專利名稱：一種檢測(cè)微量蛋白樣品的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物樣品的檢測(cè)，更具體地說，涉及一種檢測(cè)微量蛋白樣品的方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)由基因組編碼翻譯生成，并在生物化學(xué)代謝途徑、大分子組裝中發(fā)揮重要作用。隨著人類和許多典型生物體及具有親緣關(guān)系物種的基因組測(cè)序完成，對(duì)于正常和非正常組織，如腫瘤和機(jī)能障礙的器官進(jìn)行蛋白質(zhì)(組)的分析就變得至關(guān)重要了。為了對(duì)蛋白進(jìn)行分析，已經(jīng)發(fā)展起來許多技術(shù)，如質(zhì)譜技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片、通過抗體介導(dǎo)表面等離子技術(shù)(surface plasma)等已經(jīng)應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的蛋白質(zhì)分析。但是現(xiàn)存實(shí)驗(yàn)方法對(duì)于含量少的樣品檢測(cè)靈敏度低，這就限制了它們的應(yīng)用范圍。DNA和RNA與蛋白質(zhì)不同，能夠通過擴(kuò)增放大用于芯片檢測(cè)，而蛋白質(zhì)本身不能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后的擴(kuò)增。因此， 要對(duì)微量甚至是單個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)(組)進(jìn)行分析，就迫切需要發(fā)展一種新型的檢測(cè)技術(shù)， 能特異性檢測(cè)出少到甚至單個(gè)細(xì)胞的微量蛋白樣品?，F(xiàn)存技術(shù)中，使用抗體檢測(cè)蛋白信號(hào)的方法能將信號(hào)進(jìn)行級(jí)聯(lián)放大，但是它的決定因素是結(jié)合動(dòng)力學(xué)，而不在于檢測(cè)的靈敏度。當(dāng)加入過量的抗體時(shí)，抗體與其相應(yīng)抗原的反應(yīng)遵循一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。假如所給定的抗體具有很高的親和力，為了實(shí)現(xiàn)在限定的時(shí)間內(nèi)使抗原、抗體達(dá)到最大限度的結(jié)合，需要增加靶抗原或檢測(cè)抗體的濃度。當(dāng)反應(yīng)中靶蛋白含量很低時(shí)，就需要使用過量的抗體。但是對(duì)于載體表面來說，能夠結(jié)合的抗體的濃度是固定的，很難增加，因此不能僅從載體表面固定的抗體方面考慮。同時(shí)，由于已經(jīng)結(jié)合抗原的抗體帶來的表面效應(yīng)也會(huì)降低后續(xù)抗體的親和力。上述原因，導(dǎo)致微量蛋白樣品的檢測(cè)靈敏度過低。質(zhì)譜技術(shù)對(duì)物種的鑒別非常準(zhǔn)確，但是費(fèi)用昂貴，耗費(fèi)人力多?？贵w檢測(cè)是很早就建立起的一種檢測(cè)特異蛋白或細(xì)胞內(nèi)容物中蛋白質(zhì)的技術(shù)，而且這種技術(shù)被廣泛地用于蛋白質(zhì)印跡(western blot)，但是western blot方法通常一次只能應(yīng)用一種抗體來檢測(cè)蛋白，這極大地限制了檢測(cè)蛋白質(zhì)的數(shù)量。因此，迫切需要一種新的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法，在實(shí)現(xiàn)高靈敏度檢測(cè)微量蛋白樣品的同時(shí)還能夠?qū)Χ喾N微量蛋白樣品進(jìn)行檢測(cè)，特別是對(duì)于單細(xì)胞內(nèi)的蛋白樣品進(jìn)行特定成份的檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)微量蛋白樣品的方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)微量蛋白樣品檢測(cè)靈敏度過低以及不能同時(shí)對(duì)多種蛋白樣品進(jìn)行檢測(cè)的問題。為了實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的，所述檢測(cè)微量蛋白樣品的方法包括以下步驟A.將蛋白樣品固定于帶修飾基團(tuán)的載體上，利用帶寡核苷酸標(biāo)簽序列的抗體與蛋白樣品孵育，形成抗體-蛋白結(jié)合物；B.對(duì)抗體-蛋白結(jié)合物所結(jié)合的寡核苷酸標(biāo)簽序列進(jìn)行擴(kuò)增，得到寡核苷酸標(biāo)簽序列庫；C.利用測(cè)序方法采集寡核苷酸標(biāo)簽序列信號(hào)，并分析所述序列信號(hào)得到相應(yīng)靶標(biāo)蛋白的數(shù)量。