專利名稱：對磷酸氫二銨耐受的枯草芽孢桿菌的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，涉及一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的篩選馴化方法以及得到的枯草芽孢桿菌，是應(yīng)用于肥料中提高枯草芽孢桿菌對磷酸氫二銨的耐受性。
背景技術(shù)：
枯草芽孢桿菌，拉丁學名Bacillus subtilis，是芽孢桿菌屬的一種。單個細胞 0.7 0.8X2 3微米，著色均勻。無莢膜，周生鞭毛，能運動。革蘭氏陽性菌，芽孢0.6 0.9X1.0 1.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長時，常形成皺醭。需氧菌。在遺傳學研究中應(yīng)用廣泛，對此菌的嘌呤核苷酸的合成途徑與其調(diào)節(jié)機制研究較清楚。廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名?？莶菅挎邨U菌具有解磷作用，能夠提高磷的植物利用度，因此被應(yīng)用于肥料中。 例如CN101899405A公開的“枯草芽孢桿菌⑶及其在制備高效生物復(fù)合磷肥中的應(yīng)用”， CN101643710A公開的“一株枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用”，CN101200385A公開的“用側(cè)孢芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌制備復(fù)合微生物肥料”，上述文獻均涉及了枯草芽孢桿菌在肥料中的應(yīng)用。然而，由于枯草芽孢桿菌對鹽的耐受性較差，高濃度的鹽能夠抑制菌株。例如楊清香、曹衛(wèi)軍在《武漢大學學報(自然科學)》1998年02期“高滲環(huán)境對枯草芽孢桿菌和粘質(zhì)沙雷氏菌胞內(nèi)自由氨基酸庫含量和組成的影響”一文中，公開有枯草芽孢桿菌(93151和93215) 可耐受8%NaCl。因此，目前枯草芽孢桿菌均是用于生物有機肥，或低含鹽里的復(fù)合肥。這限制了枯草芽孢桿菌在肥料中的應(yīng)用。磷酸氫二銨，是一種能夠為植物提供氮和磷的常用化肥。因此，提供一種耐磷酸氨二銨的枯草芽孢桿菌，使其能夠與磷酸氫二銨合用，以利用枯草芽孢桿菌促進磷酸氫二銨肥效的發(fā)揮，成為肥料行業(yè)需要解決的技術(shù)問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于提供一種對磷酸氫二銨耐受的枯草芽孢桿菌的篩選方法。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種對磷酸氫二銨耐受的枯草芽孢桿菌的篩選方法， 包括如下過程(1)篩選將枯草芽孢桿菌CGMCC 1. 0769，以營養(yǎng)瓊脂為培養(yǎng)基，先進行試管斜面培養(yǎng)，然后再進行培養(yǎng)皿斜面劃線培養(yǎng)后篩選出典型的枯草芽孢桿菌的單菌落；將典型的枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)入營養(yǎng)瓊脂試管斜面，進行培養(yǎng)；(2)馴化在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基里增加磷酸氫二銨，制成磷酸氫二銨濃度不同的培養(yǎng)皿，把步驟(1)中最后培養(yǎng)得到的枯草芽孢桿菌先在磷酸氨二銨濃度較低的培養(yǎng)皿中劃線培養(yǎng)；將培養(yǎng)的單菌落轉(zhuǎn)移到試管斜面培養(yǎng)后作為菌種，再在下一個磷酸氫二銨濃度較高的培養(yǎng)皿中劃線培養(yǎng)，以此類推，逐步提高磷酸氫二銨濃度，篩選出能夠耐受較高濃度磷酸氫二銨的枯草芽孢桿菌。所述步驟O)中磷酸氫二銨質(zhì)量濃度可以分別為10%、15%、20%和25%。所述營養(yǎng)瓊脂組成為每IOOOml水用蛋白胨10克、牛肉粉3. 0克和氯化鈉5. 0克， PH 值為 7. 3 士 0. 1。各步驟中所述培養(yǎng)條件為恒溫培養(yǎng)箱中34°C 士0. 5°C培養(yǎng)3-5天。本發(fā)明的方法得到的枯草芽孢桿菌，通過篩選、馴化，在質(zhì)量濃度為20%的磷酸氫二銨營養(yǎng)瓊脂中生長良好，表明能夠耐受質(zhì)量濃度為20 %的磷酸氫二銨。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述，以助于理解本發(fā)明的內(nèi)容?？莶菅挎邨U菌subsp. subutilis來源，中科院微生物所的中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)購買，編號為1.0769。所用分離基礎(chǔ)培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基蛋白胨10克牛肉粉3.0克氯化鈉5.0克水1000mlpH 值7. 3 士 0.1篩選馴化方法(1)準備按照營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基標準配制好培養(yǎng)基，連同包好的培養(yǎng)皿、試管培養(yǎng)基、無菌水、玻璃刮刀、移液管等輔助器具，經(jīng)過高溫滅菌后待用。滅好菌的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒平板，試管培養(yǎng)基擺斜面，冷卻，備用。(2)復(fù)壯超凈工作臺開紫外燈滅菌30分鐘，實驗室甲醛熏蒸，準備工作做好后，吸0. 2毫升的無菌水加入凍干管中，將枯草芽孢桿菌菌種干粉做成菌懸液，在火焰封口的狀態(tài)下倒入制備好的試管斜面上，將菌懸液平鋪在斜面培養(yǎng)基上，放入恒溫培養(yǎng)箱中 340C 士 0.5 °C，培養(yǎng)3-5天。鏡檢觀察形態(tài)，芽孢率。