專利名稱：聚乙二醇修飾的氧化石墨烯及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可用作胰蛋白酶活化劑的聚乙二醇修飾的氧化石墨烯。
背景技術(shù)：
胰蛋白酶(Trypsin)是絲氨酸蛋白酶的一種，是高等動物及人體內(nèi)一種重要的消化酶。胰蛋白酶在胰臟以酶原形式合成，作為胰液的成分分泌后，受腸激酶，或胰蛋白酶的限制性分解而成為具有生物活性的胰蛋白酶。它是一種肽鏈內(nèi)切酶，能夠選擇性水解蛋白質(zhì)(多肽鏈)中由賴氨酸或精氨酸的羧基所形成的肽鏈。在體內(nèi)，胰蛋白酶不僅有消化酶的作用，而且能夠作用于其它酶的前體(如糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等)，對它們起活化作用。在臨床上，胰蛋白酶常用于治療膿胸、血胸、潰瘍、傷口炎癥、創(chuàng)傷性損傷、瘺管等所產(chǎn)生的局部水腫、血腫及膿腫等，能夠促使血凝塊、膿液、痰液等分解，易于引流排除，加速創(chuàng)面凈化，促進(jìn)肉芽組織新生，并有抗炎癥作用。 此外，它可用于呼吸道疾病的治療，也可用于毒蛇咬傷的治療。在生命科學(xué)中，胰蛋白酶是一種非常重要的工具酶。在動物細(xì)胞組織培養(yǎng)中，常用于組織的消化和動物細(xì)胞的培養(yǎng)傳代。由于細(xì)胞膜上的糖蛋白(也叫做糖被)，具有黏附性，可使多個細(xì)胞黏附在一起而形成組織，胰蛋白酶可以用來水解糖被，使“用于實驗的動物組織“分散成單個細(xì)胞.便于制成細(xì)胞懸濁液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和觀察。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，用生物質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)方法中， 或經(jīng)過ID或是2D膠分離的膠帶，都需要蛋白水解酶的酶解，最常用的酶是胰蛋白酶，它是一種序列特異性的蛋白酶，只切割精氨酸賴氨酸殘基的C端。由于胰蛋白酶酶解的強(qiáng)特異性，是蛋白質(zhì)的氨基酸序列測定中不可缺少的工具酶。胰蛋白酶在體內(nèi)體外都有著重要的功能，因此能夠顯著提高其生物活性的活化劑在生物醫(yī)學(xué)研究乃至臨床上無疑將有著重要的作用；并且在質(zhì)譜鑒定過程中，需要酶解溫度是56°C，大大超過了胰蛋白酶的最適溫度，而且過高的溫度易使其變性，失去酶解作用， 因此能夠增強(qiáng)其穩(wěn)定的穩(wěn)定劑也顯得尤為重要。但是到目前為止，能夠提高酶活性的活性劑很少。最近，上海中國科學(xué)院應(yīng)用物理學(xué)的黃慶老師所研究的金納米顆?？梢蕴岣咭鹊鞍酌富钚?0%左右，相對于其它的大大降低酶活性的材料來說是非常好的，但是仍然未能滿足胰蛋白酶活性的顯著提高，未能滿足其在生物學(xué)上運(yùn)用的需求，然而關(guān)于胰蛋白酶的穩(wěn)定劑卻幾乎沒有發(fā)現(xiàn)(固定化酶除外)。因此，為了顯著提高胰蛋白酶的活性和穩(wěn)定性，滿足其在生物醫(yī)學(xué)上的廣泛運(yùn)用， 十分有必要發(fā)明一種胰蛋白酶活化劑?，F(xiàn)有技術(shù)中，聚乙二醇修飾的氧化石墨烯一般用作藥物載體，例如2008年Dai Hongjie課題組首次報道了利用PEG (聚乙二醇)修飾的氧化石墨烯作為難溶性含芳香結(jié)構(gòu)的抗癌藥物載體。他們首先將石墨氧化，獲得了尺寸小于50nm的納米氧化石墨烯 (Nanoscale Grapheneoxide, NG0)，再將生物相容的IOk的支鏈PEG接枝到NGO上。這種石墨烯材料在生理條件下包括在血清中具有良好的生物相容性和穩(wěn)定性。然后通過η-η堆垛等物理作用將抗癌藥物SN38 (喜樹堿衍生物)吸附在PEG化的NGO表面，形成石墨烯-藥