所述檢測(cè)微量蛋白樣品的方法，將蛋白樣品固定于載體形成固定相，利用帶有寡核苷酸標(biāo)簽序列的抗體作為流動(dòng)相與蛋白樣品孵育生成抗體-蛋白結(jié)合物，能夠使得蛋白樣品充分結(jié)合相應(yīng)的抗體；再對(duì)抗體上攜帶的寡核苷酸標(biāo)簽序列進(jìn)行擴(kuò)增，使得相應(yīng)的待測(cè)靶標(biāo)蛋白得到級(jí)聯(lián)放大；而利用靈敏度和特異性高的測(cè)序方法采集寡核苷酸標(biāo)簽序列信號(hào)，分析所述序列信號(hào)從而推算出所測(cè)靶標(biāo)蛋白的數(shù)量，通過上述方式可以提高微量蛋白樣品的檢測(cè)靈敏度。同時(shí)，通過寡核苷酸標(biāo)簽序列與抗體-蛋白結(jié)合物的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，能夠?qū)崿F(xiàn)多種蛋白的同時(shí)檢測(cè)。進(jìn)一步的，步驟A包括Al.對(duì)所述載體進(jìn)行化學(xué)修飾，使其表面攜帶修飾基團(tuán)，并將蛋白樣品連接到所述修飾基團(tuán)上；A2.將與待測(cè)靶標(biāo)蛋白匹配的抗體和寡核苷酸標(biāo)簽序列偶聯(lián)，得到帶寡核苷酸標(biāo)簽序列的抗體；A3.將帶寡核苷酸標(biāo)簽序列的抗體與載體上的蛋白樣品孵育，形成抗體-蛋白結(jié)合物；其中，所述步驟Al、A2無先后順序。優(yōu)選的，本發(fā)明中所述載體，包括常見的具有規(guī)則表面形狀的固相載體，如玻片、 硅片和塑料，也包括具有不規(guī)則表面形狀的固相載體，如帶有弧度的載體。上述載體的形狀和材料，并不用以限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，其他形狀和材料的載體也可以用于本發(fā)明。優(yōu)選的，步驟Al中所述載體表面的修飾基團(tuán)能與蛋白所攜帶的基團(tuán)相互結(jié)合，結(jié)合后的連接形式為P1-P-P2，其中Pl代表載體表面的修飾基團(tuán)，P為Pl與P2形成的化學(xué)鍵或中間偶聯(lián)劑，P2代表了蛋白所攜帶的末端基團(tuán)。優(yōu)選的，所述載體固定的蛋白樣品是指含一種蛋白的單一樣品，或含多種蛋白的混合樣品，所述蛋白樣品是天然狀態(tài)或變性狀態(tài)的樣品。 優(yōu)選的，所述抗體匹配于所要檢測(cè)的靶標(biāo)蛋白。優(yōu)選的，若所述的蛋白樣品是含多種蛋白的混合樣品，則所述的寡核苷酸標(biāo)簽序列對(duì)應(yīng)于不同的抗體，且所有寡核苷酸標(biāo)簽序列的擴(kuò)增條件一致，相互之間不會(huì)產(chǎn)生交叉配對(duì)，其序列的長度則由擴(kuò)增和后續(xù)測(cè)序的需求來決定。進(jìn)一步的，抗體與寡核苷酸標(biāo)簽序列的偶聯(lián)一一對(duì)應(yīng)，其偶聯(lián)后的連接形式為 R1-R-R2，其中Rl代表抗體上所攜帶的末端基團(tuán)，R為Rl和R2形成的化學(xué)鍵或中間偶聯(lián)劑， R2代表寡核苷酸標(biāo)簽序列上攜帶的末端基團(tuán)。更進(jìn)一步的，抗體與寡核苷酸標(biāo)簽序列偶聯(lián)形成的連接形式R1-R-R2中，Rl為抗體攜帶的羧基或氨基；R2為寡核苷酸標(biāo)簽序列上攜帶的修飾基團(tuán)如氨基、羧基或生物素等；R為酰胺鍵或中間偶聯(lián)劑如均苯三甲酸(TMA)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、N，N’ - 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、二異丙基乙胺(DIEA)等。優(yōu)選的，偶聯(lián)寡核苷酸標(biāo)簽序列的抗體與蛋白結(jié)合時(shí)，蛋白作為固定相，而抗體作為流動(dòng)相，能夠使得微量靶標(biāo)蛋白樣品也能充分結(jié)合上抗體，提高檢測(cè)方法的靈敏度，而且不同的抗體能與相應(yīng)的靶標(biāo)蛋白同時(shí)進(jìn)行結(jié)合。進(jìn)一步的，所述步驟A3結(jié)束之后，還應(yīng)包括對(duì)結(jié)合靶標(biāo)蛋白后的抗體使用改變緩沖液種類或鹽溶液濃度的方式進(jìn)行洗脫分離的步驟。優(yōu)選的，所述步驟B中的擴(kuò)增采用液相擴(kuò)增或固-液相擴(kuò)增方式。如液相擴(kuò)增方式中普通的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增或固-液相擴(kuò)增方式中的微乳液PCR(emulsion PCR, E-PCR)擴(kuò)增、橋式 PCR 擴(kuò)增、雙引物 E-PCR(dual primer emulsion PCR, DPePCR)擴(kuò)增(或稱為橋式E-PCR擴(kuò)增)。