(3)篩選在菌種操作間，將超凈工作臺開紫外燈滅菌30分鐘，進行無菌操作，用接種針在培養(yǎng)好的試管斜面菌種挑起菌落，在準備好的培養(yǎng)皿中劃線，將劃好線的培養(yǎng)皿放入恒溫培養(yǎng)箱中34°C 士0. 5°C，培養(yǎng)3-5天，觀察是否有典型的枯草芽孢桿菌的單菌落形成。將典型的枯草芽孢桿菌的單菌落，轉(zhuǎn)入準備好的營養(yǎng)瓊脂試管斜面上，放入恒溫培養(yǎng)箱中;34°C 士0. 5°C，培養(yǎng)3-5天，待用。(4)馴化在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基里相應(yīng)增加磷酸氫二銨的濃度，按照質(zhì)量分數(shù)10%、 15^^20^^25%各個濃度，制備成培養(yǎng)皿；在培養(yǎng)好的營養(yǎng)瓊脂試管斜面上，挑菌種先在 10%磷酸氫二銨營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿內(nèi)劃線培養(yǎng)，然后以前一批次的單菌落存試管斜面，培養(yǎng)結(jié)束后，作為菌種在下一個濃度的培養(yǎng)皿中劃線培養(yǎng)，依次類推。根據(jù)實驗結(jié)果表明磷酸氫二銨的濃度(質(zhì)量分數(shù))在20%時，本菌株能生長良好，作為馴化后的菌種。(5)、檢測選取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基加入質(zhì)量分數(shù)為20%濃度的磷酸氫二銨，高壓滅菌后，用滅菌后的培養(yǎng)皿倒平板。劃線或者稀釋平板涂布，34°C 士0.5°C培養(yǎng)，3-5天生長出單菌落，表面經(jīng)過篩選馴化后的枯草芽孢桿菌能夠耐受20%濃度的磷酸氫二銨。
(6)生物學鑒定馴化后得到的能夠耐受20%濃度磷酸氫二銨的枯草芽孢桿菌，進行生物學鑒定， 鑒定結(jié)果菌株為革蘭氏陽性、兩端鈍圓的粗短桿菌，2 8 X 0. 7 1. 0 μ m，單個或短鏈，有動力，無莢膜，卵圓形芽孢近于菌體一端，大于菌體寬度。在普通瓊脂平板上極易生長，菌落不整齊、灰色、表面粗糙、干燥有皺紋，邊緣不呈卷發(fā)狀。在液體培養(yǎng)基表面形成較厚的具皺紋的菌膜。可分解甘露醇、阿拉伯糖及木糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。不產(chǎn)生卵磷脂酶。馴化前后對比將馴化前的菌株和馴化后的菌株分別接入液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，待95%以上芽孢形成下?lián)u床準備平板計數(shù)。結(jié)果如表1 表1馴化前后枯草芽孢桿菌存活情況
權(quán)利要求
1.一種對磷酸氫二銨耐受的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的篩選方法，其特征在于包括如下過程(1)篩選將枯草芽孢桿菌CGMCC1.0769，以營養(yǎng)瓊脂為培養(yǎng)基，先進行試管斜面培養(yǎng)，然后再進行培養(yǎng)皿斜面劃線培養(yǎng)后篩選出典型的枯草芽孢桿菌的單菌落；將典型的枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)入營養(yǎng)瓊脂試管斜面，進行培養(yǎng)；(2)馴化在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基里增加磷酸氫二銨，制成磷酸氫二銨濃度不同的培養(yǎng)皿， 把步驟(1)中最后培養(yǎng)得到的枯草芽孢桿菌先在磷酸氨二銨濃度較低的培養(yǎng)皿中劃線培養(yǎng)；將培養(yǎng)的單菌落轉(zhuǎn)移到試管斜面培養(yǎng)后作為菌種，再在下一個磷酸氫二銨濃度較高的培養(yǎng)皿中劃線培養(yǎng)，以此類推，逐步提高磷酸氫二銨濃度，篩選出能夠耐受較高濃度磷酸氫二銨的枯草芽孢桿菌。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟O)中磷酸氫二銨質(zhì)量濃度分別為 10%、15%、20%和 25% ο
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述營養(yǎng)瓊脂組成為每IOOOml水用蛋白胨10克、牛肉粉3. 0克和氯化鈉5. 0克，PH值為7. 3士0. 1。
4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于各步驟中所述培養(yǎng)條件為在恒溫培養(yǎng)箱中;34°C 士0. 5°C培養(yǎng)3-5天。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，涉及一種對磷酸氫二銨耐受的枯草芽孢桿菌的篩選方法，包括如下過程(1)篩選將CGMCC保藏的編號為1.0769的枯草芽孢桿菌，以營養(yǎng)瓊脂為培養(yǎng)基，先進行試管斜面培養(yǎng)，然后再進行培養(yǎng)皿斜面劃線培養(yǎng)后篩選出典型的枯草芽孢桿菌的單菌落；將典型的枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)入營養(yǎng)瓊脂試管斜面，進行培養(yǎng)；(2)馴化在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基里增加磷酸氫二銨，制成磷酸氫二銨濃度不同的培養(yǎng)皿，逐步提高磷酸氫二銨濃度進行篩選馴化培養(yǎng)，篩選出能夠耐受較高濃度磷酸氫二銨的枯草芽孢桿菌。得到能夠耐受質(zhì)量濃度為20％磷酸氫二銨的枯草芽孢桿菌，這種枯草芽孢桿菌可用于肥料。
文檔編號C12R1/125GK102344893SQ201110222039
公開日2012年2月8日 申請日期2011年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月4日
發(fā)明者馮作山, 尹川, 李寶成, 解麗娟 申請人:雙贏集團有限公司