專利名稱：利用異源啟動(dòng)子控制大腸桿菌基因組n-乙?；D(zhuǎn)移酶表達(dá)重組菌及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用異源啟動(dòng)子控制大腸桿菌基因組 N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)重組菌及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蛋白和多肽的N-末端乙酰化修飾是真核細(xì)胞中普遍存在的一種修飾，50%以上的真核細(xì)胞胞漿蛋白都有這種修飾。初步的功能研究表明N-末端乙酰化可通過(guò)改變N-端的電荷性，封閉N-端等方式，對(duì)許多蛋白和多肽的空間結(jié)構(gòu)、配體識(shí)別、抗降解等特性產(chǎn)生重要影響。如小分子GIPaes-Arl3P蛋白的N-末端乙?；揎棿龠M(jìn)了其與膜受體Syslp/ hSysl的識(shí)別，并使其定位到膜上。胎兒血紅蛋白的N-末端乙?；梢允蛊渌木垠w的解聚能力提高30倍。胸腺素α 1 (thymosin α 1, T α 1)的Ν_末端乙?；瘜?duì)其在血漿中的穩(wěn)定性具有重要作用。除了 Τα 1外，還有如黑色素細(xì)胞刺激素(Melanocyte-Mimulating Hormones, a -MSH)、胸腺素β 4 (Thymosin β 4，T β 4)等一批在臨床上具有重要應(yīng)用的多肽也需要N-末端乙?；揎棥Ｅc真核生物中的普遍存在現(xiàn)象明顯不同的是，原核生物的N-末端乙?；揎椃浅：币?。在大腸桿菌內(nèi)源蛋白中已知發(fā)生N-末端乙?；揎椀闹挥泻颂求w亞基L7、S5、 S18、延長(zhǎng)因子EF-Tu和伴侶蛋白kcB等為數(shù)不多的幾種蛋白。大腸桿菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的參與蛋白和多肽的N-末端乙?；揎椀囊阴；D(zhuǎn)移酶只有負(fù)責(zé)核糖體亞基S5乙?；揎椀?RimI，核糖體亞基S18乙酰化修飾的RimJ，和核糖體亞基L7乙?；揎椀腞imL。這些乙?；D(zhuǎn)移酶有很強(qiáng)的底物專一性。除上述每個(gè)酶對(duì)應(yīng)的特異性底物外，未知其能修飾大腸桿菌的其它蛋白或多肽。胸腺素α是一族具有相同或相似的N-端序列的免疫調(diào)節(jié)多肽，它們包括胸腺素 α原、胸腺素a 1、胸腺素a 11及其各種融合蛋白等。胸腺素a 1和胸腺素a 11是胸腺素 α原在體內(nèi)降解的產(chǎn)物，它們分別包括了胸腺素α原的化端觀和35個(gè)氨基酸。不同物種的胸腺素α具有很高的保守性。胸腺素α的氨基酸序列上某些位點(diǎn)存在多態(tài)性，如其 N-端第13位氨基酸殘基，有的是蘇氨酸，有的是異亮氨酸，它們具有相同或相似的功能。胸腺肽是一類動(dòng)物胸腺中提取的包含各種胸腺素α及其它胸腺來(lái)源肽類的免疫制劑，已廣泛用于病毒性肝炎、腫瘤等的治療。但動(dòng)物提取的胸腺肽存在成分復(fù)雜，純度低， 其中混有動(dòng)物來(lái)源的污染物，易產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)等問(wèn)題?；瘜W(xué)合成的N-乙酰化胸腺素al， 是一種采用多肽化學(xué)合成方法制備的N-乙?；叵偎豠 1，此種方法獲得的T a 1純度高、 活性高、沒(méi)有明顯的副反應(yīng)，如kiClone公司的“日達(dá)仙”，已被包括我國(guó)在內(nèi)的多個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)用于病毒性肝炎的治療獲作為免疫調(diào)節(jié)藥物；但化學(xué)合成N-乙?；叵偎豠 1這樣一個(gè)觀個(gè)氨基酸的多肽，合成和純化工藝復(fù)雜，得率較低，因此制品價(jià)格高，限制了該藥的廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種重組菌。本發(fā)明提供的一種重組菌，為將胸腺素α的編碼基因?qū)胫亟M菌A中得到的重組菌；所述胸腺素α為一種多肽或蛋白，其N末端的觀個(gè)氨基酸殘基與序列表中序列 3的N末端的觀個(gè)氨基酸相同或其N末端的觀個(gè)氨基酸殘基與序列表中序列3的N末端的28個(gè)氨基酸至少具有90%同源性；所述重組菌A為將外源誘導(dǎo)型啟動(dòng)子插入宿主菌的乙?；D(zhuǎn)移酶編碼基因的上游，用于啟動(dòng)所述乙?；D(zhuǎn)移酶編碼基因的表達(dá)，得到的重組菌。所述胸腺素α的編碼基因通過(guò)重組載體導(dǎo)入所述的重組菌A;所述重組載體為將所述胸腺素α編碼基因插入表達(dá)載體中，得到表達(dá)胸腺素α 的重組載體；所述的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子為乳糖啟動(dòng)子、阿拉伯糖啟動(dòng)子、堿性磷酸酯酶啟動(dòng)子、色氨酸啟動(dòng)子、噬菌體Τ7、P。Pk啟動(dòng)子或含有這些啟動(dòng)子部分元件的雜合啟動(dòng)子Tac、；所述乙?；D(zhuǎn)移酶為RimL或RimJ，所述RimL為如下(a)、(b)或(c)所示的蛋白(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(c)與a)或b)限定的氨基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白；所述RimJ為如下(d)、(e)或(f)所示的蛋白(d)由序列表中序列8所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(e)將序列表中序列8所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(f)與d)或e)限定的氨基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白。所述胸腺素α編碼基因?yàn)橐环N多核苷酸，其核苷酸序列為序列表中的序列4或與序列表中的序列4的5’末端起84位核苷酸相同或者與序列表中的序列4的5’末端起84 位核苷酸同源性至少具有90%的DNA分子；所述表達(dá)載體優(yōu)選為pBV220或ρΕΤ2^。所述宿主菌為大腸桿菌；所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子為噬菌體Τ7啟動(dòng)子或啟動(dòng)子，所述噬菌體T7啟動(dòng)子的核苷酸序列為序列表中序列5的自5’末端第1119-1135位核苷酸或序列表中序列6的自5’ 末端第1119-1135位核苷酸；所述I\PK啟動(dòng)子的核苷酸序列為序列表中序列9的自5’末端第2100-2411位核苷酸。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種重組菌。本發(fā)明提供的重組菌，為將外源誘導(dǎo)型啟動(dòng)子插入宿主菌的乙?；D(zhuǎn)移酶編碼基因的上游，用于啟動(dòng)所述乙?；D(zhuǎn)移酶編碼基因的表達(dá)，得到的重組菌。所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子為乳糖啟動(dòng)子、阿拉伯糖啟動(dòng)子、堿性磷酸酯酶啟動(dòng)子、色氨酸啟動(dòng)子、噬菌體Τ7、PL, Pe啟動(dòng)子或含有這些啟動(dòng)子部分元件的雜合啟動(dòng)子Tac、PJV
