專利名稱：?jiǎn)紊嘀囟縫cr方法測(cè)量染色體端粒絕對(duì)長(zhǎng)度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因測(cè)量技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種單色多重定量PCR方法測(cè)量染色體端粒絕對(duì)長(zhǎng)度的方法。
背景技術(shù)：
端粒(tolemere)是染色體末端的DNA重復(fù)序列，在人的染色體中是(TTAGGG)的串聯(lián)重復(fù)。端粒是染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，在正常人體細(xì)胞中，可隨著細(xì)胞分裂而逐漸縮短。端粒的作用是保持染色體的完整性。細(xì)胞分裂一次，由于DNA復(fù)制時(shí)的方向必須從5'方向到3'方向，DNA每次復(fù)制端粒就縮短一點(diǎn)。一旦端粒消耗殆盡，染色體則易于突變而導(dǎo)致動(dòng)脈硬化和某些癌癥。近年來(lái)報(bào)道了多種端粒長(zhǎng)度測(cè)量方法，包括DNA印跡法 (Southern blot, SB)、雜交保護(hù)分析法(hybridization protection assay, ΗΡΑ)、流式細(xì)胞計(jì)量-熒光原位雜交(Flow-FISH)、定量PCR。端粒結(jié)構(gòu)的特殊性和復(fù)雜性對(duì)分析帶來(lái)很大不便，特別是高度重復(fù)序列和各種空間結(jié)構(gòu)使得測(cè)量的精度有所降低。DNA印跡法除了提供染色體所有端粒長(zhǎng)度外，還包括部分亞端粒區(qū)長(zhǎng)度，所以這種方法雖然能夠檢測(cè)絕對(duì)長(zhǎng)度，但是結(jié)果比端粒的實(shí)際長(zhǎng)度偏長(zhǎng)。這種方法不能進(jìn)行大通量的檢測(cè)，耗時(shí)耗力、需要大量DNA樣品。總的來(lái)說(shuō)，Southern blot是應(yīng)用最廣泛的方法，被稱為金標(biāo)準(zhǔn)。流式細(xì)胞計(jì)量-熒光原位雜交(Flow-FISH)，這種技術(shù)相當(dāng)復(fù)雜，且需要完整的細(xì)胞才能夠分析端粒長(zhǎng)度。定量PCR方法簡(jiǎn)便、快捷、大通量、靈敏度高、重復(fù)性好、用DNA 量少等優(yōu)點(diǎn)。但是不能絕對(duì)量。雖然有文章報(bào)道用PCR方法測(cè)量端粒的絕對(duì)長(zhǎng)度但是精度只有0. 67。由于現(xiàn)有技術(shù)中缺乏有效的端粒絕對(duì)長(zhǎng)度測(cè)量方法，本發(fā)明因此而來(lái)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種單色多重定量PCR方法測(cè)量染色體端粒絕對(duì)長(zhǎng)度的方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中測(cè)量染色體端粒絕對(duì)長(zhǎng)度耗時(shí)耗力、需要大量DNA樣品以及測(cè)量精度低等問(wèn)題。為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的這些問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種單色多重定量PCR方法測(cè)量染色體端粒絕對(duì)長(zhǎng)度的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)設(shè)計(jì)并篩選染色體端粒的引物和用于擴(kuò)增內(nèi)參基因的單拷貝基因引物，要求端粒基因的引物和單拷貝基因引物的Tm值的差值在10 20°C范圍內(nèi)；(2)以SEQ No 1的端粒序列和SEQ No 2的單拷貝基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)序列，通過(guò)外標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；(3)提取模板DNA，將模板DNA加入具有步驟(1)的引物的PCR反應(yīng)體系中對(duì)模板 DNA中目標(biāo)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(4)以標(biāo)準(zhǔn)曲線為對(duì)照通過(guò)定量PCR方法測(cè)定染色體端粒絕對(duì)長(zhǎng)度。優(yōu)選的，所述方法中端粒的引物具有SEQ No :3和SEQ No :4的正反向核苷酸序列。
優(yōu)選的，所述方法中單拷貝基因引物具有SEQ No 5 10的正反向核苷酸序列。優(yōu)選的，所述方法中進(jìn)行PCR擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系包括PCR緩沖液、dNTPs、熒光染料、MgCl2, TaqDNA聚合酶、模板DNA，所述PCR反應(yīng)體系終濃度組成為PCR緩沖液終濃度1 IOX ；
