專(zhuān)利名稱(chēng)：高產(chǎn)靈菌紅素的粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)Sm-128菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)醫(yī)學(xué)及生活領(lǐng)域，尤其涉及一株高產(chǎn)靈菌紅素的粘質(zhì)沙雷氏 lif {Serratia marcescens) Sm-128菌株及其蹄選方法禾口用途。
背景技術(shù)：
靈菌紅素(prodigiosins，PG)是一類(lèi)具有三吡咯環(huán)的天然紅色素的總稱(chēng)，具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗瘧疾、免疫抑制和抗腫瘤等活性。近年來(lái)，有關(guān)靈菌紅素的研究主要集中在其潛在的臨床應(yīng)用方面，靈菌紅素是一種很有發(fā)展?jié)摿Φ目鼓[瘤藥物，其平均IC50(半抑制濃度)為2. 1 μ mol/L時(shí)對(duì)人體57種不同癌細(xì)胞均具有較強(qiáng)的抗性，對(duì)體外肝癌轉(zhuǎn)移和人原發(fā)癌細(xì)胞等多種人類(lèi)癌細(xì)胞也有抗性，且對(duì)非惡性細(xì)胞系沒(méi)有明顯的毒性。靈菌紅素作為次生代謝產(chǎn)物，可以由多種微生物代謝產(chǎn)生，其產(chǎn)生菌主要有粘質(zhì)沙雷氏菌fflarc^ce/^)、放線(xiàn)菌和其他一些細(xì)菌，國(guó)內(nèi)采集于大亞灣的海洋假單孢細(xì)菌O^ei/i/oMwas sp.)中也可分離得到靈菌紅素和其衍生物二甲基靈菌紅素，其中以沙雷氏菌屬Q(mào)Serratia)合成靈菌紅素的報(bào)道居多。靈菌紅素具有較強(qiáng)的藥理活性，但由于靈菌紅素難以化學(xué)合成，而利用微生物合成時(shí)往往產(chǎn)率較低，使得其藥理機(jī)制，藥理功效以及毒副作用等方面問(wèn)題都懸而未決，限制了靈菌紅素的應(yīng)用，但靈菌紅素是一種極具特色的抗癌備選藥物。微生物發(fā)酵生產(chǎn)的PG 是比較理想的天然色素，其產(chǎn)生的色素可直接用于工業(yè)、制藥業(yè)等，具有很好的市場(chǎng)潛力， 因此對(duì)產(chǎn)靈菌紅素菌種的開(kāi)發(fā)及發(fā)酵生產(chǎn)工藝條件的研究具有非常重要的意義。目前國(guó)內(nèi)對(duì)靈菌紅素的發(fā)酵生產(chǎn)工藝研究較少，尚處于探索階段，國(guó)內(nèi)已有文獻(xiàn)報(bào)道的產(chǎn)靈菌紅素菌株的產(chǎn)量均處于較低水平，不能滿(mǎn)足工業(yè)化生產(chǎn)的要求。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)市場(chǎng)上對(duì)靈菌紅素需求的日益增長(zhǎng)，而目前高產(chǎn)靈菌紅素菌株缺乏、發(fā)酵生產(chǎn)工藝不完善等問(wèn)題。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一株從魚(yú)體中篩選到的高產(chǎn)靈菌紅素 Sm-128菌株。本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供采用上述的靈菌紅素Sm-US菌株生產(chǎn)靈菌紅素的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案
高產(chǎn)靈菌紅素的粘質(zhì)沙雷氏菌marcescens) Sm-128菌株，該菌株已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(hào)為CCTCC NO :M2010347，保藏時(shí)間為2010年12月 13日。本發(fā)明所述菌株篩選自淡水魚(yú)體。篩選方法如下取一淡水鯽魚(yú)，以無(wú)菌水浸泡洗滌，解剖魚(yú)體，得表層鱗片、肌肉組織和內(nèi)臟。分別用無(wú)菌水密閉條件下低溫浸泡過(guò)夜，采用濃度梯度稀釋法，將稀釋液涂布于PDA培養(yǎng)基平板上，28 °C下恒溫培養(yǎng)。挑取早期菌落為白色，后期為紅色或紫紅色的單菌落，連續(xù)劃線(xiàn)分離純化，得性狀單一的Sm-^8菌株。本發(fā)明從淡水魚(yú)體中分離獲得的粘質(zhì)沙雷氏菌fflarc^ce/^)具有生長(zhǎng)條件粗放、營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單、代謝快、生長(zhǎng)周期短、生產(chǎn)色素能力強(qiáng)、性狀穩(wěn)定等特征，可為工業(yè)化生產(chǎn)靈菌紅素提供菌種資源。為了實(shí)現(xiàn)上述的第二個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案 一種高產(chǎn)靈菌紅素的生產(chǎn)方法，該方法包括以下的步驟