在實(shí)際的操作中，可以優(yōu)選前面所列的多種固-液相擴(kuò)增方式，能夠保證寡核苷酸標(biāo)簽序列的擴(kuò)增是均一且高保真的。在具體操作中，進(jìn)一步優(yōu)選采用E-PCR 進(jìn)行單分子擴(kuò)增，保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性。所述的E-PCR擴(kuò)增采用典型方案，包括Bi.將與寡核苷酸標(biāo)簽序列對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增引物結(jié)合到微珠表面；B2.利用結(jié)合有擴(kuò)增引物的微珠以及抗體-蛋白結(jié)合物制備乳濁液體系；B3.利用制備好的乳濁液體系進(jìn)行E-PCR擴(kuò)增，得到寡核苷酸標(biāo)簽序列庫；B4.對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行破乳釋放和洗滌純化回收。優(yōu)選的，所述步驟Bl中的微珠包括磁珠、塑料珠或玻璃珠中的至少一種。進(jìn)一步的，步驟C中所述的測(cè)序方法，是指通過堿基互補(bǔ)原則測(cè)定寡核苷酸標(biāo)簽序列中的堿基，確認(rèn)寡核苷酸標(biāo)簽序列及其對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)蛋白。所述檢測(cè)微量蛋白樣品的方法中，每一種抗體對(duì)應(yīng)一種標(biāo)簽序列，這些標(biāo)簽序列代表的是不同的抗體，也就是代表了不同的靶標(biāo)蛋白。由于之前的擴(kuò)增采用均一高保真的擴(kuò)增方式，而且是進(jìn)行單分子檢測(cè)，因此高通量測(cè)序得到的序列片段的個(gè)數(shù)即為原始樣品中所對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)蛋白的個(gè)數(shù)。通過簡單的記數(shù)每一種標(biāo)簽序列片段的個(gè)數(shù)，就可以得到對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)蛋白的個(gè)數(shù)，二者呈線性關(guān)系。由上可知，本發(fā)明在對(duì)微量蛋白樣品進(jìn)行高靈敏度檢測(cè)的過程中，對(duì)應(yīng)靶標(biāo)蛋白的多種抗體采用寡核苷酸標(biāo)簽序列進(jìn)行偶聯(lián)，通過抗體與蛋白結(jié)合形成抗體-蛋白結(jié)合物進(jìn)行級(jí)聯(lián)擴(kuò)增，將檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行級(jí)聯(lián)放大，然后再采用測(cè)序的方法檢測(cè)寡核苷酸標(biāo)簽序列的信號(hào)，提高了對(duì)微量蛋白樣品的檢測(cè)靈敏度。將蛋白樣品固定于載體，可以進(jìn)行多種蛋白的同時(shí)檢測(cè)。


圖1是本發(fā)明檢測(cè)微量蛋白樣品的方法流程圖；圖2是圖1所示實(shí)施例中將蛋白樣品固定于帶修飾基團(tuán)的載體上，利用帶寡核苷酸標(biāo)簽序列的抗體與蛋白樣品孵育，形成抗體-蛋白結(jié)合物的方法流程圖；圖3是圖1所示實(shí)施例中用于固定蛋白樣品的載體結(jié)構(gòu)示意圖；圖4是圖1所示實(shí)施例中用于固定蛋白樣品的載體結(jié)構(gòu)示意圖；圖5是圖1所示實(shí)施例中對(duì)抗體-蛋白結(jié)合物所結(jié)合的寡核苷酸標(biāo)簽序列進(jìn)行液相擴(kuò)增，得到寡核苷酸標(biāo)簽序列庫的方法流程圖；圖6是圖1所示實(shí)施例中對(duì)抗體-蛋白結(jié)合物所結(jié)合的寡核苷酸標(biāo)簽序列進(jìn)行固-液相擴(kuò)增，得到寡核苷酸標(biāo)簽序列庫的方法流程圖；圖7是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中檢測(cè)微量蛋白樣品的方法示意圖；圖8是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中檢測(cè)微量蛋白樣品的方法示意圖。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1示出了本發(fā)明檢測(cè)微量蛋白樣品的方法流程，包括在步驟SlOl中，將蛋白樣品固定于帶修飾基團(tuán)的載體上，利用帶寡核苷酸標(biāo)簽序列的抗體與蛋白樣品孵育，形成抗體-蛋白結(jié)合物。關(guān)于步驟SlOl的具體過程，將在圖2 中詳細(xì)闡述。在步驟S102中，對(duì)抗體-蛋白結(jié)合物所結(jié)合的寡核苷酸標(biāo)簽序列進(jìn)行擴(kuò)增，得到寡核苷酸標(biāo)簽序列庫。關(guān)于步驟S102的具體過程，將在圖5中詳細(xì)闡述。