dNTPs0. 1 0. 5mM ；
引物序列終濃度為0. 1 ΙμΜ;
模板DNA0. 1 1. 5ng/ μ L ；
TaqDNA聚合酶0. 01 0. IOU/μ L ；
MgCl2終濃度為1 3mM ；
熒光染料0. 5 3X。
優(yōu)選的，所述PCR反應(yīng)體系終濃度組成為
PCR緩沖液終濃度1 5X ；
dNTPs0. 2 0. 3mM ；
引物序列終濃度為0. 5 IM ；
模板DNA0. 5 1. Ong/ μ L ；
TaqDNA聚合酶0. 02 0. 06U/ μ L ；
MgCl2終濃度為2 3mM ；
熒光染料0. 5 2X。
優(yōu)選的，所述熒光染料選自STOR Green I ；所述PCR緩沖液包括Tri
硫酸銨，氯化鎂；_20°C下pH值在8. 0-9. 0間。優(yōu)選的，所述方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增的條件包括92 97°C預(yù)變性4 15min ；92 97°C變性10 30s，45 55°C退火10 30s，1 5個(gè)循環(huán)；92 97°C變性10 30s，60 70°C退火10 30s，70 75°C延伸10 30s進(jìn)行信號(hào)捕獲，30 40個(gè)循環(huán)。優(yōu)選的，所述方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增的條件包括第一階段95°C預(yù)變性15分鐘；第二階段94°C變性15秒，49°C退火15秒，共兩個(gè)循環(huán)；第三階段94°C變性15秒，62°C退火10 秒，74°C延伸15秒信號(hào)捕獲；84°C退火10秒，88°C延伸15秒后再一次信號(hào)捕獲，共32個(gè)循環(huán)。優(yōu)選的，所述多孔PCR板為96孔PCR板或384孔PCR板，標(biāo)準(zhǔn)序列放入標(biāo)準(zhǔn)樣品孔用作標(biāo)準(zhǔn)曲線。本發(fā)明旨在能夠大通量高精度的測(cè)量端粒的絕對(duì)長(zhǎng)度。1.方法說(shuō)明如下(1)提取基因組DNA。(2)特異設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物端粒引物序列Telg :5’ -ACACTAAGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT-3，；Tm :73.5°CTe 1 c :5，-TGTTAGGTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTAACA-3，；Tm :71°C單拷貝基因引物(內(nèi)參)選用其中一對(duì)引物作為內(nèi)參引物Albu :5，-CGGCGGCGGGCGGCGCGGGCTGGGCGGaaatgctgcacagaatccttg-3，；Tm :88. 9°CAlbd :5，-GCCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCGgaaaagcatggtcgcctgtt-3，；Tm :90.5°C
4
36B4F :5’ -CGGCGGCGGGCGGCGCGGGCTGGGCGGCAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC-3’ ；Tm 90. 6"C。36B4R :5，-GCCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3，；Tm
89.I0Cb-globin F :5，-CGGCGGCGGGCGGCGCGGGCTGGGCGGcttcatccacgttcaccttg-3，；Tm 90 0Cb-globin R :5，-GCCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCGgaggagaagtctgccgtt-3，Tm:
90.6 °C(3)兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)序列端粒標(biāo)準(zhǔn)序列Telomere standard :5，-(TTAGGG)14-3，單拷貝基因標(biāo)準(zhǔn)序列Albminstandard 5’ -CGGCGGCGGGCGGCGCGGGCTGGGCGGAAATGCTGCACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCCGGCGGGACGGGCGCGGCGGGCCGGGC-3’本發(fā)明將端粒擴(kuò)增的引物和單基因擴(kuò)增的引物能夠在同一個(gè)反應(yīng)管中反應(yīng)而且互相之間又沒(méi)有干擾，我們是利用兩對(duì)引物Tm值得差異，在低溫條件下只擴(kuò)增端粒而不擴(kuò)增單基因，在高溫條件下只擴(kuò)增單基因而不擴(kuò)增端粒。