殼蛋白自組裝的產(chǎn)物，獲得單一的不對稱病毒納米顆粒。該方法還包括如下步驟
iv .用蔗糖連續(xù)密度梯度法對步驟iii獲得的不對稱病毒納米顆粒進行分離，獲得大小均一的不對稱結(jié)構(gòu)。步驟i具體為
將His-mvpl表達質(zhì)粒用氯化鈣法轉(zhuǎn)入五coli Rosetta (DE3)感受態(tài)細胞，在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)細菌并誘導(dǎo)表達重組蛋白His-mvpl，其后依次經(jīng)離心、破碎和柱層析處理，獲得改造后的病毒衣殼蛋白His-mvpl ；
所述LB培養(yǎng)基中還含有抗生素和誘導(dǎo)劑，所述抗生素包括氨芐青霉素和/或氯霉素， 所述誘導(dǎo)劑包括IPTG。步驟i包括如下步驟
a、將His-mvpl表達質(zhì)粒用氯化鈣法轉(zhuǎn)入五coliRosetta (DE3)感受態(tài)細胞，涂平板至少12 h后，挑取單克隆接入LB培養(yǎng)基中，加入抗生素，于37°C恒溫振蕩培養(yǎng)過夜，其后按照1%接種量轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基中，加入抗生素，于37°C恒溫振蕩培養(yǎng)，并加入誘導(dǎo)劑，在 25°C 37°C繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，離心收集菌體；
b、將收集到的菌體清洗后重懸于bindingbuffer中進行超聲破碎，離心破碎后的菌液，取上清液進行柱層析，獲得改造后的病毒衣殼蛋白His-mvpl。步驟ii具體為將摩爾比l:5(Tl :11的His-mvpl與wtvpl充分混合，并添加無機納米顆粒，無機納米顆粒與總蛋白分子數(shù)的比例控制為60 廣180:1，在低鹽溶液中透析完成共組裝。步驟iii中所獲得的不對稱病毒納米顆粒具有正二十面體結(jié)構(gòu)，其外殼是由1個 His-mVPl五聚體和11個wtvpl五聚體組成，中心是無機納米顆粒。步驟iii具體為
采用鎳親和層析法，首先以15-30 mM咪唑溶液除去不帶有改造后的病毒衣殼蛋白His-mvpl的組裝產(chǎn)物，即無功能基團和分離基團的病毒納米顆粒；然后取20(T1000 mM咪唑溶液洗脫得到組裝產(chǎn)物中只含有一個改造后的病毒衣殼蛋白His-mvpl單元的病毒納米顆粒，即不對稱病毒納米顆粒。病毒納米顆粒(virus-based nanoparticles，VNPs)是由一種或幾種病毒衣殼蛋白構(gòu)成的空心顆粒，通常自組裝產(chǎn)生，不含病毒核酸，不能自主復(fù)制。本發(fā)明通過病毒結(jié)構(gòu)的對稱性或病毒表面基因改造，實現(xiàn)病毒樣納米顆粒的可控組裝，獲得一種不對稱功能化的納米顆粒，從而有可能獲得新的物理或化學(xué)特性，為病毒標記和示蹤等提供新的結(jié)構(gòu)材料。該策略的成功將為制備具有可控組裝性能的納米構(gòu)筑基元提供一條有效的技術(shù)途徑， 從而催生新穎的納米器件，為基本物理學(xué)問題研究和下游應(yīng)用奠定良好的基礎(chǔ)。較之于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有的優(yōu)點在于選用生物大分子-蛋白質(zhì)作為納米材料，其容易改造和人為操縱，且方便大量獲取。通過遺傳工程手段在病毒納米顆粒組裝模塊中同時整合功能基團和分離基團。利用可自組裝的病毒衣殼蛋白結(jié)構(gòu)的對稱性，可以將兩種不同的蛋白分子混合后按預(yù)先設(shè)計進行定向組裝，因此組裝體具有多樣性和可控性； 反應(yīng)條件易控制，并且可以實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。


圖1是本發(fā)明利用SV40主要衣殼蛋白vpl包裝量子點共組裝制得的一種不對稱病毒納米顆粒的透射電子顯微鏡照片；
圖2是圖1所示asymmetric VNPs吸附AuNPs的透射電子顯微鏡圖； 圖3是本發(fā)明陰性對照(wtvpl包裝量子點形成的VNPs)吸附AuNPs的透射電子顯微鏡圖4是本發(fā)明陽性對照(His-mvpl包裝量子點形成的VNPs)吸附AuNPs的透射電子顯微鏡圖。