所述宿主菌為大腸桿菌；所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子為噬菌體T7啟動(dòng)子或啟動(dòng)子，所述噬菌體T7啟動(dòng)子的核苷酸序列為序列表中序列5的自5’末端第1119-1135位核苷酸或序列表中序列6的自5’ 末端第1119-1135位核苷酸；所述I\PK啟動(dòng)子的核苷酸序列為序列表中序列9的自5’末端第2100-2411位核苷酸；所述乙?；D(zhuǎn)移酶為RimL或RimJ，所述RimL為如下(a)、(b)或(c)所示的蛋白(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(c)與a)或b)限定的氨基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白；所述RimJ為如下(d)、(e)或(f)所示的蛋白(d)由序列表中序列8所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(e)將序列表中序列8所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(f)與d)或e)限定的氨基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白。上述另一個(gè)目的提供的重組菌按照如下方法制備1)將pKD46質(zhì)粒導(dǎo)入宿主菌中，得到重組菌1 ；2)將含有T7啟動(dòng)子的DNA分子或含有啟動(dòng)子DNA分子導(dǎo)入步驟1)得到的重組菌1中，得到重組菌2;3)將步驟2、得到的重組菌2分別在含氯霉素的培養(yǎng)基和含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，若能在含氯霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但不在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基生長(zhǎng)的即為重組菌；所述含有T7啟動(dòng)子的DNA分子的核苷酸序列為序列表中的序列5或序列表中的序列6 ；所述含有啟動(dòng)子DNA分子的核苷酸序列為序列表中的序列9。上述重組菌在制備N-乙酰化胸腺素中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種制備N-乙酰化胸腺素α的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟發(fā)酵所述的重組菌，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到N-乙酰化胸腺素α。所述發(fā)酵的溫度為42°C，所述發(fā)酵時(shí)間為12h。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明構(gòu)建了 N-乙?；D(zhuǎn)移酶和胸腺素α的編碼基因進(jìn)行共表達(dá)得到的重組菌，發(fā)酵該重組菌，得到胸腺素α均大多為N-乙?；叵偎卅?，不僅可以提高N-乙?；叵偎卅恋漠a(chǎn)率，而且可以通過(guò)減少非乙?；叵偎卅恋谋壤?，方便 N-乙?；叵偎卅恋姆蛛x，具有明顯的應(yīng)用前景。


圖1為red同源DNA分子1結(jié)構(gòu)示意2為大腸桿菌中T7誘導(dǎo)表達(dá)rimL對(duì)α乙?；降挠绊?橫坐標(biāo)表示保留時(shí)間(min)，縱坐標(biāo)代表紫外吸收值(mAU))
圖3為red同源DNA分子2結(jié)構(gòu)示意4為大腸桿菌中T7誘導(dǎo)表達(dá)rimj對(duì)α乙?；降挠绊?橫坐標(biāo)表示保留時(shí)間(min)，縱坐標(biāo)代表紫外吸收值(mAU))圖5為red同源DNA分子3結(jié)構(gòu)示意6為大腸桿菌中ΡΛ誘導(dǎo)表達(dá)rimj對(duì)α乙酰化水平的影響(橫坐標(biāo)表示保留時(shí)間(min)，縱坐標(biāo)代表紫外吸收值(mAU))
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。下述的序列均可人工合成。實(shí)施例1、利用T7啟動(dòng)子的乙?；D(zhuǎn)移酶rimL和胸腺素α原共表達(dá)的重組菌采用Red重組技術(shù)，將帶有乳糖操縱子的T7啟動(dòng)子(來(lái)源于PET22b質(zhì)粒，該質(zhì)粒購(gòu)自Novagen公司)插入到大腸桿菌BL21 (DE3)的N-乙?；D(zhuǎn)移酶rimL基因開放閱讀框 (ORF)的上游，該菌基因組中帶有的受乳糖啟動(dòng)子控制的T7RNA聚合酶基因。當(dāng)培養(yǎng)基中加入乳糖或其類似物，如IPTG時(shí)，乳糖啟動(dòng)子控制的T7RNA聚合酶基因表達(dá)，合成的T7RNA聚合酶與人為插入到rimL基因開放閱讀框(ORF)的上游的T7啟動(dòng)子結(jié)合，同時(shí)T7啟動(dòng)子下游的乳糖操縱子去阻遏，控制N-乙?；D(zhuǎn)移酶rimL基因的高效轉(zhuǎn)錄，從而實(shí)現(xiàn)N-乙?；D(zhuǎn)移酶rimL的過(guò)表達(dá)。具體方法包括一、兩端帶有rimLORF上游同源臂和ORF起始區(qū)同源臂及FRT位點(diǎn)的氯霉素抗性基因的擴(kuò)增1、氯霉素抗性基因的PCR擴(kuò)增。合成引物5Cm AgCgATTgTgTAggCTggAg3Cm TAATTAACggCTgACATgggAATTAg提取BW25141/pKD3 (購(gòu)自耶魯大學(xué)的CGSC，CGSC#7631)的質(zhì)粒pKD3為模板，以 5Cm和3Cm為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到105^pPCR產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序?yàn)樾蛄?的自5’末端第 41-1095位核苷酸，將該P(yáng)CR產(chǎn)物命名為Cm。2、帶有乳糖操縱子的T7啟動(dòng)子DNA片斷的PCR擴(kuò)增合成引物3Cm5T7 cTAATTcccATGTcAGccGTTAATTAtcgagatctcgatcccgcga3T7catatgtatatctccttcttaaag其中3Cm5T7引物帶有氯霉素抗性基因3’序列和T7啟動(dòng)子的5’序列。以PET2^質(zhì)粒為模板，以3T7和3Cm5T7為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的HObpPCR 產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)測(cè)序，其中T7啟動(dòng)子為序列表中序列5的第1119-1135位核苷酸，將該P(yáng)CR產(chǎn)物命名為T7。3、帶有rimLORF上游同源臂和ORF起始區(qū)同源臂的Red重組用DNA的PCR擴(kuò)增合成引物