提高單基因擴(kuò)增的Tm值是通過(guò)在單拷貝基因引物5’端加上高GC的序列實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明進(jìn)行測(cè)量端粒的絕對(duì)長(zhǎng)度是需要引入端粒和單拷貝基因的標(biāo)準(zhǔn)序列的。本發(fā)明通過(guò)引物的不完全匹配設(shè)計(jì)，引物對(duì)與端粒序列并不完全匹配但仍能以端粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增，而且這種引物克服了引物二聚體的形成。本發(fā)明對(duì)內(nèi)參序列引物進(jìn)行了設(shè)計(jì)，內(nèi)參序列要求在染色體上只有一個(gè)拷貝，并且引物的5’端設(shè)計(jì)了高GC的序列，以增加引物的Tm值。本發(fā)明還涉及標(biāo)準(zhǔn)序列的應(yīng)用， 設(shè)計(jì)了已知長(zhǎng)度和分子個(gè)數(shù)的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)序列，為計(jì)算端粒長(zhǎng)度提供重要參數(shù)。本發(fā)明進(jìn)行定量PCR溫度循環(huán)分兩個(gè)階段，高溫階段和低溫階段。應(yīng)用于端粒長(zhǎng)度測(cè)量取得了很好的效果，與端粒測(cè)量的金標(biāo)準(zhǔn)(Southern Blot) 方法相比，具有很強(qiáng)的一致性(R2 = 0. 869).本發(fā)明方法具有穩(wěn)定、易操作、快速、高通量的特點(diǎn)，適用于商業(yè)化。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“引物”是指一種寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成，它可以作為在一定條件下誘發(fā)DNA合成的起始點(diǎn)，在上述條件下可以誘發(fā)合成與核酸鏈相互補(bǔ)的引物擴(kuò)增產(chǎn)物，即在四種不同的三磷酸脫氧核糖核酸及一種聚合試劑(即DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶)存在下，在一種合適的緩沖液并在合適的溫度下進(jìn)行上述合成。優(yōu)選的引物是單股寡脫氧核糖核苷酸。引物的合適長(zhǎng)度取決于該引物的設(shè)計(jì)用途，但在一般在15 25個(gè)核苷酸之間，較短的引物分子通常需要較低的溫度，從而與模板形成充分穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。 引物不必反應(yīng)模板的準(zhǔn)確序列，但必須充分互補(bǔ)，已與模板雜交并引發(fā)DNA合成。引物設(shè)計(jì)遵循以下原則①引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。②產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。③引物長(zhǎng)度一般在15 30堿基之間。④G+C含量在40% 60% 之間。⑤堿基要隨機(jī)分布。⑥引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。⑦引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。⑧引物5'端可以修飾。⑨引物3'端不可修飾。⑩引物3'端要避開密碼子的第3位。弓Li殳if 白勺I^ft1* Primer Premier 5, Beacon Designer 7。本發(fā)明所用引物通過(guò)亞磷酰胺三酯法合成，亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相鄰的核苷酸通過(guò)3' -5'磷酸二酯鍵連接。具體方法如下1、將預(yù)先連接在固相載體CPG上的活性基團(tuán)被保護(hù)的核苷酸與三氯乙酸反應(yīng)，脫去其5'-羥基的保護(hù)基團(tuán)DMT，獲得游離的 5'-羥基。2、合成DNA的原料，亞磷酰胺保護(hù)核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3'端被活化，5'-羥基仍然被DMT保護(hù)，與溶液中游離的5'-羥基發(fā)生縮合反應(yīng)。3、帶帽(capping)反應(yīng)，縮合反應(yīng)中可能有極少數(shù)5 ‘-羥基沒(méi)有參加反應(yīng)(少于2% )，用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)，這種短片段可以在純化時(shí)分離掉。4、在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯。經(jīng)過(guò)以上四個(gè)步驟，一個(gè)脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三氯乙酸脫去它的5'-羥基上的保護(hù)基團(tuán)DMT，重復(fù)以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去。