專利名稱：一種血清MICA蛋白及其mRNA的檢查方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種血清MICA蛋白及其mRNA的檢查方法。
背景技術(shù)：
自上世紀50年代美國成功實施世界上首例腎移植以來，器官移植作為一項劃時代的新技術(shù)在過去的50多年中得到了蓬勃發(fā)展，特別是隨著八十年代末免疫抑制劑的出現(xiàn)，更是極大地提高了器官移植的成功率和受者的存活率，至今全球大約已經(jīng)有60多萬患者接受了包括腎、肝、心在內(nèi)的器官移植手術(shù)。我國從上世紀60年代開展器官移植以來，至2006年全國年器官移植數(shù)已位居全球第二位，取得了長足的進步和發(fā)展。移植物發(fā)生免疫排斥反應(yīng)是自器官移植出現(xiàn)后就一直困擾著國內(nèi)外學(xué)者的最大瓶頸，雖然移植免疫機制的研究在不斷深入，大量新免疫抑制藥物在不斷涌現(xiàn)，但是不可否認目前國內(nèi)外依然面臨著如移植后移植物發(fā)生免疫排斥機率仍然較高，免疫抑制劑費用昂貴及長期應(yīng)用后發(fā)生腫瘤、感染的機會大大增加等諸多問題，因此對移植免疫的研究依然是最關(guān)鍵的課題之一。近來美國學(xué)者在一些腎移植術(shù)前和術(shù)后患者的血清中均發(fā)現(xiàn)了抗MICA蛋白抗體，隨后又在出現(xiàn)排斥反應(yīng)被切除的移植腎中發(fā)現(xiàn)了更高滴度的該抗體，提示此類患者在腎移植前體內(nèi)存在同種異型MICA抗原的預(yù)致敏，且抗MICA蛋白抗體在腎移植后發(fā)生的排斥反應(yīng)中可能起著重要作用，但其參與免疫反應(yīng)的機制仍然不清楚。因此，從血清中檢查MICA蛋白及其mRNA的方法，為進一步研究肝移植等器官移植手術(shù)的排斥反應(yīng)，有重要意義。MICA (major histocompatibility complex class I chain-related gene A)·基因又稱為MHC-I鏈相關(guān)基因A，此基因與經(jīng)典HLA-I類基因具有較高的同源性，但功能不同。MICA位于HLA-B位點著絲粒端約46kb處，全長11 722bp，比經(jīng)典HLA-I類基因長。其編碼產(chǎn)物是一條高度糖基化的蛋白質(zhì)分子，結(jié)構(gòu)與經(jīng)典的HLA-I類分子a鏈相似，包括3個胞外結(jié)構(gòu)域al、a2和a3，以及跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，構(gòu)型很穩(wěn)定。MICA基因呈高度多態(tài)性，存在于人、靈長類、狗、羊、牛和豬中，但不存在小鼠和大鼠體內(nèi)，其主要表達于內(nèi)皮細胞、樹突狀細胞、成纖維細胞、上皮細胞和腫瘤細胞中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種血清MICA蛋白及其mRNA的檢查方法，為進一步研究肝移植等器官移植手術(shù)的排斥反應(yīng)，提供支持。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案
本發(fā)明一種血清MICA蛋白及其mRNA的檢查方法，包括以下步驟
步驟一
取人體的靜脈血存于_80°C冰箱中待檢測；
步驟二
血清MICA蛋白含量的檢測采用western blot法a.3ml靜脈全血離心后提取血清1ml，用ELISA法進行蛋白定量，PVDF膜在5%脫脂奶粉溶液中室溫孵育I小時以封閉膜上的非特異結(jié)合；
b.將上述準備好的樣品液和預(yù)染蛋白marker分別上樣，進行變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳分離蛋白；
c.蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜，按Bio-Rad蛋白轉(zhuǎn)移裝置說明組裝濾紙凝膠纖維素夾層，30mA恒流條件下，4°C轉(zhuǎn)移過夜；
d.PVDF膜在5%脫脂奶粉溶液中室溫孵育I小時以封閉膜上的非特異結(jié)合蛋白，封閉過的膜加入抗MICA —抗，室溫孵育I. 5小時，抗原抗體結(jié)合，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育膜I小時；
e.pvdf膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育，經(jīng)X膠片曝光顯影，圖片掃描保存為電腦文件；
步驟三
血清或者細胞內(nèi)MICA mRNA表達水平的檢測
a.提取RNA:3ml靜脈全血離心后提取血清Iml；
b.逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第I鏈及第2鏈；
c.將逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA進行PCR擴增在50ul的反應(yīng)體系中加入Iul上述cDNA、2. 5ul Taq酶和2. 5ul抗Taq酶，5’端引物序列為ATGCCCCAGTCCTCCAGA，3’端引物為GTGGCATCCC TGTGGTCA,內(nèi)參基因選擇為beta-actin，PCR周期設(shè)置為94°C變性I分鐘，64°C復(fù)性I分鐘,聚合過程45秒,進行30個周期的擴增；采用BigDye Terminator Cyclesequencing kit and Abi Prism 310試劑盒測定擴增的DNA產(chǎn)物,與內(nèi)參基因?qū)Ρ鹊乃郊碝ICA mRNA的表達水平。與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明能夠快速、便捷、準確的檢查出血清中的MICA蛋白及其mRNA，為進一步研究肝移植等器官移植手術(shù)的排斥反應(yīng)，提供支持。
