專(zhuān)利名稱(chēng)：利用高溫芽孢桿菌制備脂肽類(lèi)生物表面活性劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能產(chǎn)生物表面活性劑的高溫芽孢桿菌，屬于高溫芽孢桿菌的菌株生產(chǎn)脂肽類(lèi)生物表面活性劑的方法及其在石油開(kāi)采等方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
生物表面活性劑是一種公認(rèn)的多功能化學(xué)處理劑，它一方面具有化學(xué)合成表面活性劑的共性，另一方面又有穩(wěn)定性好、抗鹽性強(qiáng)、受溫度影響小、能被生物降解、無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)。生物表面活性劑已經(jīng)在石油、食品、化妝品及藥學(xué)等領(lǐng)域得到較廣泛的應(yīng)用，并且愈來(lái)傯受到人們的青睞。微生物自身的有益活動(dòng)如降解原油或代謝產(chǎn)物如生物表面活性劑、有機(jī)酸、醇等來(lái)提高原油流動(dòng)性，而達(dá)到提高采收率的采油技術(shù)。目前，石油開(kāi)采常規(guī)工藝技術(shù)采出的油量只占原始地質(zhì)儲(chǔ)量的1/3-1/2，而應(yīng)用微生物產(chǎn)生的生物表面活性劑提高石油采收率的技術(shù)(MEOR)是一項(xiàng)具有良好發(fā)展前景的3次強(qiáng)化采油技術(shù)。1968年由Arima等人發(fā)現(xiàn)的枯草芽孢桿菌OfeciBm sMiihi)生產(chǎn)的一種脂肽類(lèi)表面活性劑，自被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，受到持續(xù)關(guān)注，許多發(fā)明者致力于提高其產(chǎn)量、活性和降低生產(chǎn)成本，如何提高脂肽類(lèi)生物表面活性劑的高溫穩(wěn)定性，這需要選育優(yōu)良的高溫菌株，開(kāi)發(fā)高附加值產(chǎn)品，這正是本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明通過(guò)在油田和油井內(nèi)采樣，通過(guò)傳統(tǒng)微生物學(xué)方法和現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)篩選平臺(tái)，進(jìn)行了微生物菌種的篩選、培養(yǎng)、鑒定等，最終得到產(chǎn)脂肽類(lèi)生物表面活性劑的高溫芽孢桿菌LEYn。本發(fā)明采用油井內(nèi)源微生物，是一種對(duì)環(huán)境友好的內(nèi)源性高溫微生物表面活性劑，無(wú)任何污染和毒副作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)上述現(xiàn)有的不足，提供發(fā)酵周期短、工藝簡(jiǎn)單的利用一株高溫芽孢桿菌的制備脂肽類(lèi)生物表面活性劑的方法。利用高溫芽孢桿菌的制備脂肽類(lèi)生物表面活性劑的方法，按照下述步驟進(jìn)行
(1)菌種發(fā)酵將高溫芽孢桿菌LEY11進(jìn)行發(fā)酵；接種量按體積比3 10%(ν/ν)；發(fā)酵溫度為45°C 70°C，pH為6. 5 8. 0，轉(zhuǎn)速50 200rpm，通氣量2 8L/h，培養(yǎng)時(shí)間36 108h ；
(2)分離提純發(fā)酵液經(jīng)800(Tl0000r/min離心l(T20min去除菌體，上清液加入等體積的氯仿/甲醇(廣2/廣3，V/V)，萃取，取萃取液的下層液，5(T70°C減壓蒸干得生物表面活性劑粗品，氯仿再次洗滌5(T70°C蒸干得較純的生物表面活性劑產(chǎn)品。其中所述的高溫芽孢桿菌LEY11，該菌株已于2010年7月2日保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 3767，建議的分類(lèi)命名為芽孢桿菌 Bacillus sp. 0其中上述高溫芽孢菌LEY11采用液體培養(yǎng)基，在發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)，產(chǎn)生脂肽類(lèi)生物表面活劑，液體培養(yǎng)基含有碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽，碳源選自3%的葡萄糖、花生油、液體石蠟、可溶性淀粉、糊精、乳糖、酵母抽提物和0. 