5rimLCm AGCCAGGCGGCTTTTTTAACAACTGCATGGATTGACTGGAAgCgATTgTgTAggCTggArimL0RF5pt7 GTMTTCMGTGATTCGCTTACTTTTATCGTTTCAGTCATatgtatatctccttctta其中5rimLCm含有rimLORF上游同源臂(劃線部分)和氯霉素抗性基因5’序列， rimL0RF5pt7為rimLORF起始區(qū)同源臂(劃線部分)和T7啟動(dòng)子5’序列的反向互補(bǔ)序列。以上述獲得的制備的DNA片段Cm和DNA片段T7各Iul為模板，以5rimLCm和 rimL0RF5pt7為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到lM6bpPCR產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)測(cè)序，核苷酸序列為序列5， 命名為Red重組DNAl，結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。因擴(kuò)增的DNA片段中可能混有質(zhì)粒PKD3，可能造成假陽(yáng)性現(xiàn)象，所以將回收的DNA 片段用Dpn I 37°C恒溫水浴處理lh，以消除質(zhì)粒pKD3。4、同源重組陽(yáng)性克隆BL21 (DE3) /T7rimL的獲得1)大腸桿菌 BL21 (DE3) /pKD46 的制備將pKD46 質(zhì)粒(genbank AY048746，其構(gòu)建方法見 Datsenko KA，PNAS USA2000, 97(12) :6640-5，也可從各種保藏中心獲得，如耶魯大學(xué)的CGSC，該中心的帶有pKD46質(zhì)粒的大腸桿菌BW25141/pKD46的保藏號(hào)為7634?？拱逼S青霉素。該質(zhì)粒含有RED重組酶。) 轉(zhuǎn)化BL21(DE3)(購(gòu)自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)CD601)涂布含氨芐青霉素的LB平板，30°C過(guò)夜培養(yǎng)，次日挑取單克隆，提取質(zhì)粒，送去測(cè)序即為pKD46質(zhì)粒， 將含有該質(zhì)粒的重組菌命名為BL21 (DE!3)/pKD46。2)兩端帶有rimLORF上游同源臂和ORF起始區(qū)同源臂及FRT位點(diǎn)的氯霉素抗性基因的DNA片段的電轉(zhuǎn)化將上述獲得的BL21 (DE3) /pKD46接種于LB培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)至OD6tltlnm約為0. 2， 加入終濃度為0. 2 %的L-阿拉伯糖(L-ara)誘導(dǎo)約Ih (OD600nm小于0. 6)，將細(xì)胞置冰中迅速冷卻lOmin，以4000rpm于4°C離心lOmin，用冰冷的10%甘油將細(xì)胞洗三次，最后將細(xì)胞用冰冷的10%甘油濃縮至原菌液體積的1/200，100 μ 1/管分裝，-70°C保存?zhèn)溆?。?00 μ L感受態(tài)細(xì)胞加入0. 2-1 μ g上述制備的Red重組DNA，混勻后轉(zhuǎn)至0. Icm電擊杯中，用Bio-Iab 電擊儀作電擊轉(zhuǎn)化。電擊后立即加入600 μ 1 LB培養(yǎng)基，150rpm，30°C培養(yǎng)lh，涂布含氯霉素(Cm)的LB平板，37°C過(guò)夜培養(yǎng)，pKD46在37°C培養(yǎng)過(guò)程中不穩(wěn)定，可自發(fā)丟失，次日挑取單克隆，并再在含氯霉素(Cm)的LB平板上劃線培養(yǎng)分離單菌落，即為獲得Red重組DNAl 的單克隆。將獲得Red重組DNAl的單克隆分別接種含氯霉素(Cm)的LB平板和含氨芐青霉素(Amp)的LB平板，37°C過(guò)夜培養(yǎng)，能在Cm平板上生長(zhǎng)，但不能在Amp平板生長(zhǎng)的即為丟失PKD46質(zhì)粒的克隆。提取丟失pKD46質(zhì)粒的克隆的質(zhì)粒，用合成的鑒定引物5rimLPout和3rimLpout 進(jìn)行PCR鑒定，5rimLPout GCGTCAAAGAGGTGTAAACT3rimLpout GATAAAGAGGTTTGACGTGA將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分析，得到1Kb的為帶有Cm基因的T7啟動(dòng)子插入大腸桿菌rimL基因ORF上游的陽(yáng)性質(zhì)粒，得到IOObp的為陰性克隆不含有Cm基因的T7啟動(dòng)子，將含有陽(yáng)性質(zhì)粒的克隆命名為BL21 (DE3) /T7rimL。5、重組菌 BL21 (DE3)/T7rimL 表達(dá) rimL
將BL21(DE3)/T7rimL用濃度為ImM的IPTG (異丙基-D-硫代半乳糖苷，購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)誘導(dǎo)(37°c培養(yǎng)培養(yǎng)池后，誘導(dǎo)他)，收集上清，進(jìn)行 SDS-PAGE電泳，得到20KD的片段，說(shuō)明表達(dá)出rimL。二、利用插入基因組中的T7啟動(dòng)子構(gòu)建含有表達(dá)N-乙?；叵偎卅猎?Thr13) 的重組菌pBV220-proT α (Thr13)按照如下方法制備將ProT α (Thr13)基因(一種胸腺素 α，其核苷酸序列為序列4，其氨基酸序列為序列幻插入pBV220載體(購(gòu)自上海閃晶分子生物科技有限公司。)的BamHI和EcoRI位點(diǎn)，得到的載體，proT α基因由pBV220載體上的PJ3k啟動(dòng)子控制。將上述獲得的質(zhì)粒pBV220-proTa (Thr13)電擊轉(zhuǎn)化入上述一得到的BL21 (DE3)/ T7rimL中，得到轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)測(cè)序，為pBV220-prOT a (Thr13)，將含有該質(zhì)粒的菌命名為 BL21 (DE3) (T7rimL/proT a (Thr13))。