具體實施例方式本發(fā)明一種血清MICA蛋白及其mRNA的檢查方法，包括以下步驟
步驟一
取人體的靜脈血存于_80°C冰箱中待檢測；
步驟二
血清MICA蛋白含量的檢測采用western blot法
a.3ml靜脈全血離心后提取血清1ml，用ELISA法進行蛋白定量，PVDF膜在5%脫脂奶粉溶液中室溫孵育I小時以封閉膜上的非特異結(jié)合；
b.將上述準備好的樣品液和預(yù)染蛋白marker分別上樣，進行變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳分離蛋白；
c.蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜，按Bio-Rad蛋白轉(zhuǎn)移裝置說明組裝濾紙凝膠纖維素夾層，30mA恒流條件下，4°C轉(zhuǎn)移過夜；
d.PVDF膜在5%脫脂奶粉溶液中室溫孵育I小時以封閉膜上的非特異結(jié)合蛋白，封閉過的膜加入抗MICA —抗，室溫孵育I. 5小時，抗原抗體結(jié)合，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育 膜I小時；
e.pvdf膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育，經(jīng)X膠片曝光顯影，圖片掃描保存為電腦文件；步驟三
血清或者細胞內(nèi)MICA mRNA表達水平的檢測
a.提取RNA:3ml靜脈全血離心后提取血清Iml；
b.逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第I鏈及第2鏈；
c.將逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA進行PCR擴增在50ul的反應(yīng)體系中加入Iul上述cDNA、2. 5ul Taq酶和2. 5ul抗Taq酶，5’端引物序列為ATGCCCCAGTCCTCCAGA，3’端引物為GTGGCATCCC TGTGGTCA,內(nèi)參基因選擇為beta-actin，PCR周期設(shè)置為94°C變性I分鐘，64°C復(fù)性I分鐘,聚合過程45秒,進行30個周期的擴增；采用BigDye Terminator Cyclesequencing kit and Abi Prism 310試劑盒測定擴增的DNA產(chǎn)物,與內(nèi)參基因?qū)Ρ鹊乃郊碝ICA mRNA的表達水平。利用本發(fā)明的方法，引深 的有益效果是，可以對比出器官移植前后血清中的MICA蛋白及MICA mRNA的表達水平，為進一步研究肝移植等器官移植手術(shù)的排斥反應(yīng)，提供支持。
權(quán)利要求
1.一種血清MICA蛋白及其mRNA的檢查方法，其特征在于包括以下步驟 步驟一 取人體的靜脈血存于_80°C冰箱中待檢測； 步驟二 血清MICA蛋白含量的檢測采用western blot法 a.3ml靜脈全血離心后提取血清1ml，用ELISA法進行蛋白定量，PVDF膜在5%脫脂奶粉溶液中室溫孵育I小時以封閉膜上的非特異結(jié)合； b.將上述準備好的樣品液和預(yù)染蛋白marker分別上樣，進行變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳分離蛋白； c.蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜，按Bio-Rad蛋白轉(zhuǎn)移裝置說明組裝濾紙凝膠纖維素夾層，30mA恒流條件下，4°C轉(zhuǎn)移過夜； d.PVDF膜在5%脫脂奶粉溶液中室溫孵育I小時以封閉膜上的非特異結(jié)合蛋白，封閉過的膜加入抗MICA —抗，室溫孵育I. 5小時，抗原抗體結(jié)合，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育膜I小時； e.pvdf膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育，經(jīng)X膠片曝光顯影，圖片掃描保存為電腦文件； 步驟三 血清或者細胞內(nèi)MICA mRNA表達水平的檢測 a.提取RNA:3ml靜脈全血離心后提取血清Iml； b.逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第I鏈及第2鏈； c.將逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA進行PCR擴增在50ul的反應(yīng)體系中加入Iul上述cDNA、2. 5ul Taq酶和2. 5ul抗Taq酶，5’端引物序列為ATGCCCCAGTCCTCCAGA，3’端引物為GTGGCATCCC TGTGGTCA,內(nèi)參基因選擇為beta-actin，PCR周期設(shè)置為94°C變性I分鐘，64°C復(fù)性I分鐘,聚合過程45秒,進行30個周期的擴增；采用BigDye Terminator Cyclesequencing kit and Abi Prism 310試劑盒測定擴增的DNA產(chǎn)物,與內(nèi)參基因?qū)Ρ鹊乃郊碝ICA mRNA的表達水平。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種血清MICA蛋白及其mRNA的檢查方法，包括以下步驟步驟一取人體的靜脈血存于-80℃冰箱中待檢測；步驟二血清MICA蛋白含量的檢測采用westernblot法；步驟三血清或者細胞內(nèi)MICAmRNA表達水平的檢測。本發(fā)明提供了一種血清MICA蛋白及其mRNA的檢查方法，為進一步研究肝移植等器官移植手術(shù)的排斥反應(yīng)，提供支持。
文檔編號C12Q1/68GK102914655SQ20111022354
公開日2013年2月6日 申請日期2011年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月5日
發(fā)明者曹利平, 丁國平 申請人:浙江大學(xué)