專利名稱：一種含hipk2基因的重組質(zhì)粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組質(zhì)粒，具體地，涉及一種含HIH(2 (同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白激酶2)基因的重組質(zhì)粒。
背景技術(shù)：
11] !^ ; ^^2(homeodomain-interacting protein kinase 2, HIH(2)是定位于細(xì)胞核內(nèi)的絲/蘇氨酸蛋白激酶家族成員之一，它能與同源框類蛋白相互作用而廣泛參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。HPK家族蛋白具有一個保守的激酶結(jié)構(gòu)域和一個同源蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域，因其能夠增強(qiáng)同源蛋白轉(zhuǎn)錄活性，故取名為同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白激酶，目前已知該激酶有3個亞型，分別為HIHQ、HIH(2、HIH(3，其中對HIPK2研究最多。HIPK2存在于不同生物體(如線蟲、嚙齒類動物和人類)，HIPK2在除神經(jīng)組織外的正常人體組織中表達(dá)水平非常低，在腦、白細(xì)胞、辜丸、前列腺、卵巢和小腸組織中則幾乎測不到，僅在心、 肌肉和腎臟相對較高表達(dá)。HIPK2基因定位于人類第7條染色體7q32-q34，小鼠染色體6B，全長15. 2kb，編碼區(qū)序列長約3595bp。HIPK2從美麗線蟲到人類高度保守，小鼠與人類之間氨基酸98%同源，有 L4kb、4· 5kb、7.8kb、llkb4個轉(zhuǎn)錄本，主要以111Λ為主，各種組織表達(dá)不盡相同。HIPK2含 1189個氨基酸，屬于DYRK激酶家族，氨基端192-520位氨基酸殘基為一個蛋白激酶基序， 583-798位為同源結(jié)構(gòu)域相互作用結(jié)構(gòu)域，839-934位為PEST區(qū)，梭基端富含酪氨酸和組氨酸結(jié)構(gòu)域。HIPK2不僅與晚期胚胎發(fā)生、神經(jīng)組織、視網(wǎng)膜發(fā)育及肌肉組織發(fā)育等密切相關(guān)， 還參與調(diào)控腫瘤信號傳導(dǎo)通路，抑制癌基因的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤血管新生。目前研究發(fā)現(xiàn)，HIPK2抵制腫瘤發(fā)生主要通過以下幾個方面(1)協(xié)同p53抑癌作用 HIPK2是細(xì)胞DNA損傷信號通路中包括p53在內(nèi)的許多轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，與p53共同定位于核小體內(nèi)，并磷酸化P53的46位絲氨酸位點(diǎn)。HIPK2可通過p53依賴和非依賴兩種方式對P53抑制蛋白MDM2的修飾或胞內(nèi)移位而降低MDM2蛋白水平，增加p53基因轉(zhuǎn)錄活性。HIPK2也可以通過與p53的另一個抑制蛋白DAXX相互作用，阻止其與下游效應(yīng)蛋白的結(jié)合，從而激活P53 Ser46的磷酸化，促進(jìn)p53信號傳導(dǎo)的傳遞。(2)阻滯Wnt/β-catenin 信號通路HIPK2作為同源結(jié)構(gòu)域相互作用的蛋白激酶，對腫瘤細(xì)胞內(nèi)Wnt/ii-catenin信號通路的調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要作用。敲除內(nèi)源性HIPK2后，可明顯增加細(xì)胞內(nèi)β-catenin的穩(wěn)定性和胞內(nèi)積聚量，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)和細(xì)胞增殖，說明HIPK2是Wnt/ β -catenin通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子。HIPK2過表達(dá)能明顯下調(diào)腫瘤細(xì)胞內(nèi)VEGF的mRNA水平和啟動子活性，抑制腫瘤血管新生。(3)抑制缺氧信號傳導(dǎo)腫瘤細(xì)胞在缺氧條件下應(yīng)激產(chǎn)生大量缺氧反應(yīng)基因，并調(diào)控涉及腫瘤能量代謝、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移等下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。