1%的萘和正十六烷；氮源選自氨基酸、黃豆餅粉、蛋白胨、硝酸銨、硫酸銨、氯化銨，無(wú)機(jī)鹽主要是硫酸鎂(MgS04)、硫酸錳(MnS04H20)、硫酸亞鐵(FeS047H20)、氯化鈣(CaCl22H20)、磷酸氫二鉀(K2HPO4)、磷酸二氫鉀(KH2PO4),其中 IOOOmL 鹽溶液中含有；MgSO4 19. 5g ；MnSO4H2O 5g ；FeS047H20 5g ；CaCl22H20 0. 3g。其中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為花生油l(T30mL、K2HPO4 5. 0 5. 7g ；KH2PO4 Γ . 7g ； NH4Cl 1. 5 2. 14g ；鹽溶液3 IOmL ；誘導(dǎo)因子正十六烷或萘為0. 5 0. Sg ；配置1000 mL,其中 IOOOmL 鹽溶液中含有；MgSO4 19. 5g ；MnSO4H2O 5g ；FeS047H20 5g ；CaCl22H20 0. 3g。優(yōu)選液體培養(yǎng)基每IOOOmL中含有花生油30mL (或可溶性淀粉30g或正十六烷 lg)、K2HPO4 5. 7g ；KH2PO4 1. 7g ；NH4Cl 2. 14g ；鹽溶液 10mL，其中 IOOOmL 鹽溶液中含有； MgSO4 19. 5g ；MnSO4H2O 5g ；FeS047H20 5g ；CaClJH2O 0. 3g。該菌產(chǎn)生的生物表面活性劑在采油的應(yīng)用，可應(yīng)用本發(fā)明表面活性劑進(jìn)行生物驅(qū)油，提高原油采收率。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下顯著優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明的高溫芽孢桿菌LEYll 最高生長(zhǎng)溫度85°C，最適生長(zhǎng)溫度45飛5°C ； (2)高溫芽孢桿菌LEYl 1對(duì)重?zé)N降解效果十分明顯，產(chǎn)脂肽類(lèi)表面活性劑具有顯著的乳化作用，可提高油田的原油采收率，改善使用化學(xué)表面活性劑對(duì)環(huán)境和原油的污染，并且用于油類(lèi)污染土壤的環(huán)境修復(fù)效果明顯；(3)本發(fā)明產(chǎn)脂肽類(lèi)表面活性劑發(fā)酵溫度高達(dá)80°C，最高產(chǎn)量可達(dá)18g/L，65°C能使發(fā)酵液表面張力降低至24. 8mN/m，排油圈直徑達(dá)8. 5cm ； (4)發(fā)酵溫度高，高溫芽孢桿菌產(chǎn)生的表面活性劑熱穩(wěn)定性高，發(fā)酵過(guò)程中污染少，容易控制。


圖1高溫芽孢桿菌LEY11產(chǎn)生的生物表面活性劑紅外譜圖； 圖2高溫芽孢桿菌LEY11產(chǎn)生的表面活性劑1H-NMR ；
圖3脂肽類(lèi)生物表面活性劑TLC分析圖(展層劑為氯仿/甲醇/水，65/15/20，V/V/V, 顯色劑為茚三酮顯色劑，脂肽顯紅色)
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述的高溫芽孢桿菌LEY11,該菌株已于2010年7月2日保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 3767，建議的分類(lèi)命名為芽孢桿菌 Bacillus sp. 0屬于芽孢桿菌屬，菌株LEY11為革蘭氏陰性，兼性好氧菌，桿狀，個(gè)體大小，長(zhǎng)為 2. 5 3. 5 μ m，寬為0. 6 μ m，在細(xì)菌培養(yǎng)基上形成乳白色菌落，菌落為圓形；個(gè)體為卵形，端生芽孢。高溫芽孢桿菌生長(zhǎng)溫度范圍45°C 85°C ；最適生長(zhǎng)溫度范圍45°C 65°C ；最適生長(zhǎng) pH 為 6. 5^8. O。實(shí)施例1脂肽類(lèi)生物表面活性劑制備
