專利名稱：利用羔羊超排卵母細(xì)胞生產(chǎn)體外胚胎的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用羔羊卵巢中卵母細(xì)胞在體外生產(chǎn)胚胎的方法，特別是一種利用羔羊超數(shù)排卵后卵巢中卵母細(xì)胞在體外生產(chǎn)胚胎的方法。
背景技術(shù)：
目前牧業(yè)生產(chǎn)中，新品種的繁育決定著經(jīng)濟效益高低。而有實際生產(chǎn)中，一些優(yōu)良品種在推廣繁育過程中往往受到來自各方面因素的影響，一是優(yōu)良品種胚胎供體或來源的不足，二是胚胎生產(chǎn)平臺或載體的的瓶頸，都會制約新的優(yōu)良品種的推廣和繁育。因此，一種利用羔羊卵巢中卵母細(xì)胞在體外生產(chǎn)胚胎的方法，特別是一種利用羔羊超數(shù)排卵后卵巢中卵母細(xì)胞在體外生產(chǎn)胚胎的方法就應(yīng)運而生。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用羔羊卵巢中卵母細(xì)胞在體外生產(chǎn)胚胎的方法，特別是一種利用羔羊超數(shù)排卵后的卵巢中卵母細(xì)胞在體外生產(chǎn)胚胎的方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的
成熟液配制在M199培養(yǎng)基原液中加入8 12Pg/mL FSH(促卵泡素)、8 12Pg/mL LH (促黃體素)、0. 5 1. 5Pg/mL E2 (雌激素)、0. 05 0. 15mmol/L β -巰基乙醇和10 20%ESS (發(fā)情母羊血清)，培養(yǎng)液在使用前制作成40 60 μ L/滴的成熟液微滴，在培養(yǎng)箱中平衡1 汕。卵母細(xì)胞培養(yǎng)將采集到的COCs (卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體)移入成熟液微滴中，每滴成熟液微滴中移入10 20枚卵母細(xì)胞為好，在38 39°C、4 6% CO2、飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)22 ^h，COCs中的卵母細(xì)胞成熟為卵子。上述COCs最好先在成熟液中洗滌1 2次后，再移入成熟液微滴中進行培養(yǎng)。受精液配配制在SOF(輸卵管合成液)中加入0.1 0.2 ymol/L青霉胺 (Penicillamine)、?！?1 0. 2 μ mol/L 亞?；撬?Hypotaurine)、5 10 μ g/mL 肝素 (!feparin)和2 10% ESS (發(fā)情母羊血清)，在受精前1 池，在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中制做受精液滴，每滴40 60 μ L。所述受精液滴在制作后最好覆蓋上石蠟油。精液處理取新鮮或者解凍后的精液，稀釋成4Χ IO6 6Χ106 /mL的精子稀釋液，在所述的每個受精液滴中移入8 12 μ L精子稀釋液，將受精液滴連同培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板一同放入(X)2培養(yǎng)箱中平衡池以上。上述的精液，最好采用Percoll梯度(45%/90%)離心法收集活力較好的精子，之后再進行稀釋。體外受精將成熟液中的成熟卵子按每個受精液滴中30 50個成熟卵子的比例移入受精液滴中，然后放入在38 39°C、4 6% CO2、飽和濕度環(huán)境的培養(yǎng)箱中進行體外受精并培養(yǎng)18 Mh。