HIPK2可參與缺氧基因的調(diào)控，影響缺氧應(yīng)答的上下游事件，是缺氧應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)蛋白。常氧條件下，HIPK2以組蛋白脫乙?；?共阻遏復(fù)合物的形式與HIF-I α啟動子結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平抑制HIF-I α的表達(dá)及轉(zhuǎn)錄活性。ΗΙΡΚ2的過表達(dá)不僅能下調(diào)鈷穩(wěn)定的HIF-I α的蛋白和mRNA表達(dá)水平，同時也能抑制其隨后的轉(zhuǎn)錄活性，恢復(fù)缺氧模擬條件下化療藥物凋亡誘導(dǎo)作用的能力，并使化療藥耐藥腫瘤細(xì)胞重新致敏。(4)其他方面ΗΙΡΚ2 可以非Ρ53依賴的方式調(diào)節(jié)TGF-β誘導(dǎo)的JNK激活和凋亡信號通路，作為重要的調(diào)節(jié)因子參與了 JNK誘導(dǎo)CtBP磷酸化過程，下調(diào)CPLA2/PGE2信號通路的激活。ΗΙΡΚ2參與大部分腫瘤發(fā)生機(jī)制調(diào)節(jié)和腫瘤信號傳導(dǎo)通路的調(diào)控，腫瘤細(xì)胞癌基因和抑癌基因之間的平衡失調(diào)均可導(dǎo)致癌基因的過表達(dá)而促使腫瘤惡化。ΗΙΡΚ2作為一種內(nèi)源性的抑癌基因，是有效抑制腫瘤發(fā)生的蛋白激酶之一，在腫瘤的平衡穩(wěn)定中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，是惡性腫瘤預(yù)防和治療的一個非常具有潛力的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。但由于ΗΙΡΚ2的發(fā)現(xiàn)和分離較晚，其作為一個腫瘤抑制基因的研究主要集中在其對細(xì)胞增殖和凋亡方面較多，而對腫瘤其它生物學(xué)活性影響的研究較少，人們對于ΗΙΡΚ2作為一個腫瘤抑制基因在惡性腫瘤的生物學(xué)行為(如腫瘤血管新生、運(yùn)動粘附、侵襲轉(zhuǎn)移等)中的作用還不是很清楚。目前肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤術(shù)后化療是主要的治療手段，但由于化療對機(jī)體的殺傷性太大，毒副作用太強(qiáng)，化療似乎走到了一個平臺期，已經(jīng)不能夠滿足臨床惡性腫瘤治療的需要。如何實現(xiàn)治療效果上的重大突破是國內(nèi)外面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，隨著對腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑研究的不斷深入，針對細(xì)胞受體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期和血管生成等的分子靶向治療，已成為結(jié)腸直腸癌內(nèi)科治療的新方向。目前，臨床上應(yīng)用較多的是針對單一作用靶點(diǎn)或受體的靶向治療藥物，且多為蛋白制劑，治療作用局限。同時，由于應(yīng)用分子靶向制劑防治腫瘤的量大，應(yīng)用蛋白制劑成本及費(fèi)用太高，蛋白純化方法復(fù)雜，高純度大批量生產(chǎn)困難，不能滿足臨床治療的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種含同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白激酶2基因(ΗΙΗ(2)的重組質(zhì)粒(如PEGFP-N3-HIPK2)，用于ΗΙΡΚ2基因在腫瘤血管新生、增殖凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移等惡性腫瘤的生物學(xué)行為中作用機(jī)理的研究，繼而開發(fā)和制造抗腫瘤藥物。為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供了一種含ΗΙΡΚ2基因的重組質(zhì)粒及其應(yīng)用途徑，該重組質(zhì)粒包含ΗΙΡΚ2基因的編碼序列以及載體質(zhì)粒DNA序列，所述的載體質(zhì)粒DNA序列中包含與ΗΙΡΚ2基因連接的調(diào)節(jié)序列；所述的重組質(zhì)粒通過以下步驟構(gòu)建
步驟1，以含有人ΗΙΡΚ2基因的真核表達(dá)載體pENTR223. 1/ΗΙΡΚ2為模板設(shè)計引物序列， 分別引入Nhe I和Kpn I酶切位點(diǎn)；
步驟2，對ΗΙΡΚ2基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