用同樣方法，將pBV220-proT a (Thr13)電擊轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)中，得到轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，結(jié)果為pBV220-proT a (Thr13)，將含有該質(zhì)粒的菌命名為BL21 (DE3) (proT a (Thr13))。實(shí)施例2、BL21 (DE3) (T7rimL/proT a (Thr13))制備 N-乙?；叵偎?α 原1、蛋白粗提液將BL21 (DE3) (T7rimL/proT a (Thr13))和對(duì)照菌 BL21 (DE3) (proT a (Thr13))分別接種于50ml LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)過(guò)夜，然后轉(zhuǎn)接至含500ml培養(yǎng)基(酵母抽提物10g/L，胰蛋白胨10g/L，磷酸二氫鈉20mM，磷酸氫二鈉30mM)的3L搖瓶中，37 °C培養(yǎng)培養(yǎng) 2h后，加入1. 25ml 0. 2mol/L的IPTG (0. 5mM)誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)6h，發(fā)酵液離心，收集菌體。將收集的菌體用水重懸(每克菌加IOml水)，超聲波破壁，離心收集上清，在上清液中加入冰乙酸調(diào)節(jié)PH至4. 5，靜置30分鐘，離心收集上清液，即為蛋白粗提液。2、純化1)SP FFOl. 6 X 20cm柱純化(陽(yáng)離子交換層析)將上述獲得的上清液(蛋白粗提液)用SP FFcm.6X20cm柱(介質(zhì)購(gòu)自美國(guó)GE 公司，空柱購(gòu)自華美實(shí)驗(yàn)儀器廠)進(jìn)行純化。具體條件為A液QOmM乙酸鈉和乙酸組成的緩沖液，PH4. 5)，B液(A液+IM NaCl)，SP FF柱先用A液平衡，然后從A通道將上述含有 N-乙?；叵偎卅恋拇痔嵋荷蠘又罶P FF柱中，再用A液洗去未結(jié)合的蛋白，最后在0 — 30 分鐘Α從100%— 0% ;Β從100%線性梯度洗脫，分段收集洗脫液。將收集到的各級(jí)份洗脫液取樣作SDS-PAGE分析和HPLC分析，合并含胸腺素α原的洗脫液(30% -60% B洗脫液中)，獲得N-乙?；叵偎卅猎拇种破?。2) RP-HPLC 層析取樣進(jìn)行RP-HPLC層析，采用ΗΡ1090高壓液相色譜儀，C18柱6 X 250mm，中科院大連化學(xué)物理所)，A液為含0. 1%TFA(體積百分含量)的純水；B液為含0. 1%TFA(體積百分含量)的色譜純乙腈，梯度洗脫0min，A 100%, B 0% ；5min，A 82%,B18% ；25min A 78%, B 22% ；28min A0%, B 100% ；30min A0%, B 100% ；31min A 100%, B0%, 214nm 紫外檢測(cè)，流速為lmL/min，分別收集保留時(shí)間為9. 9min的洗脫液，得到A峰樣品，收集保留時(shí)間為10. Imin的洗脫液，得到B峰樣品。
作圖如圖2所示，圖左對(duì)照菌BL21 (DE3) (proT α (Thr13))制備的胸腺素α原 (Thr13)；圖右:BL21(DE3) (T7rimL/proT α (Thr13))制備的胸腺素 α 原(Thr13)。分別將對(duì)照菌和實(shí)驗(yàn)菌收集的A峰樣品和B峰樣品分別用質(zhì)譜檢測(cè)，方法 Wu J, Chang S, Gong X, Liu D, Ma二Q. Identification of N-terminal acetylation of recombinant human prothymosin alpha in Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 2006 ； 1760 (8) :1241-7.，質(zhì)譜測(cè)定A、B兩個(gè)組分之間分子量相差42Da，B組分的分子量比A組分大42 (乙酰基的分子量)。質(zhì)量肽譜確定這種分子量的增加發(fā)生在N-端肽段， 用串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)該肽段進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)該肽段為N-端乙?；揎椀男叵偎卅猎璑-端肽段，發(fā)現(xiàn)乙?；揎棸l(fā)生在N端第一個(gè)氨基酸——絲氨酸殘基上。上述結(jié)果表明，峰A樣品為非乙?；揎椀男叵偎卅猎?，峰B樣品為乙?；揎椀男叵偎卅猎？梢钥闯觯珹峰樣品為非乙?；叵偎卅猎?Thr13) ；B峰樣品為N-乙?；叵偎?α原(Thr13)，結(jié)合圖2所示，從圖中可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)照菌BL21(DE3) (proT α (Thr13))制備的胸腺素α中N-乙酰化胸腺素α為41% (B峰)，而BL21 (DE3) (T7rimL/proT α (Thr13))制備的胸腺素α中N-乙酰化胸腺素α為82% (B峰)，這種N-乙?；揎椔实奶岣?，為提高產(chǎn)率提供了基礎(chǔ)，因此具有良好的應(yīng)用前景。實(shí)施例3、利用Τ7啟動(dòng)子的乙酰基轉(zhuǎn)移酶rimj和胸腺素α原共表達(dá)的重組菌本實(shí)施例與實(shí)施例1方法類似，也采用Red重組技術(shù)，將帶有乳糖操縱子的T7啟動(dòng)子(來(lái)源于PET22b質(zhì)粒，該質(zhì)粒購(gòu)自Novagen公司)插入到大腸桿菌BL21 (DE3)的N-乙?；D(zhuǎn)移酶rimj基因開放閱讀框(ORF)的上游，該菌基因組中帶有的受乳糖啟動(dòng)子控制的 T7RNA聚合酶基因。當(dāng)培養(yǎng)基中加入乳糖或其類似物，如IPTG時(shí)，乳糖啟動(dòng)子控制的T7RNA 聚合酶基因表達(dá)，合成的T7RNA聚合酶與人為插入到rimj基因開放閱讀框(ORF)的上游的 T7啟動(dòng)子結(jié)合，同時(shí)T7啟動(dòng)子下游的乳糖操縱子去阻遏，控制N-乙?；D(zhuǎn)移酶rimj基因的高效轉(zhuǎn)錄，從而實(shí)現(xiàn)N-乙?；D(zhuǎn)移酶rimj的過(guò)表達(dá)。具體方法包括一、兩端帶有rimJORF上游同源臂和ORF起始區(qū)同源臂及FRT位點(diǎn)的氯霉素抗性基因的擴(kuò)增1、氯霉素抗性基因的PCR擴(kuò)增，與實(shí)施例1中一的1相同，得到1055bp Cm，測(cè)序?yàn)樾蛄?的自5，末端第41-1095位核苷酸；2、帶有乳糖操縱子的T7啟動(dòng)子DNA片斷的PCR擴(kuò)增，與實(shí)施例1中一的2相同， 得到140bp含T7啟動(dòng)子的片段，測(cè)序，T7啟動(dòng)子為序列6的自5’末端第1118-1138位核