具體實施例方式本發(fā)明提供的一種不對稱病毒納米顆粒(asymmetric VNPs)的制備方法，利用生物大分子——病毒衣殼蛋白(SV40，CCMV, TMV等病毒的衣殼蛋白)與新型納米材料共組裝的模型，通過對病毒衣殼蛋白表面的基因改造，將功能基團和分離基團在結(jié)構(gòu)上巧妙地耦合，然后將改造過的衣殼蛋白與野生型的蛋白按特定比例充分混合后再組裝，用控制兩種蛋白五聚體比例的方法實現(xiàn)病毒樣納米顆粒的可控組裝，獲得一種不對稱功能化的納米顆粒。又根據(jù)不對稱顆粒上帶有的分離基團，進一步實現(xiàn)目標產(chǎn)物的分離和純化。最后將分離得到不對稱功能化的納米顆粒，并優(yōu)選采用AuNPs對其功能基團進行表征。本發(fā)明制備的產(chǎn)物為不對稱病毒納米顆粒(asymmetric VNPs)。分具體步驟來看
1.將病毒衣殼蛋白進行基因改造，構(gòu)建帶有功能基團和分離基團的衣殼蛋白突變體的載體；
2.將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化到生物體內(nèi)進行表達，純化并鑒定得到病毒衣殼蛋白突變
體；
3.將此突變體與野生型的衣殼蛋白充分混合，然后在無機納米粒子參與下經(jīng)透析組裝；
4.根據(jù)分離基團的特征選擇不同分離方法純化組裝產(chǎn)物；
5.將得到的不對稱功能化的納米顆粒做連續(xù)密度梯度離心，制備出大小均一的不對稱病毒納米顆粒(asymmetric VNPs)；
為使本發(fā)明的不對稱病毒納米顆粒(asymmetric VNPs)的制備方法更易于理解其實質(zhì)性特點及其所具的實用性，下面便結(jié)合實施例1以及圖1-圖4對本發(fā)明技術(shù)方案作進一步的詳細說明，但以下關(guān)于實施例的描述及說明對本發(fā)明保護范圍不構(gòu)成任何限制。實施例1
在SV40主要衣殼蛋白vpl的Loop結(jié)構(gòu)中引入Cys (即第74位氨基酸突變?yōu)镃ys)，在第139位插入His-tag，構(gòu)建成載體PET3^i-His-mvpl (His-mvpl)；經(jīng)測序確定目的基因序列的正確性。將PET3^i-His-mvpl用氯化鈣法轉(zhuǎn)入五coh· Rosetta (DE3)感受態(tài)細胞，涂平板12 h后從平板上挑取單克隆接入5 mL LB試管培養(yǎng)基中，加入氨芐青霉素和氯霉素， 于37°C恒溫，180 r/min培養(yǎng)過夜。按照1%接種量轉(zhuǎn)接于5 ml LB試管培養(yǎng)基中(平行3 管)，加入相應(yīng)的抗生素，于37°C恒溫、180 r/min振蕩培養(yǎng)2. 5 h左右(0D600在0. 4、. 6之間)，其中1管作為空白對照(不加IPTG)，另外兩管均加入誘導(dǎo)劑終濃度為1 mM的IPTG，分別在25°C和37°C繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)10 h和2 h后，離心收集菌體，用SDS-PAGE檢測His-mvpl 的表達情況，發(fā)現(xiàn)兩種溫度下均能表達，同時也有包涵體產(chǎn)生，選擇25°C作為大量制備蛋白時的誘導(dǎo)溫度。將萬.co/iRosetta (DE3) / PET32a-His_mvpl 接種于 5 mL LB 試管培養(yǎng)基中，加入相應(yīng)的抗生素在37°C恒溫、180 r/min培養(yǎng)過夜。第二天將5 mL菌液轉(zhuǎn)接入500 mL LB 三角瓶中，加入氨芐青霉素(終濃度100 ug/mL)和氯霉素(終濃度68 ug/mL)，于37°C恒溫、 180 r/min振蕩培養(yǎng)2. 5 h左右后(0D600在0.壙0. 6之間)，加入誘導(dǎo)劑終濃度為1 mM的 IPTG，在25°C下繼續(xù)振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)10 h，離心收集菌體。將菌體沉淀用binding buffer清洗一次后重懸于一定體積的binding buffer中進行超聲破碎(條件超聲功率400W，工作 3 s，間歇5 s，總超聲破碎時間60 min)，破碎后的菌液以12000 r/min離心30 min，將上清液上樣于經(jīng)binding buffer平衡過的Ni2+-NTA親和層析柱，然后依次用低濃度(20 mM、40 mM、60 mM)的咪唑洗柱除去雜蛋白，最后用elution buffer (500 mM咪唑)洗脫目的蛋白。His-mvpl及wtvpl五聚體的制備