步驟3，對所得ΗΙΡΚ2基因序列和載體質(zhì)粒進(jìn)行Nhe I和Kpn I雙酶切以及純化； 步驟4，將步驟3所得產(chǎn)物進(jìn)行T4 DNA連接酶酶切，使ΗΙΡΚ2基因目的片段和載體質(zhì)粒相連接；
步驟5，用步驟4所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞； 步驟6，將步驟5所得重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定陽性克隆并測序。其中，所述的載體質(zhì)粒DNA序列與ΗΙΡΚ2基因可操作地連接的調(diào)節(jié)序列，如啟動子，包含如CMV即刻早期、HCV胸腺嘧啶激酶、早期和晚期SV40、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTR等任何在真核細(xì)胞中有作用的啟動子。所述的ΗΙΡΚ2基因的編碼序列(CDs)能夠編碼基本保留同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白激酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸，該HIPK2基因的編碼序列也包含該基因天然發(fā)生的等位基因變異體的編碼序列，以及天然發(fā)生或人工變異體的編碼序列中的任意一種。所述的載體質(zhì)粒是可以在宿主中復(fù)制和生存的真核表達(dá)質(zhì)粒，包括如pEGFP、 pcDNA、pSVL、pSG、pSVK3、pMSG、pBPV、pXTl等分子生物學(xué)領(lǐng)域常用的載體，也可使用可在宿主中復(fù)制和生存的其它真核表達(dá)質(zhì)粒。本發(fā)明的重組質(zhì)?？梢酝ㄟ^分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)構(gòu)建，HIPK2基因序列和表達(dá)載體是已知的，并可按照需要構(gòu)建用于特定目的的新克隆和表達(dá)載體，在獲得本發(fā)明的HIPK2基因后，可以進(jìn)行通過常規(guī)重組技術(shù)導(dǎo)入任何適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載體中。本發(fā)明具有以下突出的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明提供的含HIPK2基因的重組質(zhì)?？捎糜?HIPK2基因?qū)δ[瘤其它生物學(xué)活性影響的研究，繼而用于抗腫瘤藥物的制造中，在HIPK2基因在腫瘤血管新生、增殖凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移等惡性腫瘤的生物學(xué)行為中作用機(jī)理的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開發(fā)和生產(chǎn)可預(yù)防和治療惡性腫瘤的藥物，所述的惡性腫瘤包括肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌和肺癌等，特別是消化系惡性腫瘤。


圖1是PEGFP-N3-HIPK2重組質(zhì)粒構(gòu)建概要圖。圖2是PCR擴(kuò)增HIPK2基因電泳結(jié)果。圖3是pEGFP-N3載體雙酶切結(jié)果。圖4是pEGFP-N3-HIPK2重組質(zhì)粒陽性克隆酶切結(jié)果。圖fe-圖5g是pEGFP-N3-HIPK2重組質(zhì)粒測序結(jié)果。圖6是HIPK2基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌細(xì)胞24h綠色熒光蛋白表達(dá)情況。圖7是HIPK2基因重組質(zhì)粒對人結(jié)直腸癌細(xì)胞C0X-2啟動子活性的影響。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明的具體實施方式
。實施例1 :pEGFP-N3-HIPK2重組質(zhì)粒的構(gòu)建
如圖1所示，PEGFP-N3-HIPK2重組質(zhì)粒構(gòu)建過程，具體包括以下步驟
1.引物設(shè)計
將含有人HIPK2基因的真核表達(dá)載體pENTR223. 1/HIPK2 (購自美國Open Biosystems 公司)為模板，設(shè)計引物序列，分別引入Nhe I和Kpn I酶切位點(diǎn)
上游引物，5’端CTA部分為保護(hù)堿基，下劃線部分GCTAGC為Nhe I酶切位點(diǎn) 5’-CTAGCTAGCGCCACCATGGCCCCCGTGTACGAAGGTATGGCCTCAC-3' 下游引物，5’端CGG部分為保護(hù)堿基，下劃線部分GGTACC為Kpn I酶切位點(diǎn) 5’-CGGGGTACCTATGTAAGGGTACTGGTTGACCTTGGCGG-3'