苷酸；3、帶有rimj ORF上游同源臂和ORF起始區(qū)同源臂的Red重組用DNA的PCR擴(kuò)增合成引物5rimJPcat CATTTTGGACTTTTCACAGGGTCTGGTTGCGCAGGTATAGArCrATTrTrTArrCTrrA3rimJPcat GTTAAGCGCACTTTTGGCACGTTACTGCGATAGCCAAACATatRtatatctccttctta其中5rimJPCat含有rimJORF上游同源臂(劃線部分)和氯霉素抗性基因5’序列，3rimJPcat為rimJORF起始區(qū)同源臂(劃線部分)和T7啟動(dòng)子5’序列的反向互補(bǔ)序列。以上述制備的DNA片段Cm和DNA片段T7各Iul為模板，5rimJPcat和3rimJPcat為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1247bpPCR產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)測(cè)序，核苷酸序列為序列6，命名為Red重組DNA2，結(jié)構(gòu)圖如圖3所示。4、同源重組陽(yáng)性克隆BL21 (DE3)/T7rimJ的獲得將pKD46 質(zhì)粒(genbank AY048746，其構(gòu)建方法見 Datsenko KA，PNAS USA2000, 97(12) :6640-5，也可從各種保藏中心獲得，如耶魯大學(xué)的CGSC，該中心的帶有pKD46質(zhì)粒的大腸桿菌BW25141/pKD46的保藏號(hào)為7634。抗氨芐青霉素。)轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)(購(gòu)自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司)涂布含氨芐青霉素的LB平板，30°C過(guò)夜培養(yǎng)，次日挑取單克隆，提取質(zhì)粒，送去測(cè)序即為PKD46質(zhì)粒，將含有該質(zhì)粒的重組菌命名為BL21 (DE3)/ pKD46。2)兩端帶有rimJORF上游同源臂和ORF起始區(qū)同源臂及FRT位點(diǎn)的氯霉素抗性基因的DNA片段的電轉(zhuǎn)化將上述獲得的BL21 (DE3) /pKD46接種于LB培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)至OD6tltlnm約為0. 2， 加入終濃度為0. 2 %的L-阿拉伯糖(L-ara)誘導(dǎo)約Ih (OD600nm小于0. 6)，將細(xì)胞置冰中迅速冷卻lOmin，以4000rpm于4°C離心lOmin，用冰冷的10%甘油將細(xì)胞洗三次，最后將細(xì)胞用冰冷的10%甘油濃縮至原菌液體積的1/200，100 μ 1/管分裝，-70°C保存?zhèn)溆?。?00 μ L感受態(tài)細(xì)胞加入0. 2-1 μ g上述制備的Red重組DNA2，混勻后轉(zhuǎn)至0. Icm電擊杯中，用Bio-Iab 電擊儀作電擊轉(zhuǎn)化。電擊后立即加入600 μ 1 LB培養(yǎng)基，150rpm，30°C培養(yǎng)lh，涂布含氯霉素(Cm)的LB平板，37°C過(guò)夜培養(yǎng)，pKD46在37°C培養(yǎng)過(guò)程中不穩(wěn)定，可自發(fā)丟失，次日挑取單克隆，并再在含氯霉素(Cm)的LB平板上劃線培養(yǎng)分離單菌落，即為獲得Red重組DNA2 的單克隆。將獲得Red重組DNA2的單克降分別接種含氯霉素(Cm)的LB平板和含氨芐青霉素(Amp)的LB平板，37°C過(guò)夜培養(yǎng)，能在Cm平板上生長(zhǎng)，但不能在Amp平板生長(zhǎng)的即為丟失PKD46質(zhì)粒的克隆。提取丟失pKD46質(zhì)粒的克隆的質(zhì)粒，用合成的鑒定引物5rimJPout和3rimJpout 進(jìn)行PCR鑒定，5rimJPout ACGTCGCTTTGATAGAGAG3rimJpout ACCAGACGCACGACCAGT經(jīng)瓊脂糖電泳分析，得到1Kb的為帶有Cm基因的T7啟動(dòng)子插入大腸桿菌rimj 基因ORF上游的陽(yáng)性質(zhì)粒，得到IOObp的為陰性克隆不含有Cm基因的T7啟動(dòng)子，將含有陽(yáng)性質(zhì)粒的克隆命名為BL21 (DE3)/T7rimJ。5、重組菌 BL21 (DE3) /T7rimJ 表達(dá) rimj與實(shí)施例1的一的5方法相同，得到18KD的片段，證明表達(dá)出rimj。二、利用插入基因組中的T7啟動(dòng)子構(gòu)建含有表達(dá)N-乙酰化胸腺素α原(Thr13) 的重組菌與實(shí)施例1 的二相同，不同的是將 pBV220-proTa (Thr13)轉(zhuǎn)入 BL21 (DE3)/T7rimJ 中，得到 BL21 (DE3) (T7rimJ/proT a (Thr13))。用同樣方法，將pBV220-proT a (Thr13)電擊轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)中，得到轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，結(jié)果為pBV220-proT a (Thr13)，將含有該質(zhì)粒的菌命名為BL21 (DE3) (proT a (Thr13))。
實(shí)施例4、BL21 (DE3) (T7rimJ/proT α (Thr13))制備 N-乙?；叵偎?α 原1、蛋白粗提液，與實(shí)施例3方法相同；2、純化1)SP FFOl. 6X20cm柱純化，與實(shí)施例3方法相同;2) RP-HPLC層析，與實(shí)施例3方法相同；分別收集保留時(shí)間為9. 9min的洗脫液，得到A峰樣品，收集保留時(shí)間為10. Imin的洗脫液，得到B峰樣品。作圖如圖4所示，圖左對(duì)照菌BL21 (DE3) (proT α (Thr13))制備的胸腺素α原 (Thr13)；圖右:BL21(DE3) (T7rimJ/proT α (Thr13))制備的胸腺素 α 原(Thr13)。分別將對(duì)照菌和實(shí)驗(yàn)菌收集的A峰樣品和B峰樣品分別用質(zhì)譜檢測(cè)，方法 Wu J, Chang S, Gong X, Liu D, Ma二Q. Identification of N-terminal acetylation of recombinant human prothymosin alpha in Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 2006 ； 1760 (8) :1241-7.，質(zhì)譜測(cè)定A、B兩個(gè)組分之間分子量相差42Da，B組分的分子量比A組分大42 (乙?