將高溫芽孢桿菌LEYll分別接入到含十六烷或萘為誘導(dǎo)因子的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，得到脂肽類(lèi)表面活性劑發(fā)酵液。在發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)，產(chǎn)生脂肽類(lèi)生物表面活劑，液體培養(yǎng)基含有碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽，即為花生油 30mL、K2HPO4 5. 7g ；KH2PO4 1. 7g ；NH4Cl 2. 14g ；鹽溶液 IOmL ；誘導(dǎo)因子正十六烷或萘為0. 8g ；配置1000 mL ；其中鹽溶液(IOOOmL)中含有；MgSO4 19. 5g ；MnSO4H2O 5g ；FeS047H20 5g ；CaCl22H20 0. 3g。接種量3%，培養(yǎng)溫度65°C，搖床轉(zhuǎn)速120rpm培養(yǎng)96小時(shí)，然后測(cè)定發(fā)酵液的表面張力和排油圈，發(fā)酵液的表面張力直徑分別為葡萄糖42.84 mN/m、花生油20. 71 mN/m、液體石蠟67. 17 mN/m、可溶性淀粉23. 56 mN/m、糊精40. 36 mN/m ；排油圈直徑分別為葡萄糖 0. 6cm、花生油1. 3cm、液體石蠟0. 3cm、可溶性淀粉1. 1cm、糊精0. 7cm。分離提純發(fā)酵液經(jīng)lOOOOr/min離心20min去除菌體，上清液加入等體積的氯仿 /甲醇0/1，V/ν)，萃取，取萃取液的下層液，60°C減壓蒸干得生物表面活性劑粗品，氯仿再次洗滌70°C蒸干得較純的生物表面活性劑產(chǎn)品。脂肽水解取上述一定量的脂肽產(chǎn)品，加入6mol/L的HC1，真空密封，10(Γ 10 酸解，酸解結(jié)束后，用NaOH調(diào)節(jié)水解液的ρΗ到5. 5左右，定量移入l(T50mL容易瓶中定容做氨基酸組成分析，該脂肽中含有谷氨酸(Glu)或谷氨酰胺(Gin)、天冬氨酸(Asp)或天冬酰胺(Asn)，結(jié)氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)，其中谷氨酸含量為1·7 2·2Χ10_5 mol/g?！?br> 表面活性劑經(jīng)紅外光譜分析，3396. 5CHT1是由分子間氫鍵引起的N-H伸縮振蕩， 1650.8 cnT1與1537.4 cnT1為酰胺鍵吸收譜帶，說(shuō)明表面活性劑分子結(jié)構(gòu)中有肽鍵； 296Γ2860 cm—1和1470 1380 cm—1的兩處吸收是脂肪酸族的C-H伸縮振蕩。脂肽類(lèi)化合物核磁圖1HNMr(CDCI3)δ 3. 95 (3Η, s, -OCH3), 4.01(3 s, -OCH3), 6. 49 (1H, d, J=22. 5 Hz, 6_H)，7. 06 (1H, s, 3_H)，7. 19 (1H, m, 8_H)， 7. 22 (1H, m, Ar-H), 7. 40-7. 45 (7H, m, 3，，4，，5，_H, Ar-H), 7. 94 (2H, d, J=21. 5 Hz, 2，，6，-2H)，9. 05 (1H, s, NH)。由圖1 圖3可得出該表面活性劑為脂肽類(lèi)物質(zhì)。實(shí)施例2脂肽類(lèi)生物表面活性劑增油性能評(píng)價(jià)
利用實(shí)施例1得到的表面活性劑發(fā)酵液，實(shí)驗(yàn)室高溫模擬油藏進(jìn)行物模驅(qū)油試驗(yàn)，提高采收率8. 1%，應(yīng)用前景較好。按一定比例配好不同料徑的石英砂裝填巖心，通入飽和油井產(chǎn)出水，測(cè)滲透率和孔隙度，并計(jì)算原油飽和度，注前段營(yíng)養(yǎng)及實(shí)施例1發(fā)酵液，關(guān)閉物理驅(qū)油模型，75°C恒溫培養(yǎng)10d、20d和30d，開(kāi)啟模型進(jìn)行后續(xù)水驅(qū)測(cè)定原油采收率。培養(yǎng)10d、20d和30d，比空白巖心在靜態(tài)放置10d、20d和30d后采收率分別提高了 4. 9%、6.洲和8. 1%，說(shuō)明高溫菌 LEYll在實(shí)驗(yàn)室模擬高溫油藏的條件下可以生長(zhǎng)并產(chǎn)生表面活性劑，能夠乳化原油，增加原油流動(dòng)性提高采收率。
權(quán)利要求
1.利用高溫芽孢桿菌的制備脂肽類(lèi)生物表面活性劑的方法，其特征在于按照下述步驟進(jìn)行(1)菌種發(fā)酵將高溫芽孢桿菌LEY11進(jìn)行發(fā)酵；接種量按體積比3 10%；發(fā)酵溫度為 450C "700C，pH為6. 5 8. 0，轉(zhuǎn)速50 200rpm,通氣量2 8L/h，培養(yǎng)時(shí)間36 108h ；(2)分離提純發(fā)酵液經(jīng)800(Tl0000r/min離心l(T20min去除菌體，上清液加入等體積的氯仿/甲醇(廣2/廣3，V/V)，萃取，取萃取液的下層液，5(T70°C減壓蒸干得生物表面活性劑粗品，氯仿再次洗滌5(T70°C蒸干得較純的生物表面活性劑產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用高溫芽孢桿菌的制備脂肽類(lèi)生物表面活性劑的方法，其特征在于其中所述的高溫芽孢桿菌LEY11,該菌株已于2010年7月2日保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 3767。