在步驟S103中，利用測(cè)序方法采集寡核苷酸標(biāo)簽序列信號(hào)，并分析所述序列信號(hào)得到相應(yīng)靶標(biāo)蛋白的數(shù)量。在之前的步驟中，設(shè)計(jì)的是每一種抗體對(duì)應(yīng)一種寡核苷酸標(biāo)簽序列，不同標(biāo)簽序列代表不同的抗體，也就代表了不同的靶標(biāo)蛋白。由于之前的擴(kuò)增是單分子擴(kuò)增，因此測(cè)序得到的寡核苷酸序列片段的數(shù)量即為原始樣品中所對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)蛋白的數(shù)量。通過計(jì)算每一種寡核苷酸標(biāo)簽序列片段的數(shù)量，就可以得到對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)蛋白的數(shù)量。其中，所述測(cè)序方法是利用堿基互補(bǔ)原則對(duì)寡核苷酸標(biāo)簽序列進(jìn)行堿基序列測(cè)定，例如合成測(cè)序法或連接測(cè)序法。在一個(gè)實(shí)施例中，利用與寡核苷酸標(biāo)簽序列互補(bǔ)的測(cè)序引物，通過DNA聚合酶以及帶可去除標(biāo)記的四種核苷酸混合物進(jìn)行單堿基延伸合成反應(yīng)， 收集加入核苷酸的標(biāo)記信號(hào)，即可得到相應(yīng)堿基的序列信號(hào)，從而達(dá)到通過合成測(cè)序法采集所述寡核苷酸標(biāo)簽序列信號(hào)的目的。在另一個(gè)實(shí)施例中，則采用連接測(cè)序法，利用含數(shù)個(gè) bp的帶熒光標(biāo)記的核酸探針以及連接酶作用，采集連接到寡核苷酸標(biāo)簽序列上的探針熒光信號(hào)，再切除熒光探針，反復(fù)測(cè)定得到寡核苷酸標(biāo)簽序列信號(hào)。圖2給出了圖1步驟SlOl將蛋白樣品固定于帶修飾基團(tuán)的載體上，利用帶寡核苷酸標(biāo)簽序列的抗體與蛋白樣品孵育，形成抗體-蛋白結(jié)合物的方法流程。其中包括在步驟SlOll中，預(yù)先對(duì)要用于固定蛋白樣品的載體進(jìn)行化學(xué)基團(tuán)修飾，使載體表面攜帶修飾基團(tuán)，并將蛋白樣品連接到所述修飾基團(tuán)上。所述載體表面的修飾基團(tuán)能與蛋白所攜帶的基團(tuán)相互結(jié)合，結(jié)合后的連接形式為P1-P-P2，其中Pl代表載體表面的修飾基團(tuán)，P為Pl與P2形成的化學(xué)鍵或中間偶聯(lián)劑，P2代表了蛋白所攜帶的末端基團(tuán)。需要說明的是本發(fā)明中的蛋白樣品存在多種，載體也存在多種，而蛋白樣品與修飾基團(tuán)之間的連接方式也存在多種，以下將分別詳述。關(guān)于蛋白樣品本發(fā)明所述的蛋白樣品可以是任意來源的蛋白，包括直接得到的或人工合成的蛋白，或是從生物組織中提取得到的蛋白，如破碎細(xì)胞得到的蛋白或病毒中提取的蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，從非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)中提取細(xì)胞蛋白用于檢測(cè)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，從痘病毒(Poxviuses)中提取病毒蛋白用于檢測(cè)病毒特征蛋白。此外，為凸顯本發(fā)明的意義所在，固定的蛋白樣品是指含一種蛋白的單一樣品，或含多種蛋白的混合樣品，所述蛋白樣品是天然狀態(tài)或變性狀態(tài)的樣品。當(dāng)固定于載體的蛋白樣品為多種蛋白的混合樣品時(shí)，本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多于一種靶標(biāo)蛋白的樣品進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。關(guān)于載體本發(fā)明中所述載體，包括常見的具有規(guī)則表面形狀的固相載體，如平面的玻片、硅片和塑料，也包括具有不規(guī)則表面形狀的固相載體，如帶有弧度的載體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，采用如圖3所示的規(guī)則形狀的矩形玻片。而在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，采用了如圖4所示的不規(guī)則弧形的載體。上述載體的形狀和材料，并不用以限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，其他形狀和材料的載體也可以用于本發(fā)明。關(guān)于蛋白樣品與修飾基團(tuán)之間的連接方式在一個(gè)實(shí)施例中，對(duì)載體表面進(jìn)行氨基(Pl)修飾，可以與蛋白所攜帶的羧基(P》形成酰胺鍵(P)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，對(duì)載體進(jìn)行氨基(Pi)修飾，采用中間偶聯(lián)劑戊二醛(P)，將載體表面的氨基(Pi)與蛋白所攜帶的羧基(P》連接。