；姆肿恿?。質(zhì)量肽譜確定這種分子量的增加發(fā)生在N-端肽段， 用串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)該肽段進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)該肽段為N-端乙酰化修飾的胸腺素α原N-端肽段，發(fā)現(xiàn)乙酰化修飾發(fā)生在N端第一個(gè)氨基酸——絲氨酸殘基上。上述結(jié)果表明，峰A樣品為非乙?；揎椀男叵偎卅猎?，峰B樣品為乙?；揎椀男叵偎卅猎??？梢钥闯觯珹峰樣品為非乙?；叵偎卅猎?Thr13) ；B峰樣品為N-乙?；叵偎?α原(Thr13)，結(jié)合圖4所示，從圖中可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)照菌BL21(DE3) (proT α (Thr13))制備的胸腺素α中N-乙?；叵偎卅翞?0% (B峰)，而BL21 (DE3) (T7rimJ/proT α (Thr13))制備的胸腺素α中N-乙?；叵偎卅翞?2% (B峰)，這種N-乙?；揎椔实奶岣?，為提高產(chǎn)率提供了基礎(chǔ)，因此具有良好的應(yīng)用前景。實(shí)施例5、利用PUR啟動(dòng)子的乙?；D(zhuǎn)移酶rimj和胸腺素α原共表達(dá)的重組菌本實(shí)施例與實(shí)施例1方法類似，也采用Red重組技術(shù)，將帶有Ι\ΡΚ啟動(dòng)子(來(lái)源于PBV220質(zhì)粒，購(gòu)自上海閃晶分子生物科技有限公司公司)插入到大腸桿菌BL21(DE3)的 N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶rimj基因開放閱讀框(ORF)的上游。當(dāng)培養(yǎng)基溫度上升至42°C時(shí)，PlPe 啟動(dòng)子控制N-乙?；D(zhuǎn)移酶rimj基因的高效轉(zhuǎn)錄，從而實(shí)現(xiàn)N-乙?；D(zhuǎn)移酶rimj的過(guò)表達(dá)。具體方法包括一、兩端帶有rimJORF上游同源臂和ORF起始區(qū)同源臂及FRT位點(diǎn)的氯霉素抗性基因的擴(kuò)增1、氯霉素抗性基因的PCR擴(kuò)增，與實(shí)施例1中一的1相同，得到1055bp Cm，序列9 的自5，末端第41-1095位核苷酸；2、啟動(dòng)子DNA片斷的PCR擴(kuò)增，方法與實(shí)施例1中一的2相同，合成引物3Cm5PLCTAATTCCCATGTCAGCCGTTAATTAAGAGCGCCCTTATCTTTCCCTTTAT3PL CCTCCTTAATTTTTAACCAATGCTT以PET22b質(zhì)粒為模板，以3PL和3Cm5PL為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的PCR產(chǎn)物， 經(jīng)過(guò)測(cè)序，為1342bp，經(jīng)測(cè)序啟動(dòng)子為序列9的自5，末端第2100-M11位核苷酸，將該P(yáng)CR產(chǎn)物命名為PJV3、帶有rimj ORF上游同源臂和ORF起始區(qū)同源臂的Red重組用DNA的PCR擴(kuò)增合成引物5rimJPcat CATTTTGGACTTTTCACAGGGTCTGGTTGCGCAGGTATAGAgCgATTgTgTAggCTggA3rimJPcat GTTAAGCGCACTTTTGGCACGTTACTGCGATAGCCAAACATcctccttaatttttaacc aatgctt其中5rimJPcat含有rimJORF上游同源臂(劃線部分)和氯霉素抗性基因5’序列，3rimJPcat為rimJORF起始區(qū)同源臂(劃線部分)和PJ3k啟動(dòng)子5’序列的反向互補(bǔ)序列。以上述制備的DNA片段Cm和DNA片段PlPk各Iul為模板，5rimJPcat和3rimJPcat 為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到M52bpPCR產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)測(cè)序，核苷酸序列為序列7，命名為Red重組DNA3，結(jié)構(gòu)圖如圖5所示。4、同源重組陽(yáng)性克隆BL21 (DE3)/PLPErimJ的獲得將pKD46 質(zhì)粒(genbank AY048746，其構(gòu)建方法見 Datsenko KA，PNAS USA2000, 97(12) :6640-5，也可從各種保藏中心獲得，如耶魯大學(xué)的CGSC，該中心的帶有pKD46質(zhì)粒的大腸桿菌BW25141/pKD46的保藏號(hào)為7634?？拱逼S青霉素。)轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)(購(gòu)自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司)涂布含氨芐青霉素的LB平板，30°C過(guò)夜培養(yǎng)，次日挑取單克隆，提取質(zhì)粒，送去測(cè)序即為PKD46質(zhì)粒，將含有該質(zhì)粒的重組菌命名為BL21 (DE3)/ pKD46。2)兩端帶有rimJORF上游同源臂和ORF起始區(qū)同源臂及FRT位點(diǎn)的氯霉素抗性基因的DNA片段的電轉(zhuǎn)化將上述獲得的BL21 (DE3) /pKD46接種于LB培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)至OD6tltlnm約為0. 2， 加入終濃度為0. 2 %的L-阿拉伯糖(L-ara)誘導(dǎo)約Ih (OD600nm小于0. 6)，將細(xì)胞置冰中迅速冷卻lOmin，以4000rpm于4°C離心lOmin，用冰冷的10%甘油將細(xì)胞洗三次，最后將細(xì)胞用冰冷的10%甘油濃縮至原菌液體積的1/200，100 μ 1/管分裝，-70°C保存?zhèn)溆谩Ｃ?00 μ L感受態(tài)細(xì)胞加入0. 2-1 μ g上述制備的Red重組DNA3，混勻后轉(zhuǎn)至0. Icm電擊杯中，用Bio-Iab 電擊儀作電擊轉(zhuǎn)化。電擊后立即加入600 μ 1 LB培養(yǎng)基，150rpm，30°C培養(yǎng)lh，涂布含氯霉素(Cm)的LB平板，37°C過(guò)夜培養(yǎng)，pKD46在37°C培養(yǎng)過(guò)程中不穩(wěn)定，可自發(fā)丟失，次日挑取單克隆，并再在含氯霉素(Cm)的LB平板上劃線培養(yǎng)分離單菌落，即為獲得Red重組DNA3 的單克隆。將獲得Red重組DNA3的單克隆分別接種含氯霉素(Cm)的LB平板和含氨芐青霉素(Amp)的LB平板，37°C過(guò)夜培養(yǎng)，能在Cm平板上生長(zhǎng)，但不能在Amp平板生長(zhǎng)的即為丟失PKD46質(zhì)粒的克隆。