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用高溫芽孢桿菌的制備脂肽類(lèi)生物表面活性劑的方法，其特征在于其中上述高溫芽孢菌LEY11采用液體培養(yǎng)基，在發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)，產(chǎn)生脂肽類(lèi)生物表面活劑，液體培養(yǎng)基含有碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽，碳源選自3%的葡萄糖、花生油、液體石蠟、 可溶性淀粉、糊精、乳糖、酵母抽提物和0. 1%的萘和正十六烷；氮源選自氨基酸、黃豆餅粉、 蛋白胨、硝酸銨、硫酸銨、氯化銨，無(wú)機(jī)鹽主要是硫酸鎂(MgS04)、硫酸錳(MnSCVH2O)、硫酸亞鐵(FeS04·7H20)、氯化鈣(CaCl2CH2O)、磷酸氫二鉀(K2HPO4)、磷酸二氫鉀(KH2PO4),其中 IOOOmL 鹽溶液中含有；MgSO4 19. 5g ；MnSO4^H2O 5g ；FeS04*7H20 5g ；CaCl2*2H20 0. 3g。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用高溫芽孢桿菌的制備脂肽類(lèi)生物表面活性劑的方法， 其特征在于其中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為花生油10 30mL、K2HPO4 5. 0 5· 7g ；KH2PO4 Γ . 7g ； NH4Cl 1. 5 2. 14g ；鹽溶液3 IOmL ；誘導(dǎo)因子正十六烷或萘為0. 5 0. Sg ；配置1000 mL,其中 IOOOmL 鹽溶液中含有；MgSO4 19. 5g ；MnSO4^H2O 5g ；FeS04*7H20 5g ；CaCl2*2H20 0. 3g。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用高溫芽孢桿菌的制備脂肽類(lèi)生物表面活性劑的方法，其特征在于液體培養(yǎng)基每IOOOmL中含有花生油30mL或可溶性淀粉30g或正十六烷lg、 K2HPO4 5. 7g ；KH2PO4 1. 7g ；NH4Cl 2. 14g ；鹽溶液 10mL，其中 IOOOmL 鹽溶液中含有；MgSO4 19. 5g ；MnS04*H20 5g ；FeS04*7H20 5g ；CaCl2*2H20 0. 3g。
全文摘要
本發(fā)明利用高溫芽孢桿菌制備脂肽類(lèi)生物表面活性劑的方法，屬于高溫芽孢桿菌的菌株生產(chǎn)脂肽類(lèi)生物表面活性劑的方法及其在石油開(kāi)采等方面的應(yīng)用領(lǐng)域。利用高溫芽孢桿菌LEY11(菌株已于2010年7月2日保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo.3767)進(jìn)行微生物液體發(fā)酵產(chǎn)脂肽類(lèi)生物表面活性劑，用TLC和紅外光譜分析對(duì)所產(chǎn)表面活性劑進(jìn)行分析，對(duì)所需的液體培養(yǎng)基進(jìn)行碳源和氮源成份優(yōu)化及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并測(cè)試生物表面活性劑的乳化性能和模擬高溫油藏條件下進(jìn)行驅(qū)油物理模擬，粗提品和發(fā)酵液可以應(yīng)用于生物采油劑、化妝品、食品、洗滌劑、藥品、農(nóng)藥和環(huán)保等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12P21/00GK102399847SQ20111021532
公開(kāi)日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2011年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月29日
發(fā)明者何玉財(cái), 朱孝霖, 李亮, 李爾煬, 楊廣花, 蔡志強(qiáng), 趙希岳 申請(qǐng)人:常州大學(xué)