最后通過(guò)氨水高溫處理，連接在CPG上的引物被切下來(lái)，通過(guò)OPC，PAGE等手段純化引物。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)中的方案，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是(1)與普通實(shí)時(shí)定量PCR相比，目的基因(端粒)與內(nèi)參基因(單拷貝基因)的反應(yīng)置于同一管中，消除了加樣誤差，使結(jié)果更準(zhǔn)確。精確度為0. 869。(2)通過(guò)引入標(biāo)準(zhǔn)序列代替基因組做標(biāo)準(zhǔn)曲線，能夠測(cè)量端粒的絕對(duì)長(zhǎng)度，突破了普通定量PCR只能測(cè)量端粒的相對(duì)長(zhǎng)度的局限。


下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述圖1為本發(fā)明進(jìn)行單色多重定量PCR方法測(cè)量染色體端粒絕對(duì)長(zhǎng)度的方法流程圖。圖2為獲得的端粒標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖3為獲得的單拷貝基因標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖4為方法靈敏度考察結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)上述方案做進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中采用的實(shí)施條件可以根據(jù)具體廠家的條件做進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實(shí)施條件通常為常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的條件。實(shí)施例1、引物的設(shè)計(jì)、合成弓I物設(shè)計(jì)是根據(jù)文獻(xiàn)通過(guò)亞磷酰胺三酯法合成。2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品反應(yīng)孔中用梯度稀釋的端粒和單拷貝基因的標(biāo)準(zhǔn)序列替代基因組DNA，為了彌補(bǔ)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)序列不足20ng要求，在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)孔中加入pBR322質(zhì)粒DNA，以使標(biāo)準(zhǔn)樣孔中有20ng的DNA。標(biāo)準(zhǔn)樣品孔用來(lái)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。以下分別進(jìn)行說(shuō)明端粒標(biāo)準(zhǔn)曲線將已知分子個(gè)數(shù)的合成的84聚體(TTAGGG) 14進(jìn)行系列稀釋，每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的重復(fù)數(shù)按如下的方法計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)序列的長(zhǎng)度是84bp (TTAGGG重復(fù)14次)，分子量(MW)為沈667. 2。單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)序列分子的質(zhì)量=分子量MW/阿伏伽德羅常數(shù)= 2. 6667X 104/6. 02 X IO23 = 0. 44X l(T19g。每個(gè)反應(yīng)中的最高濃度標(biāo)準(zhǔn)是60pg (60 X 10_12g)。因此，有60Χ1(Γ12/0. 44Χ1(Γ19 = 1.36 X IO9 個(gè)分子。在最高濃度標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中，端粒序列量計(jì)算如下1.36X 109X84(聚體長(zhǎng)度)= 1. 18X108kb通過(guò)梯度稀釋最高濃度標(biāo)準(zhǔn)獲得1. 18X10710 1. 18X 108/106的稀釋樣品系列 (系列1和系列2為重復(fù)系列)。標(biāo)準(zhǔn)曲線通過(guò)對(duì)這些系列稀釋樣品進(jìn)行qPCR分析作出。質(zhì)粒DNA(pBR322)需要添加到每一個(gè)反應(yīng)中，為了維持每個(gè)反應(yīng)管中有20ng的總 DNA量。這條標(biāo)準(zhǔn)曲線用于測(cè)量每個(gè)基因組樣品中端粒序列的長(zhǎng)度。單拷貝基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制單拷貝基因用于每個(gè)擴(kuò)增樣品的對(duì)照并確定每個(gè)樣品中基因組拷貝數(shù)。