提取丟失pKD46質(zhì)粒的克隆的質(zhì)粒，用合成的鑒定引物5rimJPout和3rimJpout 進(jìn)行PCR鑒定，5rimJPout ACGTCGCTTTGATAGAGAG3rimJpout ACCAGACGCACGACCAGT經(jīng)瓊脂糖電泳分析，得到2Kb的為帶有Cm基因的I\PK啟動(dòng)子插入大腸桿菌 rimj基因ORF上游的陽(yáng)性質(zhì)粒，得到11Λ的為陰性克隆不含有Cm基因的啟動(dòng)子，將含有陽(yáng)性質(zhì)粒的克隆命名為BL21 (DE3)/PLPKrimJ。5、重組菌 BL21 (DE3) /PLrimJ 表達(dá) rimj與實(shí)施例1的一的5方法相同，得到20KD的片段，證明表達(dá)出rimj。二、利用插入基因組中的I\PK啟動(dòng)子構(gòu)建含有表達(dá)N-乙?；叵偎卅猎?Thr13) 的重組菌與實(shí)施例1的二相同，不同的是將pBV220_proT α (Thr13)轉(zhuǎn)入BL21 (DE3) / PLPErimJ 中，得到 BL21 (DE3) (PLPErimJ/proT α (Thr13))。用同樣方法，將pBV220-proT α (Thr13)電擊轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)中，得到轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，結(jié)果為pBV220-proT α (Thr13)，將含有該質(zhì)粒的菌命名為BL21 (DE3) (proT α (Thr13))。實(shí)施例6、BL21 (DE3) (T7rimJ/proT α (Thr13))制備 N-乙?；叵偎?α1、蛋白粗提液，與實(shí)施例3方法相同；2、純化1)SP FFOl. 6X20cm柱純化，與實(shí)施例3方法相同;2) RP-HPLC層析，與實(shí)施例3方法相同；分別收集保留時(shí)間為9. 9min的洗脫液，得到A峰樣品，收集保留時(shí)間為10. Imin的洗脫液，得到B峰樣品。作圖如圖6所示，圖左對(duì)照菌BL21(DE3)(proTa (Thr13))制備的胸腺素α原 (Thr13)；圖右:BL21(DE3) (PLPErimJ/proT α (Thr13))制備的胸腺素 α 原(Thr13)。分別將對(duì)照菌和實(shí)驗(yàn)菌收集的A峰樣品和B峰樣品分別用質(zhì)譜檢測(cè)，方法 Wu J, Chang S, Gong X, Liu D, Ma^Q. Identification of N-terminal acetylation of recombinant human prothymosin alpha in Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 2006 ； 1760 (8) :1241-7.，質(zhì)譜測(cè)定A、B兩個(gè)組分之間分子量相差42Da，B組分的分子量比A組分大42 (乙酰基的分子量)。質(zhì)量肽譜確定這種分子量的增加發(fā)生在N-端肽段， 用串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)該肽段進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)該肽段為N-端乙?；揎椀男叵偎卅猎璑-端肽段，發(fā)現(xiàn)乙?；揎棸l(fā)生在N端第一個(gè)氨基酸——絲氨酸殘基上。上述結(jié)果表明，峰A樣品為非乙?；揎椀男叵偎卅猎?，峰B樣品為乙酰化修飾的胸腺素α原?？梢钥闯?，A峰樣品為非乙?；叵偎卅猎?Thr13) ；B峰樣品為N-乙?；叵偎?α原(Thr13)，結(jié)合圖6所示，從圖中可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)照菌BL21(DE3) (proT α (Thr13))制備的胸腺素 α 中 N-乙?；叵偎?α 為 40% (B 峰)，而 BL21 (DE3) (PLPErimJ/proT α (Thr13))制備的胸腺素α中N-乙?；叵偎卅翞?8% (B峰)，這種N-乙?；揎椔实奶岣撸瑸樘岣弋a(chǎn)率提供了基礎(chǔ)，因此具有良好的應(yīng)用前景。實(shí)施例7、用BL 21 (DE3) /T7rimJ制備各種N-乙?；叵偎卅敛捎脤?shí)施例3的方法制備分別表達(dá)下述表1中的各種胸腺素α (各種胸腺素α 的氨基酸序列如下表1所示，這些氨基酸序列與序列表中的序列3的N端觀個(gè)氨基酸相同或者同源性在90%以上。)的重組菌，采用實(shí)施例4的方法進(jìn)行發(fā)酵和檢測(cè)，結(jié)果如下表1 所示表1制備各種N-乙?；叵偎卅恋囊阴；手亟M菌名稱胸腺索α名稱胸腺索α氨基酸序列氨基酸數(shù)目N-乙?；叵偎卅猎瑽L21(DE3) (T7rimJ/NproT )NproTSDAAVDTSSEITTKDLKEKKE WEEAEN GRD APANGNANEENGEQEADNE VDEEE EEGGEEEEEEEEGDGEEEDGDEDEEAES ATGKRAAEDDEDDDVDTKKQKTDEDD10982%BL21(DE3 (T7rimJ/ NproT(Ilel3))NproT(Ilel3)SDAAVDTSSEITIKDLKEKKE WEEAENG RD APANGNANEENGEQEADNE VDEEEE EGGEEEEEEEEGDGEEEDGDEDEEAESA TGKRAAEDDEDDDVDTKKQKTDEDD10983%BL21(DE3) (T7rimJ/NproT -C)NproT-CMSDAAVDTSSEITTKDLKEKKE WEEAE NGRD APANGNANEENGEQEADNE VDEE EEEGGEEEEEEEEGDGEEEDGDEDEEAE SATGKRAAEDDEDDDVD9986%BL21(DE3) (T7rimJ/NproT -G36A,G43A )NproT-G36A,G43AMSDAAVDTSSEITTKDLKEKKE WEEAE NGRD APANANANEENAEQEADNE VDEE EEEGGEEEEEEEEGDGEEEDGDEDEEAE SATGKRAAEDDEDDDVDTKKQKTDEDD.10984%BL21(DE3) (T7rimJ/NproT G36A,G43A-C)NproT G36A,G43A-CMSDAAVDTSSEITTKDLKEKKE WEEAE NGRD APANANANEENAEQEADNE VDEE EEEGGEEEEEEEEGDGEEEDGDEDEEAE SATGKRAAEDDEDDD VD.9986% 從上表中可以看出，按照實(shí)施例3的方法制備的重組菌經(jīng)過(guò)發(fā)酵均能獲得含量高的N-乙?；叵偎卅?。
權(quán)利要求