純化后的His-mvpl主要以五聚體形式存在，也有一部分以病毒納米顆粒形式存在，故需要除去His-mvpl中的病毒納米顆粒，制備獲得純的His-mvpl五聚體，這個過程需要兩個步驟
1.在制備獲得的His-mvpl五聚體中加入終濃度為10mM的DTT，然后在解聚緩沖液中透析(體積為10 mL His-mvpl蛋白在4°C 1 L解聚緩沖液中靜置透析10 h，更換一次新鮮解聚緩沖液，繼續(xù)靜置透析10 h)；
2.將透析過的His-mvpl蛋白超速離心除去殘存的病毒納米顆粒，超速離心條件是 4°C, 55000 rpm (貝克曼Type 90Ti轉(zhuǎn)子)離心1 h，取上清即為His-mvpl五聚體。His-mvpl五聚體的濃度通過試劑盒Bradford Protein Assay (考馬斯亮藍染色法)測定，步驟按照試劑盒說明書進行。同時結(jié)合SDS-PAGE驗證。原野生型SV40衣殼蛋白wtvpl五聚體的制備步驟與His-mvpl五聚體的制備方法相同。His-mvpl與wtvpl混合并在量子點參與、低鹽條件下共組裝。具體步驟是
1.將濃度為680 ug/mL 的 wtvpl 17mg(25 mL)與濃度為 330 ug/mL 的His-mvpl 1.551 mg (4. 7 mL)五聚體混合，4°C慢速振蕩5 h ；
2.稀釋總蛋白液至終濃度為200ug/mL，加入濃度為3. 24 uM的量子點CdSe 1.67 mL, 此時總體積是90. 77 mL，混勻后，在組裝緩沖液中透析共組裝(透析20 h，10 h更新一次新的透析液)；
3.得到的包裝產(chǎn)物含有SV40病毒納米顆粒-量子點(純wt-vpl五聚體組裝成的 VNPs，兩種五聚體混合組裝的VNPsji His-mvpl組裝成的VNPs等)，量子點，衣殼蛋白五聚體，空的病毒納米顆粒和不規(guī)則聚集物的混合物。要分離出不對稱病毒納米顆粒，需要如下具體步驟
i ·加入5Xbinding buffer 22.5 mL，此時總體積為113. 27 mL，將組裝液上樣于經(jīng)binding buffer平衡過的Ni2+___NTA親和層析柱，只有帶有突變體衣殼蛋白的病毒納米顆粒能吸附到層析柱上，用15 30 mM咪唑除去非特異吸附在柱上的病毒納米顆粒，然后用 200^1000 mM的咪唑洗脫得到不對稱病毒納米顆粒。該過程的原理是his- tag層析凝膠的基質(zhì)上連接了一個NTA ([=Iiitrilotriacetic acid]氮基三乙酸)，可以與Ni離子結(jié)合， 而Ni離子與融合蛋白的6)(hiS氨基酸之間產(chǎn)生較強的螯合作用，從而將帶有his-tag組氨酸標簽的蛋白與其它蛋白區(qū)分開來。因此當用高濃度的咪唑溶液洗脫的時侯(如300 mM), 咪唑便與蛋白質(zhì)his-tag的咪唑環(huán)競爭結(jié)合，最終將融合蛋白從凝膠上洗脫下來。ii .濃縮20(Tl000 mM咪唑洗脫得到的VNPs，通過蔗糖密度梯度離心將大小均一的病毒納米顆粒分離出來。蔗糖密度梯度的制備步驟
a)先配制包裝緩沖液(10 mM Tris-HCl, pH 7.2，250 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 5% Glycerol)和50wt%蔗糖溶液(用包裝緩沖液配制)，然后以這兩者為母液配成質(zhì)量/質(zhì)量比為 10%、15%、20%、25%、30%、；35%、40%、45% 的蔗糖溶液。b)將透明的超速離心管最上方預(yù)留好樣品體積后，剩下的長度分成等體積的9 份，用記號筆劃線標記；