在步驟S1012中，將與待測(cè)靶標(biāo)蛋白匹配的抗體和寡核苷酸標(biāo)簽序列偶聯(lián)，得到帶寡核苷酸標(biāo)簽序列的抗體。若檢測(cè)的蛋白樣品為多種蛋白的混合樣品，則不同的寡核苷酸標(biāo)簽序列對(duì)應(yīng)不同的抗體，相互之間不會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)配，且所有的寡核苷酸標(biāo)簽序列的擴(kuò)增條件一致，其長度由擴(kuò)增和后續(xù)測(cè)序的需求決定?？贵w與寡核苷酸標(biāo)簽序列的偶聯(lián)一一對(duì)應(yīng)，其偶聯(lián)后的連接形式為R1-R-R2，其中Rl代表抗體上所攜帶的末端基團(tuán)，R為Rl和R2 形成的化學(xué)鍵或中間偶聯(lián)劑，R2代表寡核苷酸標(biāo)簽序列上攜帶的末端基團(tuán)。關(guān)于該連接形式，分別闡述如下若R為Rl和R2形成的化學(xué)鍵在一個(gè)實(shí)施例中，Rl選用抗體上所攜帶的氨基，而寡核苷酸標(biāo)簽序列經(jīng)過羧基化修飾，從而R2為寡核苷酸標(biāo)簽序列上的羧基，R則為二者形成的酰胺鍵。在另一個(gè)實(shí)施例中，抗體經(jīng)過鏈霉親和素修飾，Rl為抗體上所帶的鏈霉親和基團(tuán)，而寡核苷酸標(biāo)簽序列經(jīng)過生物素修飾，R2為生物素基團(tuán)，R為鏈霉親和生物素融合體。若R為中間偶聯(lián)劑中間偶聯(lián)劑可以包括均苯三甲酸(TMA)、N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS)、N，N，_ 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)溶液、二異丙基乙胺(DIEA)的至少一種。在一個(gè)實(shí)施例中，R選用NHS，通過NHS將抗體與寡核苷酸標(biāo)簽序列偶聯(lián)在一起。在步驟S1013中，將帶寡核苷酸標(biāo)簽序列的抗體與載體上的蛋白樣品孵育，形成抗體-蛋白結(jié)合物。其中，固定在載體上的蛋白樣品作為固定相，而偶聯(lián)標(biāo)簽寡核苷酸標(biāo)簽序列的抗體作為流動(dòng)相，靶標(biāo)蛋白與抗體能夠進(jìn)行充分的結(jié)合，提高檢測(cè)的靈敏度。兩者孵育的條件，在一個(gè)實(shí)施中為37°C下孵育2h，在另一個(gè)實(shí)施例中，28°C下孵育結(jié)合2h，即可得到所要的抗體-蛋白結(jié)合物。上述步驟中SlOll和S1012之間并無先后順序，在另一個(gè)實(shí)施例中，二者的先后順序置換，同樣能實(shí)現(xiàn)形成抗體-蛋白結(jié)合物的目的。上述步驟結(jié)束之后，還包括對(duì)未結(jié)合蛋白的抗體進(jìn)行分離洗滌，然后再對(duì)結(jié)合有靶標(biāo)蛋白的抗體進(jìn)行洗脫收集的步驟。利用緩沖液對(duì)孵育之后的反應(yīng)液進(jìn)行洗滌，將剩余的流動(dòng)相抗體分離。然后換用洗脫液，對(duì)結(jié)合有靶標(biāo)蛋白的抗體進(jìn)行洗脫，收集以待后續(xù)使用。在一個(gè)實(shí)施例中，我們分別對(duì)靶標(biāo)蛋白protein A和protein B進(jìn)行檢測(cè)，因此我們選擇antibody-A和antibody-B作為靶標(biāo)蛋白的抗體，對(duì)應(yīng)的，設(shè)計(jì)了兩種寡核苷酸標(biāo)簽序列I和II。按照上述方法，將蛋白樣品固定于載體，然后先將antibody-A與寡核苷酸標(biāo)簽序列I、antibody-B與寡核苷酸標(biāo)簽序列II偶聯(lián)起來，再與固定在載體上的蛋白樣品進(jìn)行孵育結(jié)合，形成抗體-蛋白結(jié)合物，通過分離洗滌以及洗脫，提純抗體-蛋白結(jié)合物。圖5示出了圖1所示實(shí)施例中步驟S102對(duì)抗體-蛋白結(jié)合物所結(jié)合的寡核苷酸標(biāo)簽序列進(jìn)行液相擴(kuò)增，得到寡核苷酸標(biāo)簽序列庫的方法流程。包括在步驟S1021’中，利用抗體-蛋白結(jié)合物上結(jié)合的寡核苷酸標(biāo)簽序列作為模板， 配制液相PCR擴(kuò)增體系。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，以抗體-蛋白結(jié)合物中的寡核苷酸標(biāo)簽序列為模板，建立如下液相PCR擴(kuò)增體系10 XPCR buffer,15yL;50mM MgS04，3 μ L ； IOmM dNTP，3 μ L ;10 μ M濃度的上、下游兩端引物，各1 μ L ；抗體-蛋白結(jié)合物洗脫液，1 μ L ；5U/ μ L濃度的Taq酶，5 μ L，加ddH20至150 μ L，形成液相PCR擴(kuò)增體系。