所述的成熟卵子最好在HSOF中洗滌2 4次后，再移入受精液滴中進行體外受精和培養(yǎng)。上述的受精液滴在移入成熟卵子后之后最好再在每滴受精液滴中加入5 10 μ L 精子稀釋液。上述成熟液中培養(yǎng)的成熟卵子在使用前最好將卵子間相互分離，所述分離用采用移液器在原成熟盤中反復(fù)吹打培養(yǎng)成熟COCs方法實現(xiàn)。胚胎發(fā)育液為配制在SOF中加入1 3% BME(EAA)(必需氨基酸)、1 3% MEM(NEAA)(非必需氨基酸)、0. 5 5% BSA(胎牛血清)、0. 05 0. 15 mmol/mL Glutamine (谷氨酰胺)和0. 4 6 mg/mL Mys-Inositol (肌醇)，將胚胎發(fā)育液按照50-100 μ 1的容積在培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿上做成液滴狀，在培養(yǎng)箱中平衡i-池。所述胚胎發(fā)育液滴在制作后最好覆蓋上石蠟油。受精卵子培養(yǎng)精子與卵子受精培養(yǎng)18 24h后，除去受精卵子周圍的顆粒細(xì)胞和附著的精子，以15-40枚/滴的密度放入胚胎發(fā)育液滴中，在飽和濕度的培養(yǎng)箱中，38 39°C、4 6%ω2下進行體外培養(yǎng)6-8天，受精卵子即發(fā)育為胚胎，此時即可將成活的胚胎殖入代孕母羊體內(nèi)發(fā)育成胎兒。上述的卵母細(xì)胞的采集最好選擇性成熟前的雌性羔羊進行采集，優(yōu)先選擇出生后4-10周齡的性成熟前的雌性羔羊。采集前最好經(jīng)PMSG_FSH(孕馬血清聯(lián)合促卵泡素)作超數(shù)排卵處理2 5次，每次間隔12小時；手術(shù)法取出并固定卵巢，注射器抽取COCs (卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明特別是利用幼年羔羊超排處理后采集的卵母細(xì)胞進行體外胚胎生產(chǎn)，具有卵母細(xì)胞采集數(shù)量多、胚胎生產(chǎn)效率高、培育羔羊后代所需時間短等優(yōu)點，因而在大規(guī)模體外胚胎生產(chǎn)應(yīng)用中具有優(yōu)勢。本發(fā)明對于解決當(dāng)前優(yōu)質(zhì)胚胎來源不足的問題還具有重要意義，特別是利用優(yōu)良母羔羊品種體外大量生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)胚胎并進行胚胎移植生產(chǎn)后代，有利于縮短優(yōu)良品種繁殖的世代間隔，大幅提高畜群的遺傳改良速度與生產(chǎn)效率。若配合克隆及轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)技術(shù)， 除可提供家畜遺傳育種、免疫及細(xì)胞生物學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的研究之用外，還可以加速改善優(yōu)良基因性狀種群的選拔、生產(chǎn)高價生物醫(yī)藥產(chǎn)品供人類臨床醫(yī)學(xué)之用，具有廣闊的應(yīng)用前景。
具體實施例方式試劑下列試劑均使用SIGMA公司產(chǎn)品M199培養(yǎng)液(Gibco)，促卵泡素(FSH) (Vetr印harm)，促黃體素(LH) LH和孕馬血清(PMSG)(寧波)。實施例1
卵母細(xì)胞的采集選用4-10周齡的性成熟前綿羊母羔羊。采集前連續(xù)兩天注射4次 FSH，每次40mg，最后一次還同時注射500IU PMSG，通過手術(shù)法暴露出卵巢，并固定。采用含有采卵液(M199原液+25mmol/L HEPES+0. 2% BSA (胎牛血清)的IOml注射器抽吸卵巢上的卵泡，抽吸完畢將含有COCs的液體放置在采卵液中，并統(tǒng)計卵母細(xì)胞數(shù)量。成熟液配制在M199培養(yǎng)基原液中加入lOPg/mL FSH (促卵泡素)、lOPg/mL LH (促黃體素)、lPg/mL E2 (雌激素)、0. lmmol/L β -巰基乙醇，并按體積加入20%ESS (發(fā)情母羊血清)，在培養(yǎng)箱中平衡I。卵母細(xì)胞培養(yǎng)所述培養(yǎng)液制作成50μ L/滴的成熟液微滴，將采集到的COCs先在成熟液中洗滌2次，移入成熟液微滴中，每滴成熟液微滴中以20枚卵母細(xì)胞，在38. 5°C、5% CO2、飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)Mh，COCs中的卵母細(xì)胞成熟為卵子。精子處理在SOF(輸卵管合成液)中加入0. 1 μ mol/L青霉胺(Penicillamine)、 0. 