c )將超速離心管固定在合適的離心管架上，用吸管按從高濃度到低濃度的順序?qū)⒏魈荻鹊恼崽侨芤嘿N壁緩慢加入到離心管內(nèi)，吸管口要與蔗糖液面恰好接觸以避免擾動； d)梯度制備好后，靜置于4°C冰箱過夜，使之形成連續(xù)梯度。0超速離心將濃縮得到的產(chǎn)物緩慢加入到超速離心管上方預(yù)留的位置中，每管最多2 mL，在超速離心機中4°C 38000 rpm離心(貝克曼SW40Ti轉(zhuǎn)子)4. 5小時，然后在紫外燈照射輔助下，照相拍下超速離心后樣品在連續(xù)梯度中的位置和情況，可以看到不對稱病毒納米顆粒在離心管中形成了獨立的熒光帶，將其取出。0樣品脫糖將熒光帶部分中的蔗糖用無甘油的PBS透析，稀釋至10000倍以上。 用截留分子量為100KD的超濾管對樣品進行濃縮。SDS-PAGE定量并用透射電鏡表征(見圖 1)。4. SV40不對稱病毒納米顆粒的表征AuNPs可以高效結(jié)合到His-mvpl展示的Cys上。用AuNPs吸附實驗對樣品進行表征 (圖2)，同時制備陰性對照(圖3)和陽性對照(圖4)。在AuNPs與病毒納米顆粒2:1的情況下，不對稱病毒納米顆粒基本只吸附一個金顆粒，wtvpl形成的VNPs不能吸附金顆粒，而12 個五聚體均展示半胱氨酸的VWs則可以吸附1-3數(shù)目不等的金顆粒。該結(jié)果說明，不對稱病毒納米顆粒中只包含一個展示cys的五聚體(即His-mvpl)，其余11個為wtvpl五聚體。
以上僅是本發(fā)明眾多具體應(yīng)用范例中的一個實施例，對本發(fā)明的保護范圍不構(gòu)成任何限制。凡采用等同變換或是等效替換而形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明權(quán)利保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種不對稱病毒納米顆粒的制備方法，其特征在于，該方法為對病毒衣殼蛋白表面進行基因改造，使病毒衣殼蛋白同時帶有耦合的功能基團和分離基團，然后將該改造后的病毒衣殼蛋白與野生型病毒衣殼蛋白充分混合，并控制該兩種病毒衣殼蛋白的比例，同時根據(jù)病毒衣殼蛋白的總量加入相應(yīng)無機納米顆粒，實現(xiàn)病毒納米顆粒的可控組裝，獲得不對稱功能化的納米顆粒，即目標產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的不對稱病毒納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述病毒衣殼蛋白包括SV40衣殼蛋白VP1，所述功能基團包括半胱氨酸，所述分離基團包括His-tag。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的不對稱病毒納米顆粒的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟i .在SV40衣殼蛋白的VPl Loop中引入Cys，即，在第74位氨基酸突變?yōu)镃ys，并在第139位插入His-tag，構(gòu)建載體His-mvpl，并在生物體中實現(xiàn)表達，經(jīng)純化，獲得改造后的病毒衣殼蛋白His-mvpl ； .取改造后的病毒衣殼蛋白His-mvpl與原野生型SV40衣殼蛋白wtvpl充分混合，通過調(diào)節(jié)該兩種衣殼蛋白的比例，實現(xiàn)對組裝體病毒納米顆粒個體中該兩種衣殼蛋白成分比例的控制，根據(jù)衣殼蛋白總量與無機納米顆粒物質(zhì)的量比60:廣180:1添加無機納米顆粒， 在低鹽溶液中透析完成共組裝；iii.用金屬螯合親和層析法分離純化組裝產(chǎn)物，除去同種病毒衣殼蛋白自組裝的產(chǎn)物，獲得單一的不對稱病毒納米顆粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的不對稱病毒納米顆粒的制備方法，其特征在于，該方法還包括如下步驟iv .