2.PCR擴(kuò)增
2. 1 PCR反應(yīng)體系如下
在PCR反應(yīng)管中配置以下體系，模板量為0. 1 μ L擴(kuò)增ΗΙΗ(2⑶S 2. 5mM dNTP mixture (三磷酸脫氧核苷酸混合溶液) 2 μ IOXPyrobest buffer (緩沖液)2.5 μ
5模板 DNA0. 1 μ
引物 ΗΙΡΚ2 Nhe I F(5pmol)1 μ
引物 ΗΙΡΚ2 Kpn I R(5pmol)1 μ
PyrobestTM DNA Polymerase0. 25 μ
ddH20 (去離子水)17. 25 μ
定容至總量25 μ
注Pyrobest DNA Polymerase (PyrobestDNA 聚合酶)購于 TaKaRa 公司，貨號 DR005A。 將上述體系混勻后，置于ABI 7900型PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下
權(quán)利要求
1.一種含HIPK2基因的重組質(zhì)粒，其特征在于，該重組質(zhì)粒包含HIPK2基因的編碼序列以及載體質(zhì)粒DNA序列，所述的載體質(zhì)粒DNA序列中包含與HIPK2基因連接的調(diào)節(jié)序列； 所述的重組質(zhì)粒通過以下步驟構(gòu)建步驟1，以含有人HIPK2基因的真核表達(dá)載體pENTR223. 1/HIPK2為模板設(shè)計引物序列， 分別引入Nhe I和Kpn I酶切位點(diǎn)；步驟2，對HIPK2基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；步驟3，對所得HIPK2基因序列和載體質(zhì)粒進(jìn)行Nhe I和Kpn I雙酶切以及純化；步驟4，將步驟3所得產(chǎn)物進(jìn)行T4 DNA連接酶酶切，使HIPK2基因目的片段和載體質(zhì)粒相連接；步驟5，用步驟4所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；步驟6，將步驟5所得重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定陽性克隆并測序。
2.如權(quán)利要求1所述的含HIPK2基因的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述的HIPK2基因的編碼序列也包含該基因天然發(fā)生的等位基因變異體的編碼序列，以及天然發(fā)生或人工變異體的編碼序列中的任意一種。
3.如權(quán)利要求1所述的含HIPK2基因的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述的載體質(zhì)粒是可以在宿主中復(fù)制和生存的真核表達(dá)質(zhì)粒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含HIPK2基因的重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒包含HIPK2基因的編碼序列以及載體質(zhì)粒DNA序列。其中載體質(zhì)粒DNA序列包含與HIPK2基因可操作地連接的調(diào)節(jié)序列，該載體質(zhì)粒是可以在宿主中復(fù)制和生存的真核表達(dá)質(zhì)粒。該重組質(zhì)粒的構(gòu)建包括引物設(shè)計、PCR擴(kuò)增、NheI和KpnI雙酶切及純化、目的片段和載體質(zhì)粒的連接、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞以及重組質(zhì)粒酶切鑒定陽性克隆并測序等步驟。該重組質(zhì)?？捎糜贖IPK2基因在腫瘤血管新生、增殖凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)理的研究，以及基于HIPK2基因的抗腫瘤藥物的開發(fā)和生產(chǎn)，從而提供預(yù)防和治療肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤的新途徑。
文檔編號C12N15/85GK102277383SQ20111021719
公開日2011年12月14日 申請日期2011年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月1日
發(fā)明者周利紅, 周寧, 慈書俊, 李琦, 殷佩浩, 王炎, 范忠澤 申請人:上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院, 上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院