1)取粘質(zhì)沙雷氏菌Sm-^s保藏菌種，在無(wú)菌條件下，挑取少許菌種轉(zhuǎn)接到活化培養(yǎng)基
上；
2)活化培養(yǎng)后，進(jìn)行種子擴(kuò)大培養(yǎng)；
3)最后在培養(yǎng)液及菌體中獲得目的產(chǎn)物靈菌紅素。作為優(yōu)選，上述步驟3)中發(fā)酵培養(yǎng)基為蛋白胨9 g/L，甘油10 ml/L，pH 7. 4 ；發(fā)酵條件為裝液量36 mL/250 mL，轉(zhuǎn)速180 r/m，接種量6 %，溫度觀°C，發(fā)酵時(shí)間65 h。作為優(yōu)選，上述步驟3)中發(fā)酵液離心洗滌后得菌體，以無(wú)水乙醇配制成20% 40% 菌懸液，通過(guò)高壓勻漿破碎后以乙酸乙酯反復(fù)浸提直至菌體無(wú)色為止；將乙酸乙酯相合并濃縮，得色素粗品。作為再優(yōu)選，上述色素粗品用乙醇復(fù)溶，以正己烷乙酸乙酯=1:30 1 :50作為洗脫劑進(jìn)行柱層析，得到一橙色組分al，將al蒸干用甲醇復(fù)溶，過(guò)LH-20凝膠柱，得純品。本發(fā)明的粘質(zhì)沙雷氏菌Sm-^8菌株可應(yīng)用于靈菌紅素的合成。經(jīng)紫外吸收光譜和傅立葉核磁共振波譜(H-NMR)分析證實(shí)Sm-US菌株所產(chǎn)色素為靈菌紅素，該純品產(chǎn)量可達(dá)3 5 g/L。本發(fā)明所述靈菌紅素具有以下性質(zhì)易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿，微溶于石油醚、純水。在不同溶劑中得紫外吸收峰有一定差異性。在不同PH下色調(diào)有一定變化。該色素對(duì)熱極穩(wěn)定，對(duì)氧化劑、還原劑穩(wěn)定，對(duì)光的穩(wěn)定性較差。


圖1為粘質(zhì)沙雷氏菌marcescens)^m-\2^菌株的菌落形態(tài)特征照片。圖2為粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)Sm-128菌株的菌體細(xì)胞形態(tài)特征照片。圖3為粘質(zhì)沙雷氏菌iSerratia marcescens) m-l2^菌株制備的靈菌紅素純品照片。圖4為粘質(zhì)沙雷氏菌marcescens)^m-\2^菌株制備的靈菌紅素紫外吸收波譜圖。圖5為粘質(zhì)沙雷氏菌marcescens) Sm-128菌株基于16S rDNA基因序列建立的沙雷氏屬系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。生物材料保藏說(shuō)明
粘質(zhì)沙雷氏菌marcescens) Sm-128菌株，該菌株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，其保藏編號(hào)為 CCTCC NO :M2010;347，保藏時(shí)間為2010 年 12 月 13 日。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明具體實(shí)施方式
做一個(gè)詳細(xì)的說(shuō)明。
實(shí)施例1從淡水魚(yú)體中分離篩選得到Sm-128菌株
1.1培養(yǎng)基
PDA培養(yǎng)基馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，自然pH。LB培養(yǎng)基胰化蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L, NaCl 10 g/L，瓊脂20 g/L, ρΗ7· 0-7. 2。菌株的分離篩選鑒定
取一淡水鯽魚(yú)，以無(wú)菌水浸泡洗滌，解剖魚(yú)體，得表層鱗片、肌肉組織和內(nèi)臟。分別用無(wú)菌水密閉條件下低溫浸泡過(guò)夜，采用濃度梯度稀釋法(KT1-KT4),取稀釋液200 μ L涂布于 PDA培養(yǎng)基平板上，28 °C下恒溫培養(yǎng)。挑取早期菌落為白色，后期為紅色或紫紅色的單菌落 (1 d)，經(jīng)三次連續(xù)劃線(xiàn)分離純化，得性狀單一的Sm-US菌株，編號(hào)后4 ！冰箱保存?zhèn)溆谩?用LB固體斜面培養(yǎng)基進(jìn)行菌種活化傳代，菌種每4 W轉(zhuǎn)接一次；菌種使用之前需活化。對(duì)選出的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rDNA基因序列鑒定。