1 μ mol/L 亞牛磺酸(Hypotaurine)UO μ g/mL 肝素(H印arin)，按體積再加入 10% ESS 作為受精液，在受精前I，在培養(yǎng)皿中制做受精液滴，每滴50 μ L，受精液滴在制作后覆蓋上石蠟油，取冷凍精液，在39°C下解凍，采用Percoll梯度(45%、60%、90%)離心法收集活力較好的精子，稀釋成5 X IO6 /mL的精子稀釋液，在所述的每個受精液滴中移入10 μ L精子稀釋液，將受精液滴連同培養(yǎng)皿一同放入( 培養(yǎng)箱中平衡池以上。體外受精將成熟液中的成熟卵子采用移液器在原成熟盤中反復(fù)吹打的方法將卵子間相互分離，在HSOF中洗滌2 4次后，按每個受精液滴中50個成熟卵子的比例移入受精液滴中，之后再在每滴受精液滴中加入10 μ L精子稀釋液，然后放入在38. 5°C、5% CO2、 飽和濕度環(huán)境的培養(yǎng)箱中進行體外受精并培養(yǎng)M小時。胚胎發(fā)育液配制在SOF中，按體積加入2% BME (EAA)(必需氨基酸)、洲 MEM(NEAA)(非必需氨基酸)和覬BSA (胎牛血清)，按重量加入0. Immo 1/mL Glutamine (谷氨酰胺)和3 mg/mL Mys-Inositol (肌醇)，將胚胎發(fā)育液按照50 μ L的容積在培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿上做成液滴狀并覆蓋上石蠟油，在培養(yǎng)箱中平衡1-池。受精卵子培養(yǎng)精子與卵子受精培養(yǎng)后，除去受精的卵子周圍的顆粒細(xì)胞和精子， 在胚胎發(fā)育液中清洗2次后，以20枚/滴的密度移入胚胎發(fā)育液滴中，在飽和濕度的培養(yǎng)箱中，38. 5°C,5%C02進行體外培養(yǎng)7天后，卵子即發(fā)育為胚胎，此時即可將成活的胚胎殖入代孕母羊體內(nèi)。
實施例2 卵母細(xì)胞的采集選用4-10周齡的性成熟前綿羊母羔羊。采集前連續(xù)兩天注射2次FSH，每次50mg，最后一次還同時注射400IU PMSG，通過手術(shù)法暴露出卵巢，并固定。采用含有采卵液(M199原液+20mmol/L HEPES+0. 3% BSA (胎牛血清)的IOml注射器抽吸卵巢上的卵泡，抽吸完畢將含有COCs的液體放置在采卵液中，并統(tǒng)計卵母細(xì)胞數(shù)量。成熟液配制在M199培養(yǎng)基原液中加入8Pg/mL FSH(促卵泡素)、12Pg/mL LH (促黃體素)、1. 5“g/mL E2 (雌激素)、0· 15mmol/L β -巰基乙醇，并按體積加入20%ESS(發(fā)情母羊血清)，使用前制作成40 μ L/滴的成熟液微滴，在培養(yǎng)箱中平衡lh。卵母細(xì)胞培養(yǎng)將采集到的COCs先在成熟液中洗滌1次后，在每滴成熟液微滴中移入10枚卵母細(xì)胞，在38. 8°C、6% CO2、飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)22h。受精液配制在SOF (輸卵管合成液)中加入0· 2 μ mol/L青霉胺 (Penicillamine)、。· 1 μ mol/L 亞?；撬?Hypotaurine)、5 μ g/mL 肝素(Heparin)禾口(按體積)10% ESS，作為受精液，受精前Ih在培養(yǎng)板中制做受精液滴，每滴60 μ L，所述受精液滴在制作后覆蓋上石蠟油，將受精液滴連同培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板一同放入CO2培養(yǎng)箱中平衡池。精子處理取新鮮或者解凍后的精液，采用Percoll梯度(50%、70%、90%)離心法收集活力較好的精子，稀釋成6Χ IO6 /mL的精子稀釋液，在上述的每個受精液滴中移入 8μ L精子稀釋液。