1.一種重組菌，為將胸腺素α的編碼基因?qū)胫亟M菌A中得到的重組菌；所述胸腺素α為一種多肽或蛋白，其N末端的觀個(gè)氨基酸殘基與序列表中序列3的 N末端的觀個(gè)氨基酸相同或其N末端的觀個(gè)氨基酸殘基與序列表中序列3的N末端的觀個(gè)氨基酸至少具有90%同源性；所述重組菌A為將外源誘導(dǎo)型啟動(dòng)子插入宿主菌的乙?；D(zhuǎn)移酶編碼基因的上游，用于啟動(dòng)所述乙?；D(zhuǎn)移酶編碼基因的表達(dá)，得到的重組菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組菌，其特征在于所述胸腺素α的編碼基因通過(guò)重組載體導(dǎo)入所述的重組菌A;所述重組載體為將所述胸腺素α編碼基因插入表達(dá)載體中，得到表達(dá)胸腺素α的重組載體；所述的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子為乳糖啟動(dòng)子、阿拉伯糖啟動(dòng)子、堿性磷酸酯酶啟動(dòng)子、色氨酸啟動(dòng)子、噬菌體Τ7、ΡρΡκ啟動(dòng)子或含有這些啟動(dòng)子部分元件的雜合啟動(dòng)子Tac、PJ\ ；所述乙酰基轉(zhuǎn)移酶為RimL或RimJ，所述RimL為如下(a)、(b)或(c)所示的蛋白(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(c)與a)或b)限定的氨基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白；所述RimJ為如下(d)、(e)或(f)所示的蛋白(d)由序列表中序列8所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(e)將序列表中序列8所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(f)與d)或e)限定的氨基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組菌，其特征在于所述胸腺素α編碼基因?yàn)橐环N多核苷酸，其核苷酸序列為序列表中的序列4或與序列表中的序列4的5’末端起84位核苷酸相同或者與序列表中的序列4的5’末端起84位核苷酸同源性至少具有90%的DNA分子；所述表達(dá)載體優(yōu)選為PBV220或pET22b ；所述宿主菌為大腸桿菌；所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子為噬菌體T7啟動(dòng)子或啟動(dòng)子，所述噬菌體T7啟動(dòng)子的核苷酸序列為序列表中序列5的自5’末端第1119-1135位核苷酸或序列表中序列6的自5’末端第1119-1135位核苷酸；所述動(dòng)子的核苷酸序列為序列表中序列9的自5’末端第 2100-2411位核苷酸。
4.一種重組菌，為將外源誘導(dǎo)型啟動(dòng)子插入宿主菌的乙酰基轉(zhuǎn)移酶編碼基因的上游， 用于啟動(dòng)所述乙酰基轉(zhuǎn)移酶編碼基因的表達(dá)，得到的重組菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組菌，其特征在于所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子為乳糖啟動(dòng)子、阿拉伯糖啟動(dòng)子、堿性磷酸酯酶啟動(dòng)子、色氨酸啟動(dòng)子、噬菌體17、&、&啟動(dòng)子或含有這些啟動(dòng)子部分元件的雜合啟動(dòng)子Tac、PJV
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的重組菌，其特征在于所述宿主菌為大腸桿菌；所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子為噬菌體T7啟動(dòng)子或啟動(dòng)子，所述噬菌體T7啟動(dòng)子的核苷酸序列為序列表中序列5的自5’末端第1119-1135位核苷酸或序列表中序列6的自5’末端第1119-1135位核苷酸；所述動(dòng)子的核苷酸序列為序列表中序列9的自5’末端第 2100-2411位核苷酸；所述乙?；D(zhuǎn)移酶為RimL或RimJ， 所述RimL為如下(a)、(b)或(c)所示的蛋白(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(c)與a)或b)限定的氨基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白； 所述RimJ為如下(d)、(e)或(f)所示的蛋白(d)由序列表中序列8所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(e)將序列表中序列8所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(f)與d)或e)限定的氨基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白。
7.權(quán)利要求1-6中任一所述的重組菌在制備N-乙酰化胸腺素α中的應(yīng)用。
8.一種制備N-乙酰化胸腺素α的方法，包括如下步驟發(fā)酵權(quán)利要求1-3中任一所述的重組菌，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到N-乙酰化胸腺素α。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于 所述發(fā)酵的溫度為42°C，所述發(fā)酵時(shí)間為12h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用異源啟動(dòng)子控制大腸桿菌基因組N-乙?；D(zhuǎn)移酶表達(dá)重組菌及應(yīng)用。本發(fā)明提供的重組菌，為將外源誘導(dǎo)型啟動(dòng)子插入宿主菌的乙?；D(zhuǎn)移酶編碼基因的上游，用于啟動(dòng)所述乙酰基轉(zhuǎn)移酶編碼基因的表達(dá)，得到的重組菌。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明構(gòu)建了N-乙?；D(zhuǎn)移酶和胸腺素α的編碼基因進(jìn)行共表達(dá)得到的重組菌，發(fā)酵該重組菌，得到胸腺素α均大多為N-乙?；叵偎卅粒哂忻黠@的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102352337SQ20111022140
公開日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2011年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月3日
發(fā)明者劉波, 吳軍, 唱韶紅, 鞏新, 馬清鈞 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所