該菌在LB培養(yǎng)基上觀°C培養(yǎng)12 h后，單菌落形狀為圓形，光滑粘稠，表面隆起， 邊緣整齊，有輕微異味，隨生長(zhǎng)時(shí)間菌落顏色由白色成粉紅色直到紫紅色，所產(chǎn)色素可擴(kuò)散到培養(yǎng)基中。顯微鏡下觀察菌體細(xì)胞呈球形及短桿狀；長(zhǎng)度約1. 0-1. 2 μ m,寬度約0. 9-1. 0 μπι ；無(wú)芽孢；無(wú)運(yùn)動(dòng)；革蘭氏染色呈陰性(附圖1、圖2)。生理生化結(jié)果表明Sm-128菌株兼性好氧，V-P試驗(yàn)和過(guò)氧化氫酶反應(yīng)陽(yáng)性，甲基紅(MR)試驗(yàn)、氧化酶和苯丙氨酸反應(yīng)陰性；能利用蔗糖、葡萄糖、木糖、甘露醇和阿拉伯糖產(chǎn)酸，不能利用乳糖產(chǎn)酸；能還原硝酸鹽；利用檸檬酸鹽可使明膠水解；不能在三糖鐵 (TSI)瓊脂實(shí)驗(yàn)上產(chǎn)生氏5。16S rDNA基因序列分析結(jié)果表明，與粘質(zhì)沙雷氏菌iSerratia marcescens)菌株的同源性達(dá)99.2 % (附圖5)。依據(jù)形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA基因序列，鑒定 Sm-128 菌株為粘質(zhì)沙雷氏菌marcescens)。實(shí)施例2粘質(zhì)沙雷氏菌Sm-^8菌株用于合成靈菌紅素的方法
2.1培養(yǎng)基
LB培養(yǎng)基胰化蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L, NaCl 10 g/L，瓊脂20 g/L, ρΗ7· 0-7. 2。發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨9 g/L，甘油10 ml/L, pH7. 4。靈菌紅素的生物合成
從活化的LB培養(yǎng)基上挑取約2環(huán)菌種接入培養(yǎng)液中，28 0C ,150 r/min培養(yǎng)12 h，再以3 %的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)液，在觀150 r/min培養(yǎng)M h，可得含靈菌紅素的粘質(zhì)沙雷氏菌菌體，并有少量目的產(chǎn)物在發(fā)酵液中。培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的確定
以L(fǎng)B培養(yǎng)基為出發(fā)培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化，最終確定碳源為甘油，氮源為蛋白胨，并去除NaCl等無(wú)機(jī)鹽。在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用minitab 15軟件將培養(yǎng)基進(jìn)一步優(yōu)化，得蛋白胨9 g/L，甘油10 ml/L, pH7. 4的簡(jiǎn)單實(shí)用培養(yǎng)基。最后運(yùn)用minitab 15軟件設(shè)計(jì)中心組合實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得裝液量36 mLASOmL,轉(zhuǎn)速180 r/m，接種量6 %，溫度觀°C，發(fā)酵時(shí)間2. 8 d0
實(shí)施例3粘質(zhì)沙雷氏菌Sm-^8菌株所產(chǎn)靈菌紅素的提取方法
發(fā)酵液離心洗滌后得菌體，以無(wú)水乙醇配置成30 %菌懸液。通過(guò)高壓勻漿破碎后以乙酸乙酯反復(fù)浸提直至菌體無(wú)色為止。將乙酸乙酯相合并濃縮，得色素粗品。將粗品用乙醇復(fù)溶，進(jìn)行TLC實(shí)驗(yàn)，得到最佳展開(kāi)劑正己烷乙酸乙酯=1:40。以此展開(kāi)劑作為洗脫劑，以 200目硅膠進(jìn)行柱層析，得到一橙色組分al，將al蒸干用甲醇復(fù)溶，過(guò)LH-20凝膠柱，得到 bl，b2，b3共三個(gè)組分，其中Μ組分為優(yōu)勢(shì)組分，將其烘干后進(jìn)行紫外吸收光譜和傅立葉核磁共振波譜(H-NMR)分析，最終確定1^2為靈菌紅素(附圖3、圖4)。該菌利用上述方法所得靈菌紅素產(chǎn)量可達(dá)3 5 g/L。上述制得靈菌紅素具有以下性質(zhì)易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿，微溶于石油醚、純水；不同PH下色調(diào)有一定變化。該色素對(duì)熱極穩(wěn)定，對(duì)氧化劑、還原劑穩(wěn)定，對(duì)光的穩(wěn)定性較差。本發(fā)明中所描述的具體實(shí)施例子僅僅對(duì)本發(fā)明精神作舉例說(shuō)明。本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)所描述的具體實(shí)施例子做各種修改或補(bǔ)充或采用類(lèi)似的方式代替， 但并不會(huì)偏離本發(fā)明的精神或超越所附權(quán)利要求書(shū)所定義的范圍。盡管對(duì)本發(fā)明已做出詳細(xì)的說(shuō)明并引證了一些具體實(shí)例，但是對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，只要不離開(kāi)本發(fā)明的精神和范圍可作各種變化或修正是顯然的。