體外受精將成熟液中的成熟卵子，用移液器在原成熟盤中反復(fù)吹打?qū)⒙炎娱g相互分離，將成熟卵子在HSOF (濃度為10 mmol/L. HEPES [4-羥乙基哌嗪乙硫磺酸]的SOF 液)中洗滌2次后，按每個受精液滴中40個成熟卵子的比例移入受精液滴中，之后再在每滴受精液滴中加入5 μ L精子稀釋液，然后置于38°C、4%C02的飽和濕度的培養(yǎng)箱中受精20h。胚胎發(fā)育液配制在SOF中，按體積加入1% BME (EAA)(必需氨基酸)、1% MEM(NEAA)(非必需氨基酸)5% BSA (胎牛血清)，按重量加入0.15 mmol/mL Glutamine (谷氨酰胺)和6 mg/mL Mys-Inositol (肌醇)，將胚胎發(fā)育液按照80 μ 1的容積在培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿上做成液滴狀并覆蓋上石蠟油，在培養(yǎng)箱中平衡lh。受精卵子培養(yǎng)精子與卵子受精培養(yǎng)，除去受精的卵子周圍的顆粒細(xì)胞和精子，在胚胎發(fā)育液中清洗2次后，在每個胚胎發(fā)育液滴中移入30枚卵子，在飽和濕度的培養(yǎng)箱中， 38 39°C、4 6%0)2進行體外培養(yǎng)6_8天后，卵子即發(fā)育為胚胎，此時即可將成活的胚胎殖入代孕母羊體內(nèi)。實施例3 卵母細(xì)胞的采集選用4-10周齡的性成熟前綿羊母羔羊。采集前連續(xù)兩天注射4次FSH，每次50mg，最后一次還同時注射500IU PMSG，通過手術(shù)法暴露出卵巢，并固定。采用含有采卵液(M199原液+30mmol/L HEPES+0. 2% BSA (胎牛血清)的IOml注射器抽吸卵巢上的卵泡，抽吸完畢將含有COCs的液體放置在采卵液中。成熟液配制在M199培養(yǎng)基原液中加入12Pg/mL FSH(促卵泡素)、8Pg/mL LH (促黃體素)、1. 5“g/mL E2 (雌激素)、0· 15mmol/L β -巰基乙醇，并按體積加入20%ESS(發(fā)情母羊血清)，使用前制作成60 μ L/滴的成熟液微滴，在培養(yǎng)箱中平衡池。卵母細(xì)胞培養(yǎng)將采集到的COCs先在成熟液中洗滌2次，在每滴成熟液微滴中移入15枚卵母細(xì)胞，在38. 3°C、6% CO2、飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)^h，COCs中的卵母細(xì)胞成熟為卵子。受精液配制在SOF (輸卵管合成液)中加入0· 15 μ mol/L青霉胺 (Penicillamine)、。· 15 μ mol/L 亞?；撬?Hypotaurine)、6 μ g/mL 肝素(Heparin)和(按體積)8% ESS，作為受精液，受精前1. ，在培養(yǎng)皿中制做受精液滴，每滴40 μ L，在受精液滴上覆蓋上石蠟油，將受精液滴連同培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板一同放入CO2培養(yǎng)箱中平衡4h以上。精子處理取新鮮精液稀釋成4X IO6 /mL的精子稀釋液，在所述的每個受精液滴中移入SyL精子稀釋液。體外受精將成熟液中的成熟卵子，用移液器在原成熟盤中反復(fù)吹打?qū)⒙炎娱g相互分離，將成熟卵子在HSOF (濃度為8 mmol/L HEPES [4-羥乙基哌嗪乙硫磺酸]的SOF液)
中洗滌2 4次后，按每個受精液滴中40個成熟卵子的比例移入受精液滴中，之后再在每滴受精液滴中加入5μ L精子稀釋液，然后置于39°C、6%0)2的飽和濕度的培養(yǎng)箱中受精 20h。胚胎發(fā)育液配制在SOF中，按體積加入3% BME (EAA)(必需氨基酸)、1. 5% MEM(NEAA)(非必需氨基酸)和4% BSA(胎牛血清)，按重量加入0.15 mmol/mL Glutamine (谷氨酰胺)和ang/mL Mys-Inositol (肌醇)，將胚胎發(fā)育液按照100 μ 1的容積在培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿上做成液滴狀并在發(fā)育液滴上覆蓋石蠟油，在培養(yǎng)箱中平衡池。受精卵子培養(yǎng)以35枚/滴的密度移入胚胎發(fā)育液滴中，在飽和濕度的培養(yǎng)箱中， 38°C、4%C02進行體外培養(yǎng)8天后，卵子即發(fā)育為胚胎，此時即可將成活的胚胎殖入代孕母羊體內(nèi)。實施例4 卵母細(xì)胞的采集選用4-10周齡的性成熟前綿羊母羔羊。采集前連續(xù)兩天注射3次FSH，每次45mg，最后一次還同時注射450IU PMSG，通過手術(shù)法暴露出卵巢，并固定。采用含有采卵液(M199原液+15mmol/L HEPES+0. 