3物復(fù)合物。石墨烯具有單原子層厚度，其兩個基面都可以吸附藥物，所以具其他納米材料無可比擬的超高載藥率。同時，NG0-SN38復(fù)合物有良好的水溶性，表明其作為藥物載體可以用于難溶性藥物的增溶。且，其中的藥物具有高度活性，同時，該藥物載體沒有明顯的細(xì)胞毒性，具有良好的生物安全性。(參見LIU Ζ, ROBINSON J, SUN X Μ, et al. J Am Chem Soc, 2008， 130: 10876-10877)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種聚乙二醇修飾的氧化石墨烯，作為胰蛋白酶活化劑特異性地提高胰蛋白酶的活性和熱穩(wěn)定性。為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種聚乙二醇修飾的氧化石墨烯，包括氧化石墨烯、聚乙二醇，所述聚乙二醇的一端為氨基，另一端為亞氨基，且所述亞氨基的氮原子與氧化石墨烯中的羰基中的碳原子相連構(gòu)成酰胺鍵；其中，所述氧化石墨烯的高度為Inm 2nm，尺寸為IOnm 30nm ；所述聚乙二醇為分子量(重均分子量)1800 2200的直鏈聚乙二醇；優(yōu)選為分子量為2000的直鏈聚乙二醇；并且，所述聚乙二醇的重量百分比為25 ；35%，優(yōu)選為28 30%。上述聚乙二醇修飾的氧化石墨烯的制備方法可參照Liu Zhuang課題組的，(參見 YANG K, ZHANG S, et al. ACS ΝΑΝΟ, 2010)，區(qū)別僅在于將 NH2-IOk-力r_PEG_NH2 替換為 NH2-2k-7-PEG-NH2。上述聚乙二醇修飾的氧化石墨烯可以特異地提高胰蛋白酶的活性和熱穩(wěn)定性；因此，本發(fā)明要求保護(hù)上述聚乙二醇修飾的氧化石墨烯作為胰蛋白酶的特異性活性劑的應(yīng)用；同時要求保護(hù)上述聚乙二醇修飾的氧化石墨烯作為胰蛋白酶的穩(wěn)定劑的應(yīng)用。由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)
1.本發(fā)明所述聚乙二醇修飾的氧化石墨烯合成簡單，并且能夠特異性提高胰蛋白酶的活性、熱穩(wěn)定；胰蛋白酶活性和穩(wěn)定性的增強(qiáng)能夠滿足其在生物醫(yī)學(xué)上的需求。


圖1是實施例一中所得GOjk-J-NH2-PEG的AFM圖； 圖2是實施例一中所得G0-2k-/-NH2-PEG的TGA圖3是實施例二中GOjkj-PEG-NH2對胰蛋白酶活力的影響； 圖4是實施例二中GOjkj-PEG-NH2對胰凝乳蛋白酶活力的影響； 圖5是實施例三中酪素作為底物時GOIkj-PEG-NH2對胰蛋白酶的熱穩(wěn)定性影響； 圖6是實施例三中血紅蛋白作為底物時G0-2k-/-PEG-NH2對胰蛋白酶的熱穩(wěn)定性影響。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述
實施例一制備胰蛋白酶特異性活化劑G0-2k4-NH2-PEG
用Ig膨脹石墨做最初始的原料，加入約30倍重量的氯化鈉固體研磨至無明顯可見顆粒狀物，加水抽濾，洗去氯化鈉，將研細(xì)的石墨烘干備用。在燒瓶中加入約30mL濃硫酸(98. 3%)，放入已烘干的研細(xì)石墨，室溫下攪拌8小時，然后將混合物置于冰浴中，加入約3g 高錳酸鉀，緩慢升溫至115°C，緩慢加入約150mL水，之后加入約10mL30%過氧化氫并攪拌， 離心除去上層水溶液，反復(fù)水洗至溶液不再出現(xiàn)沉淀為止。將5mL濃度為3mg/mL的氧化石墨烯懸濁液超聲30min得到澄清的氧化石墨烯水溶膠，然后按終濃度0. 12 g/mL加入NaOH 固體并在50°C水浴中攪拌4小時，之后加入濃鹽酸調(diào)整溶液pH值接近1。然后用蒸餾水反復(fù)進(jìn)行沖洗和離心純化，得到水溶性良好的堿化石墨烯水溶液。按終濃度:3mg/mL加入末端氨基化的直鏈聚乙二醇(NH2Ik-/-PEG-NH2)至堿化石墨烯水溶液(濃度為0. 