用蔗糖連續(xù)密度梯度法對步驟iii獲得的不對稱病毒納米顆粒進行分離，獲得大小均一的不對稱結(jié)構(gòu)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的不對稱病毒納米顆粒的制備方法，其特征在于，步驟i具體為將His-mvpl表達質(zhì)粒用氯化鈣法轉(zhuǎn)入五coli Rosetta (DE3)感受態(tài)細胞，在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)細菌并誘導(dǎo)表達重組蛋白His-mvpl，其后依次經(jīng)離心、破碎和柱層析處理，獲得改造后的病毒衣殼蛋白His-mvpl ；所述LB培養(yǎng)基中還含有抗生素和誘導(dǎo)劑，所述抗生素包括氨芐青霉素和/或氯霉素， 所述誘導(dǎo)劑包括IPTG。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的不對稱病毒納米顆粒的制備方法，其特征在于，步驟i包括如下步驟a、將His-mvpl表達質(zhì)粒用氯化鈣法轉(zhuǎn)入五co/iRosetta (DE3)感受態(tài)細胞，涂平板至少12 h后，挑取單克隆接入LB培養(yǎng)基中，加入抗生素，于37°C恒溫振蕩培養(yǎng)過夜，其后按照1%接種量轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基中，加入抗生素，于37°C恒溫振蕩培養(yǎng)，并加入誘導(dǎo)劑，在 25°C 37°C繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，離心收集菌體；b、將收集到的菌體清洗后重懸于bindingbuffer中進行超聲破碎，離心破碎后的菌液，取上清液進行柱層析，獲得改造后的病毒衣殼蛋白His-mvpl。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的不對稱病毒納米顆粒的制備方法，其特征在于，步驟ii具體為將摩爾比l:5(Tl :11的His-mvpl與wtvpl充分混合，并添加無機納米顆粒，無機納米顆粒與衣殼蛋白總分子數(shù)的比例控制為60 廣180:1，在低鹽溶液中透析完成共組裝。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的不對稱病毒納米顆粒的制備方法，其特征在于，步驟iii中所獲得的不對稱病毒納米顆粒具有正二十面體結(jié)構(gòu)，其外殼是由1個His-mVPl五聚體和11 個wtvpl五聚體組成，中心是無機納米顆粒。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的不對稱病毒納米顆粒的制備方法，其特征在于，步驟iii具體為采用鎳親和層析法，首先以15-30 mM咪唑溶液除去不帶有改造后的病毒衣殼蛋白 His-mvpl的組裝產(chǎn)物，即無功能基團和分離基團的病毒納米顆粒；然后取20(T1000 mM咪唑溶液洗脫得到組裝產(chǎn)物中只含有一個改造后的病毒衣殼蛋白His-mvpl單元的病毒納米顆粒，即不對稱病毒納米顆粒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種不對稱病毒納米顆粒的制備方法。該方法為對病毒衣殼蛋白表面進行基因改造，使病毒衣殼蛋白同時帶有耦合的功能基團和分離基團，然后將該改造后的病毒衣殼蛋白與野生型病毒衣殼蛋白充分混合，并控制該兩種病毒衣殼蛋白的比例，同時根據(jù)病毒衣殼蛋白總量加入相應(yīng)無機納米粒子，實現(xiàn)病毒納米顆粒的可控組裝，獲得不對稱功能化的納米顆粒，即目標產(chǎn)物。本發(fā)明選用生物大分子-蛋白質(zhì)作為納米材料，其容易改造和人為操縱，且方便大量獲取。利用可自組裝的病毒衣殼蛋白結(jié)構(gòu)的對稱性，可以將兩種不同的蛋白分子混合后按預(yù)先設(shè)計進行定向組裝，因此組裝體具有多樣性和可控性；反應(yīng)條件易控制，并且可以實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C12N7/04GK102321590SQ20111021496
公開日2012年1月18日 申請日期2011年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月29日
發(fā)明者李峰, 王強斌, 陳艷華 申請人:中國科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所