5% BSA (胎牛血清)的IOml注射器抽吸卵巢上的卵泡，抽吸完畢將含有COCs的液體放置在采卵液中。成熟液配制在M199培養(yǎng)基原液中加入9Pg/mL FSH(促卵泡素)、llPg/mL LH (促黃體素)、1. 2“g/mL E2 (雌激素)、0. 08mmol/L β -巰基乙醇，并按體積加入18%ESS(發(fā)情母羊血清)，使用前制作成60 μ L/滴的成熟液微滴，在培養(yǎng)箱中平衡池。卵母細(xì)胞培養(yǎng)將采集到的COCs先在成熟液中洗滌2次后，在每滴成熟液微滴中移入20枚卵母細(xì)胞，在39°C、5. 5% CO2、飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)23h，COCs中的卵母細(xì)胞成熟為卵子。受精液配制在SOF (輸卵管合成液)中加入0. 1 2 μ mol/L青霉胺 (Penicillamine)、?！?2 μ mol/L 亞牛石黃酸(Hypotaurine)、5 μ g/mL 月干素(H印arin)禾口(按體積)6% ESS,作為受精液，在受精前1. 2h,在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中制做受精液滴，每滴50 μ L，受精液滴在制作后覆蓋上石蠟油，將受精液滴連同培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板一同放入(X)2培養(yǎng)箱中平衡5h以上。精子處理取新鮮精液稀釋成5 X IO6 /mL的精子稀釋液，在所述的每個受精液滴中移入10 μ L精子稀釋液。體外受精將成熟液中的成熟卵子按每個受精液滴中30個成熟卵子的比例移入受精液滴中，之后再在每滴受精液滴中加入 ο μ L精子稀釋液，然后置于38. 6°C、4. 5%C02 的飽和濕度的培養(yǎng)箱中受精Mh。胚胎發(fā)育液配制在SOF中，按體積加入1. 2% BME (EAA)(必需氨基酸)、3% MEM (NEAA)(非必需氨基酸)和5% BSA(胎牛血清)，按重量加入0.15 mmol/mL Glutamine (谷氨酰胺)和6 mg/mL Mys-Inositol (肌醇)，將胚胎發(fā)育液按照60 μ 1的容積在培養(yǎng)皿上做成液滴狀并在發(fā)育液滴上覆蓋石蠟油，在培養(yǎng)箱中平衡池。受精卵子培養(yǎng)精子與卵子受精培養(yǎng)M小時后，除去受精的卵子周圍的顆粒細(xì)胞和精子，在胚胎發(fā)育液中清洗1-2次后，以20枚/滴的密度將受精卵子移入胚胎發(fā)育液滴中，在飽和濕度的培養(yǎng)箱中，38. 7V、5. 5%C02進行體外培養(yǎng)6天后，卵子即發(fā)育為胚胎，此時即可將成活的胚胎殖入代孕母羊體內(nèi)。實施例5 卵母細(xì)胞的采集選用4-10周齡的性成熟前綿羊母羔羊。采集前連續(xù)兩天注射2次FSH，每次50mg，最后一次還同時注射550IU PMSG，通過手術(shù)法暴露出卵巢，并固定。采用含有采卵液(M199原液+25mmol/L HEPES+0. 5% BSA (胎牛血清)的IOml注射器抽吸卵巢上的卵泡，抽吸完畢將含有COCs的液體放置在采卵液中。成熟液配制在M199培養(yǎng)基原液中加入dOPg/mL FSH(促卵泡素)、(^g/mL LH (促黃體素)、01. 5Pg/mL E2 (雌激素)、00· 15mmol/L β -巰基乙醇，并按體積加入20%ESS (發(fā)情母羊血清)，使用前制作成60 μ L/滴的成熟液微滴，在培養(yǎng)箱中平衡1.證。卵母細(xì)胞培養(yǎng)將采集到的COCs先在成熟液中洗滌2次，在每滴成熟液微滴中移入20枚卵母細(xì)胞，在38. 5°C、5% CO2、飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)22h，COCs中的卵母細(xì)胞成熟為卵子。