單拷貝基因的選擇對(duì)于結(jié)果的可靠性至關(guān)重要?？截悢?shù)的任何變化都可能影響端粒絕對(duì)長(zhǎng)度的測(cè)量。用白蛋白(albumin)、酸性核糖體磷酸蛋白(36B4)、球蛋白(b-globin)作為單拷貝基因。本實(shí)施例以albumin為例做標(biāo)準(zhǔn)曲線每個(gè)反應(yīng)的基因組拷貝數(shù)計(jì)算如下合成的albumin 寡聚體標(biāo)準(zhǔn)序列(CGGCGGCGGGCGGCGCGGGCTGGGCGGAAATGCTGCACAG AATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCCGGCGGGACGGGCGCGGCGGGCCGGGC)長(zhǎng)度是 98bp，分子量是 30610。單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)序列分子的質(zhì)量=3.061X 104/6. 02 X IO23 = 0. 508X l(T19g。最高濃度標(biāo)準(zhǔn)定為每個(gè)反應(yīng)200pgQ00X 10_12g)。則每個(gè)反應(yīng)中有 200Χ1(Γ12/0· 508Χ1(Γ19 = 1. 016 X IO9 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)序列。因?yàn)樵诙扼w基因組中，有兩個(gè)albumin拷貝，所以相當(dāng)于一個(gè)反應(yīng)中有 5. 08 X IO8個(gè)二倍體基因組。標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過(guò)qPCR檢測(cè)系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)濃度樣品(ΙΟ—1 10_6稀釋，系列1)獲得。質(zhì)粒DNA(pBR322)添加到每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品中，為了維持每個(gè)反應(yīng)管中有20ng的總 DNA。此標(biāo)準(zhǔn)曲線用于測(cè)量每個(gè)樣品中二倍體基因組的拷貝數(shù)。3、組織DNA的提取使用康為世紀(jì)的口腔拭子基因組DNA提取試劑盒提取口腔細(xì)胞基因組DNA，具體如下樣本采集使用棉簽在面頰內(nèi)擦拭10次。(為了保證樣本不被食物或者飲料污染， 取樣前30分鐘內(nèi)請(qǐng)勿進(jìn)食和飲水。)將在面頰內(nèi)擦拭過(guò)的棉簽轉(zhuǎn)置于2ml離心管中，用剪刀將棉簽部分從其桿上剪下，加入400 yl裂解緩沖液。DNA提取使用康為世紀(jì)的口腔拭子基因組DNA提取試劑盒，按照試劑盒操作說(shuō) 明，提取DNA。DNA 純化(若提取的 DNA，0D 值 A260/A230 :2. 0-2. 2 ；A260/A280 :1. 8-2. 0，沒(méi)有 在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，則需要此步驟)加入等體積的氯仿-異戊醇05 1)，向下翻轉(zhuǎn)離心管 5min以充分混勻，13000rpm離心IOmin小心吸出上清液至另一 1. 5ml離心管；加入1/10體 積的醋酸鈉(PH5. 2，3M)，再加入兩倍上清液體積的無(wú)水乙醇，輕輕搖勻，沉淀DNA13000rpm 離心3min，輕輕倒去上清液，加入70 %乙醇洗一次，13000rpm,離心3min，去上清液，倒置 5-10min (倒置時(shí)間視DNA塊狀沉淀大小以及DNA干燥的速度決定，注意DNA不可太干燥，否 則DNA將難以被溶解，但離心管管壁的乙醇一定要除去)；加入30-60ul消毒三蒸水，用吸 管吹打使DNA充分溶解。4、PCR條件優(yōu)化在96孔板上加樣，在一個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品反應(yīng)孔中加入如下試劑(每一個(gè)樣有三個(gè)重 復(fù)) -
權(quán)利要求
1.一種單色多重定量PCR方法測(cè)量染色體端粒絕對(duì)長(zhǎng)度的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)設(shè)計(jì)并篩選染色體端粒的引物和用于擴(kuò)增內(nèi)參基因的單拷貝基因引物，要求端粒基因的引物和單拷貝基因引物的Tm值的差值在10 20°C范圍內(nèi)；(2)以SEQNo 1的端粒序列和SEQ No 2的單拷貝基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)序列，通過(guò)外標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；(3)提取模板DNA，將模板DNA加入具有步驟(1)的引物的PCR反應(yīng)體系中對(duì)模板DNA 