在步驟S1022’中，利用配制好的液相PCR擴(kuò)增體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物。 本發(fā)明中的一個(gè)實(shí)施例中，進(jìn)行如下PCR擴(kuò)增94°C,5min ；940C，30s ；60°C，50s ；72°C，2min ；循環(huán) 25 次；721，21^11;然后41保存。在步驟S1023’中，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化回收，得到寡核苷酸標(biāo)簽序列庫。液相 PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠，跑膠回收寡核苷酸標(biāo)簽序列長度所在的目的條帶，通過吸附柱以及高速離心方式對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物以TE緩沖液重懸保存。圖6示出了對(duì)抗體-蛋白結(jié)合物所結(jié)合的寡核苷酸標(biāo)簽序列進(jìn)行固-液相擴(kuò)增， 得到寡核苷酸標(biāo)簽序列庫的方法流程。包括在步驟S1021中，將與寡核苷酸標(biāo)簽序列對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增引物結(jié)合到微珠上。其中，所述微珠包括磁珠、塑料珠或玻璃珠中的一種。二者結(jié)合的方法可以利用現(xiàn)有方法，如通過氨基與羧基或醛基結(jié)合，丙烯酰胺與聚丙烯酰胺結(jié)合等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，采用磁珠表面帶有的鏈霉親和素與被生物素化的引物進(jìn)行孵育結(jié)合。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中， 采用醛基修飾磁珠表面，與擴(kuò)增引物的氨基反應(yīng)而使擴(kuò)增引物結(jié)合到磁珠上。在步驟S1022中，利用結(jié)合了擴(kuò)增引物的微珠以及抗體-蛋白結(jié)合物制備乳濁液擴(kuò)增體系。將抗體上所結(jié)合的寡核苷酸標(biāo)簽序列作為模板，加入結(jié)合了擴(kuò)增引物的微珠以及擴(kuò)增體系所需要的其他試劑，制備成水相體系。然后將水相與油相混合，放置于乳濁液制備儀上，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的需要，以適宜的頻率和時(shí)間進(jìn)行震蕩混勻，制備成乳濁液擴(kuò)增體系。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，乳濁液擴(kuò)增體系采用13HZ，13s的條件進(jìn)行制備。在步驟S1023中，利用上述制備好的乳濁液擴(kuò)增體系進(jìn)行E-PCR擴(kuò)增，得到寡核苷酸標(biāo)簽序列庫。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，進(jìn)行如下所示擴(kuò)增94"C 4min ；94"C 3s,64°C 55s,72°C 45s,3cycles ；94°C 30s,61°C 55s,72°C 45s,3cycles ；94°C 30s, 58°C 55s,72°C 45s,3cycles ；94°C 30s, 57°C 55s，72°C 45s, IOOcycles ；72°C 6min ;10°C 保溫。應(yīng)當(dāng)說明的是，上述擴(kuò)增條件僅為部分實(shí)施例，并不用以限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。在步驟SlOM中，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行破乳釋放和洗滌，提純寡核苷酸標(biāo)簽序列庫。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入異丙醇，混合均勻，4000rpm離心;3min，去上清； 然后加入適量的Extraction buffer,振蕩混勻，4000rpm離心3min，去上清；加入TE洗滌， 去上清，再用TE重懸擴(kuò)增產(chǎn)物。