受精液配制在SOF (輸卵管合成液)中加入0. 1 μ mol/L青霉胺 (Penicillamine)、?！?2 μ mol/L 亞牛磺酸(Hypotaurine)、5 μ g/mL 肝素(H印arin)禾口(按體積》％ ESS,作為受精液，在受精前池，在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中制做受精液滴，每滴60 μ L，所述受精液滴在制作后覆蓋上石蠟油，將受精液滴連同培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板一同放入ω2培養(yǎng)箱中平衡汕。精子處理取冷凍的精液，在39°C水浴中解凍后采用Percoll梯度(45%、60%、 75%、90%)離心法收集活力較好的精子，稀釋成5 X IO6 /mL的精子稀釋液，在所述的每個受精液滴中移入12 μ L精子稀釋液。體外受精將成熟液中的成熟卵子，用移液器在原成熟盤中反復(fù)吹打?qū)⒙炎娱g相互分離后，將成熟卵子在HSOF (濃度為8 mmol/L. HEPES[4-羥乙基哌嗪乙硫磺酸]的SOF 液)中洗滌3次，按每個受精液滴中40個成熟卵子的比例移入受精液滴中，之后再在每滴受精液滴中加入10 μ L精子稀釋液，置于38. 8°C、4. 2%C02的飽和濕度的培養(yǎng)箱中受精18h。胚胎發(fā)育液配制在SOF中，按體積加入1.5% BME(EAA)(必需氨基酸)、1.5% MEM (NEAA)(非必需氨基酸)和1% BSA(胎牛血清)，按重量加入0.1 mmol/mL Glutamine (谷氨酰胺)和5 mg/mL Mys-Inositol (肌醇)，將胚胎發(fā)育液按照50 μ 1的容積在培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿上做成液滴狀并在發(fā)育液滴上覆蓋石蠟油，在培養(yǎng)箱中平衡lh。受精卵子培養(yǎng)精子與卵子受精培養(yǎng)18 M小時后，除去受精的卵子周圍的顆粒細(xì)胞和精子，將受精的卵子在胚胎發(fā)育液中清洗2次，以15枚/滴的密度移入胚胎發(fā)育液滴中，在飽和濕度的培養(yǎng)箱中，39°C、6%C02進行體外培養(yǎng)6天后，卵子即發(fā)育為胚胎，此時即可將成活的胚胎殖入代孕母羊體內(nèi)。實施例6 卵母細(xì)胞的采集選用4-10周齡的性成熟前綿羊母羔羊。采集前連續(xù)兩天注射2次FSH，每次50mg，最后一次還同時注射550IU PMSG，通過手術(shù)法暴露出卵巢，并固定。采用含有采卵液(M199原液+35mmol/L HEPES+0. 5% BSA (胎牛血清)的IOml注射器抽吸卵巢上的卵泡，抽吸完畢將含有COCs的液體放置在采卵液中。成熟液配制在M199培養(yǎng)基原液中加入12Pg/mL FSH(促卵泡素)、12Pg/mL LH (促黃體素)、l“g/mL E2 (雌激素)、0. 15mmol/L β -巰基乙醇，并按體積加入18%ESS(發(fā)情母羊血清)，使用前制作成^yL/滴的成熟液微滴，在培養(yǎng)箱中平衡池；
卵母細(xì)胞培養(yǎng)將采集到的COCs先在成熟液中洗滌2次后，在每滴成熟液微滴中移入 20枚卵母細(xì)胞，在38°C、6% CO2、飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)沈11，COCs中的卵母細(xì)胞成熟為卵子。受精液配制在SOF (輸卵管合成液)中加入0· 15 μ mol/L青霉胺 (Penicillamine),0. 12 μ mol/L 亞牛磺酸(Hypotaurine)、6 μ g/mL 肝素(H印arin)和(按體積)6% ESS,作為受精液，在受精前l(fā)h，在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中制做受精液滴，每滴55 μ L，所述受精液滴在制作后覆蓋上石蠟油，將受精液滴連同培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板一同放入CO2培養(yǎng)箱中平衡池。精子處理取新鮮或者解凍后的精液，采用Percoll梯度(50%、60%、70%、80%、 90%)離心法收集活力較好的精子，稀釋成5. 5X IO6 /mL的精子稀釋液，在每個受精液滴中移入10 μ L精子稀釋液。體外受精將成熟液中的成熟卵子，用移液器在原成熟盤中反復(fù)吹打?qū)⒙炎娱g相互分離，將成熟卵子在HSOF中洗滌4次后，按每個受精液滴中40個成熟卵子的比例移入受精液滴中，之后再在每滴受精液滴中加入8μ L精子稀釋液，然后置于38°C、6%0)2的飽和濕度的培養(yǎng)箱中受精20h。