5mg/ml)中， 超聲使之混合均勻，然后持續(xù)超聲半小時，并在第5分鐘加入約Img EDC，在第30分鐘時加入約2.5mgEDC。將混合物攪拌過夜即可。然后通過IOkDa的超濾柱水洗除去未結(jié)合上的 NH2-2k-7-PEG-NH2,即可得到末端氨基化直鏈聚乙二醇修飾的石墨烯(聚乙二醇修飾的氧化石墨烯 G0-2k-/-NH2-PEG)。對上述聚乙二醇修飾的氧化石墨烯進(jìn)行原子力顯微鏡(AFM)分析，得圖1，從圖可知聚乙二醇修飾的氧化石墨烯尺寸是10nm-30nm，高度為lnm-2nm。對上述聚乙二醇修飾的氧化石墨烯進(jìn)行熱重分析，得圖2，從圖可知PEG的重量百分?jǐn)?shù)為30%左右(占整個G0-2k-/-PEG-NH2的比例)。實施例二 研究實施例一所得聚乙二醇修飾的氧化石墨烯對胰蛋白酶活性的影響。將實施例一所得聚乙二醇修飾的氧化石墨烯G0-2k4-PEG-NH2和胰蛋白酶相互作用，室溫下混合16min，然后測定酶的活性參見文獻(xiàn)。(參見Lv Min, Su Y Y, et al. Preparative Biochemistry & Biotechnology， 2009, 39: 429 — 438)。胃
20 μ 1 的 0. lmg/ml 的胰蛋白酶分別與 20 μ 1 的無菌水，0. 2mg/mL,0. 3mg/mL,0. 4mg/mL, 0. 5mg/mL、0. 6mg/mL 的 G0-2k-7-NH2-PEG 在 25°C 混合 16min,再力口 10 μ 1 5XPBS 補(bǔ)充到 50 μ 1，再加50 μ 1的5mg/ml的底物酪素進(jìn)行酶解反應(yīng)40°C，IOmin,用100 μ 1的TCAC0. 4Μ) 終止反應(yīng)，離心，取100 μ 1上清液禾口 100 μ 1福林酚(1:1)至IJ 500 μ 1的Na2CO3 (0. 4M)40°C, 20min顯色反應(yīng)，測OD68tl。結(jié)果如圖3所示胰蛋白酶活性的增強(qiáng)呈現(xiàn)出濃度依賴性，當(dāng)G0-2k-/-PEG_NH2終濃度分別為 40、60、80、100、120μ g/mL 時，分別增加了約 40%、90%、140%、160%、180% ；因此， 上述聚乙二醇修飾的氧化石墨烯GOjkW-PEG-NH2能夠增強(qiáng)胰蛋白酶的活性。同時，用胰凝乳蛋白酶驗證NH2Ik-廠PEG-NH2修飾的石墨烯對胰酶活性的增強(qiáng)是特異性的。這種酶和胰蛋白酶同屬于絲氨酸蛋白酶，又是同一個酶家族，結(jié)構(gòu)十分相似。在完全相同的情況下，將胰蛋白酶換成上述胰凝乳蛋白酶，做完全相同的實驗；具體方法為 20 μ 1的0. 06mg/ml的胰凝乳蛋白酶分別與20 μ 1的無菌水、0. 15mg/mL、0. 2mg/mL,0. 25mg/ mL 的 G0-2k-7-NH2-PEG 在 25°C混合 16min,再加 10 μ 1 5 XPBS 補(bǔ)充到 50ul，再力口 50 μ 1 的 5mg/ml的底物酪素進(jìn)行酶解反應(yīng)40°C，lOmin，用100 μ 1的TCA (0. 4Μ)終止反應(yīng)，離心，取 100 μ 1 上清液禾口 100 μ 1 福林酚(1:1)到 500 μ 1 的 Na2CO3 (0. 4Μ) 40°C，20min 顯色反應(yīng)， 測od68『結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明GOjkW-PEG-NH2對胰凝乳蛋白酶的活性并沒有明顯的影響。因此，上述結(jié)果表明G0-2kj-PEG-NH2未能提高胰凝乳蛋白酶的活性，能夠特異性增強(qiáng)胰蛋白酶的活性，因此其對胰蛋白酶活性的提高是特異性的，可作為胰蛋白酶的特異激活劑。實施例三研究實施例一所得聚乙二醇修飾的氧化石墨烯對胰蛋白酶熱穩(wěn)定性的影響。將胰蛋白酶和GOjkj-NH2-PEG的混合溶液在70°C和80°C分別變性5min，然后按照上述酶活測定方法測定胰蛋白酶的活性，具體為