圖7是本發(fā)明實(shí)施例中檢測(cè)細(xì)胞中微量蛋白樣品的方法示意圖。該圖直觀的展示了檢測(cè)細(xì)胞中微量蛋白樣品的過程步驟1、對(duì)載體進(jìn)行羧基化修飾，利用化學(xué)裂解法破碎細(xì)胞獲取細(xì)胞全蛋白，將細(xì)胞全蛋白通過羧基與氨基作用形成的酰胺鍵固定于載體上。步驟2、將與待測(cè)靶標(biāo)細(xì)胞蛋白匹配的抗體通過氨基羧基之間的鍵和作用和寡核苷酸標(biāo)簽序列一一對(duì)應(yīng)偶聯(lián)，然后將偶聯(lián)了寡核苷酸標(biāo)簽序列的抗體與固定于載體上的細(xì)胞全蛋白孵育形成抗體-蛋白結(jié)合物，將未結(jié)合的抗體洗滌分離，然后將載體上的抗體-蛋白結(jié)合物進(jìn)行洗脫收集，以備后續(xù)操作使用。步驟3、利用鏈霉親和生物素的作用將與寡核苷酸標(biāo)簽序列對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增引物結(jié)合到磁珠上，再利用磁珠以及抗體上所偶聯(lián)的寡核苷酸標(biāo)簽序列制備乳濁液擴(kuò)增體系，對(duì)抗體-蛋白結(jié)合物進(jìn)行E-PCR擴(kuò)增獲取寡核苷酸標(biāo)簽序列庫，破乳收集擴(kuò)增產(chǎn)物。步驟4、將擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣固定到測(cè)序所用的玻片上，利用測(cè)序方法采集寡核苷酸標(biāo)簽序列信號(hào)，統(tǒng)計(jì)并分析寡核苷酸標(biāo)簽序列信號(hào)，通過線性對(duì)應(yīng)關(guān)系得到各相應(yīng)靶標(biāo)蛋白的數(shù)量。圖8是本發(fā)明實(shí)施例中檢測(cè)病毒中微量蛋白樣品的方法示意圖。該圖直觀的展示了檢測(cè)病毒中微量蛋白樣品的過程步驟1、對(duì)載體進(jìn)行羧基化修飾，利用反復(fù)凍融法裂解病毒獲取病毒蛋白，將病毒蛋白通過羧基與氨基作用形成的酰胺鍵固定于載體上。步驟2、將與待測(cè)靶標(biāo)病毒特征蛋白匹配的抗體通過氨基羧基之間的鍵和作用與寡核苷酸標(biāo)簽序列一一對(duì)應(yīng)偶聯(lián)，然后將偶聯(lián)了寡核苷酸標(biāo)簽序列的抗體與固定于載體上的病毒蛋白孵育形成抗體-蛋白結(jié)合物，將未結(jié)合的抗體洗滌分離，然后將載體上的抗體-蛋白結(jié)合物進(jìn)行洗脫收集，以備后續(xù)操作使用。步驟3、利用鏈霉親和生物素的作用將與寡核苷酸標(biāo)簽序列對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增引物結(jié)合到磁珠上，再利用所述磁珠以及抗體上所偶聯(lián)的寡核苷酸標(biāo)簽序列制備乳濁液擴(kuò)增體系， 對(duì)抗體-蛋白結(jié)合物進(jìn)行E-PCR擴(kuò)增獲取寡核苷酸標(biāo)簽序列庫，破乳收集擴(kuò)增產(chǎn)物。步驟4、將擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣固定于到測(cè)序所用的玻片上，利用測(cè)序方法采集寡核苷酸標(biāo)簽序列信號(hào)，并分析所述寡核苷酸標(biāo)簽序列信號(hào)，通過線性對(duì)應(yīng)關(guān)系得到各相應(yīng)病毒特征蛋白的數(shù)量。應(yīng)當(dāng)說明的是，本發(fā)明對(duì)微量蛋白樣品進(jìn)行檢測(cè)的方法典型的應(yīng)用于蛋白樣品檢測(cè)，但不限于蛋白樣品檢測(cè)，任何其他類似的應(yīng)用均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)微量蛋白樣品的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟A.將蛋白樣品固定于帶修飾基團(tuán)的載體上，利用帶寡核苷酸標(biāo)簽序列的抗體與蛋白樣品孵育，形成抗體-蛋白結(jié)合物；B.對(duì)抗體-蛋白結(jié)合物所結(jié)合的寡核苷酸標(biāo)簽序列進(jìn)行擴(kuò)增，得到寡核苷酸標(biāo)簽序列庫；C.利用測(cè)序方法采集寡核苷酸標(biāo)簽序列信號(hào)，并分析所述序列信號(hào)得到相應(yīng)靶標(biāo)蛋白的數(shù)量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)微量蛋白樣品的方法，其特征在于，所述步驟A包括以下步驟Al.對(duì)所述載體進(jìn)行化學(xué)修飾，使其表面攜帶修飾基團(tuán)，并將蛋白樣品連接到所述修飾基團(tuán)上；A2.將與待測(cè)靶標(biāo)蛋白匹配的抗體和寡核苷酸標(biāo)簽序列偶聯(lián)，得到帶寡核苷酸標(biāo)簽序列的抗體；A3.將帶寡核苷酸標(biāo)簽序列的抗體與載體上的蛋白樣品孵育，形成抗體-蛋白結(jié)合物； 其中，所述步驟Al、A2無先后順序。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)微量蛋白樣品的方法，其特征在于，所述步驟A中載體表面的修飾基團(tuán)能與蛋白所攜帶的基團(tuán)相互結(jié)合，結(jié)合后的連接形式為P1-P-P2，其中 Pl代表載體表面的修飾基團(tuán)，P為Pl與P2形成的化學(xué)鍵或中間偶聯(lián)劑，P2代表蛋白所攜帶的末端基團(tuán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3述的檢測(cè)微量蛋白樣品的方法，其特征在于，所述蛋白樣品是指含一種蛋白的單一樣品，或含多種蛋白的混合樣品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)微量蛋白樣品的方法，其特征在于，若所述蛋白樣品是含多種蛋白的混合樣品，則所述步驟B中寡核苷酸標(biāo)簽序列的擴(kuò)增條件一致。