胚胎發(fā)育液配制在SOF中，按體積加入3% BME (EAA)(必需氨基酸)、 3% MEM(NEAA)(非必需氨基酸)和05% BSA (胎牛血清)，按重量加入0.05 mmol/mL Glutamine (谷氨酰胺)和0. 5 mg/mL Mys-Inositol (肌醇)，將胚胎發(fā)育液按照70 μ 1的容積在培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿上做成液滴狀并在發(fā)育液滴上覆蓋石蠟油，在培養(yǎng)箱中平衡lh。受精卵子培養(yǎng)精子與卵子受精培養(yǎng)18 M小時后，除去受精的卵子周圍的顆粒細(xì)胞和精子，在胚胎發(fā)育液中清洗1-2次，以30枚/滴的密度移入胚胎發(fā)育液滴中，在飽和濕度的培養(yǎng)箱中，38. 5°C,5%C02進行體外培養(yǎng)7天后，卵子即發(fā)育為胚胎，此時即可將成活的胚胎殖入代孕母羊體內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種利用羔羊超排卵母細(xì)胞生產(chǎn)體外胚胎的方法，其特征在于通過以下過程實現(xiàn)成熟液配制在M199培養(yǎng)基原液中加入8 12Pg/mL FSH(促卵泡素)、8 12Pg/mL LH (促黃體素)、0. 5 1. 5Pg/mL E2 (雌激素)、0. 05 0. 15mmol/L β -巰基乙醇和10 20%ESS (發(fā)情母羊血清)，培養(yǎng)液在使用前制作成40 60 μ L/滴的成熟液微滴，在培養(yǎng)箱中平衡1 : ；卵母細(xì)胞培養(yǎng)將采集到的COCs (卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體)移入成熟液微滴中，每滴成熟液微滴中移入10 20枚卵母細(xì)胞，在38 39°C、4 6% CO2、飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)22 26h, COCs中的卵母細(xì)胞成熟為卵子；受精液配配制在SOF (輸卵管合成液)中加入0. 1 0. 2 μ mol/L青霉胺 (Penicillamine)、。· 1 0· 2 μ mol/L 亞?；撬?Hypotaurine)、5 10 μ g/mL 肝素 (!feparin)和2 10% ESS (發(fā)情母羊血清)，在受精前1 池，在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中制做受精液滴，每滴40 60yL ；精液處理取新鮮或者解凍后的精液，稀釋成4X IO6 6X106 /mL的精子稀釋液，在所述的每個受精液滴中移入8 12 μ L精子稀釋液，將受精液滴連同培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板一同放入(X)2培養(yǎng)箱中平衡池以上；體外受精將成熟液中的成熟卵子按每個受精液滴中30 50個成熟卵子的比例移入受精液滴中，然后放入在38 39°C、4 6% CO2、飽和濕度環(huán)境的培養(yǎng)箱中進行體外受精并培養(yǎng)18 24h ；胚胎發(fā)育液為配制在SOF中加入1 3% BME(EAA)(必需氨基酸)、1 3% MEM(NEAA)(非必需氨基酸)、0. 5 5% BSA(胎牛血清)、0. 05 0. 15 mmol/mL Glutamine (谷氨酰胺)和0. 4 6 mg/mL Mys-Inositol (肌醇)，將胚胎發(fā)育液按照50-100 μ 1的容積在培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿上做成液滴狀，在培養(yǎng)箱中平衡1- ；受精卵子培養(yǎng)精子與卵子受精培養(yǎng)18 24h后，除去受精卵子周圍的顆粒細(xì)胞和附著的精子，以15-40枚/滴的密度放入胚胎發(fā)育液滴中，在飽和濕度的培養(yǎng)箱中，38 39°C、4 6%C02下進行體外培養(yǎng)6-8天。