中目標(biāo)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(4)以標(biāo)準(zhǔn)曲線為對(duì)照通過(guò)定量PCR方法測(cè)定染色體端粒絕對(duì)長(zhǎng)度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中端粒的引物具有SEQNo:3和 SEQ No 4的正反向核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中單拷貝基因引物具有SEQNo 5 10的正反向核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中進(jìn)行PCR擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系包括PCR緩沖液、dNTPs、熒光染料、MgCl2, TaqDNA聚合酶、模板DNA，所述PCR反應(yīng)體系終濃度組成為PCR緩沖液終濃度為1 IOX ；dNTPs 0. 1 0. 5mM ；引物序列終濃度為0. 1 1 μ M ；模板 DNA 0. 1 1. 5ng/ μ L ；TaqDNA 聚合酶 0. 01 0. IOU/ μ L ；MgCl2 終濃度為1 3mM;熒光染料 0. 5 3X。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)體系終濃度組成為PCR緩沖液終濃度1 5X ；dNTPs 0. 2 0. 3mM ；引物序列終濃度為0. 5 IM ； 模板 DNA 0. 5 1. Ong/ μ L ；TaqDNA 聚合酶 0. 02 0. 06U/ μ L ；MgCl2 終濃度為 2 3mM;熒光染料 0. 5 2X。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述熒光染料選自STORGreen I ；所述PCR 緩沖液包括Tris-Cl，氯化鉀，硫酸銨，氯化鎂；-20°C下pH值在8. 0-9. 0間。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增的條件包括92 97°C預(yù)變性4 15min ；92 97°C變性10 30s，45 55°C退火10 30s，1 5個(gè)循環(huán)； 92 97°C變性10 30s，60 70°C退火10 30s，70 75°C延伸10 30s進(jìn)行信號(hào)捕獲，30 40個(gè)循環(huán)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增的條件包括第一階段95°C預(yù)變性15分鐘；第二階段94°C變性15秒，49°C退火15秒，共兩個(gè)循環(huán)；第三階段94°C變性15秒，62°C退火10秒，74°C延伸15秒信號(hào)捕獲；84°C退火10秒，88°C延伸 15秒后再一次信號(hào)捕獲，共32個(gè)循環(huán)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述多孔PCR板為96孔PCR板或384孔 PCR板，標(biāo)準(zhǔn)序列放入標(biāo)準(zhǔn)樣品孔用作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種單色多重定量PCR方法測(cè)量染色體端粒絕對(duì)長(zhǎng)度的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)設(shè)計(jì)并篩選染色體端粒的引物和用于擴(kuò)增內(nèi)參基因的單拷貝基因引物，要求端?；虻囊锖蛦慰截惢蛞锏腡m值的差值在10～20℃范圍內(nèi)；(2)以SEQNo1的端粒序列和SEQNo2的單拷貝基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)序列，通過(guò)外標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；(3)提取模板DNA，將模板DNA加入具有步驟(1)的引物的PCR反應(yīng)體系中對(duì)模板DNA中目標(biāo)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(4)以標(biāo)準(zhǔn)曲線為對(duì)照通過(guò)定量PCR方法測(cè)定染色體端粒絕對(duì)長(zhǎng)度。該方法消除了加樣誤差，使結(jié)果更準(zhǔn)確，突破了普通定量PCR只能測(cè)量端粒的相對(duì)長(zhǎng)度的局限。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102296113SQ201110230858
公開日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2011年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月12日
發(fā)明者楊林, 楊楠, 艾洪新 申請(qǐng)人:楊林, 楊楠