(1)當(dāng)酪素作為底物時，將胰蛋白酶和60-21^-/^^6-冊2按照質(zhì)量體積比(mg/mL)為 1:2的比例混合。此外，胰蛋白酶和無菌水，胰蛋白酶和NH2jk-/-PEG-NH質(zhì)量體積比(mg/ mL)為1:10也相互混合，然后將混合液在70°C和80°C時放置5分鐘，然后再按照上述測活方法測定胰蛋白酶的活性。結(jié)果如圖5所示沒有G0-2k4-PEG-NH2的情況下，胰蛋白酶幾乎變性，沒有活性。然而，在G0-2k4-PEG-NH2的保護(hù)作用下，胰蛋白酶能夠較高得保持自己的活性。在70°C時，達(dá)到87%，80°C時，達(dá)到55%。(2)當(dāng)血紅蛋白作為底物時，按照同樣的方法同樣的比例，將混合液放入70°C和 80°C，然后再測定胰蛋白酶的活性。結(jié)果如圖6所示沒有G0-2k4-PEG-NH2的情況下，在 70°C和80°C時，胰蛋白酶的活性分別降低到5%和4%。而GOjkj-PEG-NH2存在情況下，在 70°C和80°C時，胰蛋白酶能夠維持活性到70%和60%。上述結(jié)果表明在以酪素或血紅蛋白分別作底物時，G0-2k-7-PEG-NH2都能夠增強(qiáng)胰蛋白酶的穩(wěn)定性，這說明G0-2k4-PEG-NH2對胰蛋白酶的熱穩(wěn)定增強(qiáng)與底物無關(guān)。綜上所述，G0-2k-7-PEG-NH2這種活化劑能夠特異地顯著地提高胰蛋白酶的活性， 并且在惡劣的條件下，也能保護(hù)胰蛋白酶的活性，而且這種對胰蛋白酶的熱穩(wěn)定性的增強(qiáng)與底物是無關(guān)的。這種材料能夠使胰蛋白酶在生物醫(yī)學(xué)上發(fā)揮極大的用處。
權(quán)利要求
1.一種聚乙二醇修飾的氧化石墨烯，包括氧化石墨烯、聚乙二醇，所述聚乙二醇的一端為氨基，另一端為亞氨基，且所述亞氨基的氮原子與氧化石墨烯中的羰基中的碳原子相連構(gòu)成酰胺鍵；其特征在于，所述氧化石墨烯的高度為Inm 2nm，尺寸為IOnm 30nm ；所述聚乙二醇為分子量1800 2200的直鏈聚乙二醇，并且，所述聚乙二醇的重量百分比為 25 35%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述聚乙二醇修飾的氧化石墨烯，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量2000。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述聚乙二醇修飾的氧化石墨烯，其特征在于，所述聚乙二醇的重量百分比為28 30%。
4.權(quán)利要求1所述聚乙二醇修飾的氧化石墨烯作為胰蛋白酶的特異性活性劑的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述聚乙二醇修飾的氧化石墨烯作為胰蛋白酶的穩(wěn)定劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可用作胰蛋白酶活化劑的聚乙二醇修飾的氧化石墨烯，本發(fā)明公開了一種聚乙二醇修飾的氧化石墨烯，包括氧化石墨烯、聚乙二醇，所述聚乙二醇的一端為氨基，另一端為亞氨基，且所述亞氨基的氮原子與氧化石墨烯中的羰基中的碳原子相連構(gòu)成酰胺鍵；所述氧化石墨烯的高度為1nm～2nm，尺寸為10nm～30nm；所述聚乙二醇為分子量1800～2200的直鏈聚乙二醇；所述聚乙二醇的重量百分比為25～35%。本發(fā)明所述聚乙二醇修飾的氧化石墨烯合成簡單，并且能夠特異性提高胰蛋白酶的活性、熱穩(wěn)定；胰蛋白酶活性和穩(wěn)定性的增強(qiáng)能夠滿足其在生物醫(yī)學(xué)上的需求。
文檔編號C12N9/76GK102432865SQ20111022722
公開日2012年5月2日 申請日期2011年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月9日
發(fā)明者劉莊, 姚凱, 張帥, 彭睿, 李述湯, 楊凱, 金麗玲 申請人:蘇州大學(xué)