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)微量蛋白樣品的方法，其特征在于，抗體與寡核苷酸標(biāo)簽序列的偶聯(lián)一一對(duì)應(yīng)，其偶聯(lián)后的連接形式為R1-R-R2，其中Rl代表抗體上所攜帶的末端基團(tuán)，R為Rl和R2形成的化學(xué)鍵或中間偶聯(lián)劑，R2代表寡核苷酸標(biāo)簽序列上攜帶的末端基團(tuán)。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)微量蛋白樣品的方法，其特征在于，所述步驟A3后還包括對(duì)未結(jié)合蛋白的抗體進(jìn)行分離洗滌，并對(duì)結(jié)合有靶標(biāo)蛋白的抗體進(jìn)行洗脫。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)微量蛋白樣品的方法，其特征在于，對(duì)結(jié)合靶標(biāo)蛋白后的抗體采用改變緩沖液種類或鹽溶液濃度的方式進(jìn)行洗脫分離。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)微量蛋白樣品的方法，其特征在于，所述步驟B中擴(kuò)增的方式，采用液相擴(kuò)增或固-液相擴(kuò)增的方式。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測(cè)微量蛋白樣品的方法，其特征在于，若所述步驟B采用固-液相擴(kuò)增方式，則擴(kuò)增步驟包括Bi.將與寡核苷酸標(biāo)簽序列對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增引物結(jié)合到微珠表面； B2.利用結(jié)合有擴(kuò)增引物的微珠以及抗體-蛋白結(jié)合物制備乳濁液體系； B3.利用制備的乳濁液體系進(jìn)行E-PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；B4.對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行破乳釋放和純化回收，得到寡核苷酸標(biāo)簽序列庫。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的檢測(cè)微量蛋白樣品的方法，其特征在于，所述步驟Bl中的微珠包括磁珠、塑料珠或玻璃珠中的至少一種。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)微量蛋白樣品的方法，其特征在于，步驟C中所述測(cè)序方法，是指通過堿基互補(bǔ)原則測(cè)定寡核苷酸標(biāo)簽序列中的堿基，確認(rèn)寡核苷酸標(biāo)簽序列及其對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物樣品的檢測(cè)，提供了一種對(duì)微量蛋白樣品進(jìn)行高靈敏度檢測(cè)的方法。所述方法包括以下步驟A.將蛋白樣品固定于帶修飾基團(tuán)的載體上，利用帶寡核苷酸標(biāo)簽序列的抗體與蛋白樣品孵育，形成抗體-蛋白結(jié)合物；B.對(duì)抗體-蛋白結(jié)合物所結(jié)合的寡核苷酸標(biāo)簽序列進(jìn)行擴(kuò)增，得到寡核苷酸標(biāo)簽序列庫；C.利用測(cè)序方法采集寡核苷酸標(biāo)簽序列信號(hào)，并分析所述序列信號(hào)得到相應(yīng)靶標(biāo)蛋白的數(shù)量。本發(fā)明將蛋白樣品固定于帶有修飾基團(tuán)的載體上，利用抗體上偶聯(lián)的寡核苷酸標(biāo)簽序列進(jìn)行級(jí)聯(lián)擴(kuò)增，并利用測(cè)序的方法檢測(cè)寡核苷酸標(biāo)簽序列的信號(hào)，間接得到微量蛋白樣品的放大信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)微量蛋白樣品進(jìn)行高靈敏度檢測(cè)以及定量的目的。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102277433SQ20111022295
公開日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2011年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月4日
發(fā)明者盛司潼 申請(qǐng)人:盛司潼