權(quán)利要求
1.高產(chǎn)靈菌紅素的粘質(zhì)沙雷氏菌aarc^ceas)Sm-I觀菌株，該菌株已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(hào)為CCTCC NO :M2010347，保藏時(shí)間為2010年12月 13日。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)靈菌紅素的粘質(zhì)沙雷氏菌QSerreitia marcescens ) Sm-128菌株用于靈菌紅素的生產(chǎn)。
3.一種高產(chǎn)靈菌紅素的生產(chǎn)方法，其特征在于該方法包括以下的步驟1)取粘質(zhì)沙雷氏菌Sm-^8保藏菌種，在無(wú)菌條件下，挑取少許菌種轉(zhuǎn)接到活化培養(yǎng)基上；2)活化培養(yǎng)后，進(jìn)行種子擴(kuò)大培養(yǎng)；3)最后在培養(yǎng)液及菌體中獲得目的產(chǎn)物靈菌紅素。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種高產(chǎn)靈菌紅素的生產(chǎn)方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基為蛋白胨9 g/L，甘油10 ml/L，pH 7. 4 ；發(fā)酵條件為裝液量36 mL/250 mL，轉(zhuǎn)速180 r/m，接種量6 %，溫度觀°C，發(fā)酵時(shí)間65 h。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的一種高產(chǎn)靈菌紅素的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟3)中發(fā)酵液離心洗滌后得菌體，以無(wú)水乙醇配制成20% 40%菌懸液，通過(guò)高壓勻漿破碎后以乙酸乙酯反復(fù)浸提直至菌體無(wú)色為止；將乙酸乙酯相合并濃縮，得色素粗品。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種高產(chǎn)靈菌紅素的生產(chǎn)方法，其特征在于色素粗品用乙醇復(fù)溶，以正己烷乙酸乙酯=1 30 1 :50作為洗脫劑進(jìn)行柱層析，得到一橙色組分al， 將al蒸干用甲醇復(fù)溶，過(guò)LH-20凝膠柱，得純品。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)醫(yī)學(xué)及生活領(lǐng)域，尤其涉及一株高產(chǎn)靈菌紅素的粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)Sm-128菌株和用途。高產(chǎn)靈菌紅素的粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)Sm-128菌株，該菌株已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(hào)為CCTCC No.M2010347，保藏時(shí)間為2010年12月13日。本發(fā)明的粘質(zhì)沙雷氏菌Sm-128菌株可應(yīng)用于靈菌紅素的合成，經(jīng)紫外吸收光譜和傅立葉核磁共振波譜(H-NMR)分析證實(shí)Sm-128菌株所產(chǎn)色素為靈菌紅素，該純品產(chǎn)量可達(dá)3～5g/L。該色素對(duì)熱極穩(wěn)定，對(duì)氧化劑、還原劑穩(wěn)定，對(duì)光的穩(wěn)定性較差。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102277323SQ20111022576
公開(kāi)日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2011年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月8日
發(fā)明者嵇豪, 蔣冬花, 藍(lán)麗精, 蔡琪敏, 韋鳳, 高愛(ài)同 申請(qǐng)人:浙江師范大學(xué)