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用羔羊超排卵母細(xì)胞生產(chǎn)體外胚胎的方法，其特征在于 所述COCs先在成熟液中洗滌1 2次后，再移入成熟液微滴中進行培養(yǎng)；所述的成熟卵子在HSOF中洗滌2 4次后，再移入受精液滴中進行體外受精和培養(yǎng)；所述受精卵子在胚胎發(fā)育液中清洗1-2次后，再放入胚胎發(fā)育液滴中進行培養(yǎng)；所述HSOF為含有8 12 mmol/L hepes (4-羥乙基哌嗪乙硫磺酸)的S0F。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用羔羊超排卵母細(xì)胞生產(chǎn)體外胚胎的方法，其特征在于所述受精液滴和胚胎發(fā)育液滴在制作后覆蓋上石蠟油。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用羔羊超排卵母細(xì)胞生產(chǎn)體外胚胎的方法，其特征在于所述的精液采用Percoll梯度(45%/90%)離心法收集活力較好的精子，之后再進行稀釋。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用羔羊超排卵母細(xì)胞生產(chǎn)體外胚胎的方法，其特征在于 所述的精液采用Percoll梯度(45%/90%)離心法收集活力較好的精子，之后再進行稀釋。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用羔羊超排卵母細(xì)胞生產(chǎn)體外胚胎的方法，其特征在于所述的受精液滴在移入成熟卵子之后再在每滴受精液滴中加入5 10 μ L精子稀釋液。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用羔羊超排卵母細(xì)胞生產(chǎn)體外胚胎的方法，其特征在于 所述的受精液滴在移入成熟卵子之后再在每滴受精液滴中加入5 10 μ L精子稀釋液。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用羔羊超排卵母細(xì)胞生產(chǎn)體外胚胎的方法，其特征在于 所述的受精液滴在移入成熟卵子之后再在每滴受精液滴中加入5 10 μ L精子稀釋液。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用羔羊超排卵母細(xì)胞生產(chǎn)體外胚胎的方法，其特征在于 所述的受精液滴在移入成熟卵子后之后再在每滴受精液滴中加入5 10 μ L精子稀釋液。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用羔羊超排卵母細(xì)胞生產(chǎn)體外胚胎的方法，其特征在于選擇性成熟前的雌性羔羊進行卵母細(xì)胞的采集。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種羔羊超排卵母細(xì)胞生產(chǎn)體外胚胎的方法，通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的將從羔羊體內(nèi)采集到的卵母細(xì)胞在成熟液中進行體外培養(yǎng)成熟為卵子，再經(jīng)體外受精和培養(yǎng)，使卵子發(fā)育為胚胎，即可將成活的胚胎移植到代孕母羊體內(nèi)進行繁育。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明特別是利用幼年羔羊超排處理后采集的卵母細(xì)胞進行體外胚胎生產(chǎn)，具有卵母細(xì)胞采集數(shù)量多、胚胎生產(chǎn)效率高、培育羔羊后代所需時間短等優(yōu)點，因而在大規(guī)模體外胚胎生產(chǎn)應(yīng)用中具有優(yōu)勢。
文檔編號C12N5/073GK102296047SQ20111023296
公開日2011年12月28日 申請日期2011年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月13日
發(fā)明者萬鵬程, 代蓉, 倪建宏, 劉長彬, 張賓, 石國慶, 石文艷, 郭洪 申請人:新疆農(nóng)墾科學(xué)院