專利名稱：一種用高碘酸鈉氧化法固定化磷脂酶A₁的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種固定化磷脂酶A1的方法。
背景技術：
磷脂酶A1是一類可以水解磷脂Sn-I位酯鍵獲得2_?；?溶血磷脂和脂肪酸的酶，廣泛存在于動植物和微生物中。磷脂酶A1不僅具有脂肪酶活性而且還同時具有磷脂酶活性，但是在一定的反應體系中，會優(yōu)先表現(xiàn)出一種特定的酶活，價格低廉的磷脂酶A1在工業(yè)上具有巨大的應用價值。固定化酶技術是通過物理和/或化學作用將水溶性的游離酶分子束縛在一定的區(qū)間內(nèi)(通常在非水溶性載體上)，用簡單的分離方法(如離心沉降)即可回收并反復使用，這樣改良的酶即稱為固定化酶。固定化酶的制備、結構與性質及固定化酶反應器的研制、生產(chǎn)與各有關應用技術，是固定化酶體系的主要內(nèi)容。固定化酶技術現(xiàn)在已經(jīng)成為酶工程領域中最為活躍的研究方向之一，因此對固定化酶的研究也就越來越多。常用的固定化方法主要有四種即包埋法、交聯(lián)法、吸附法和共價法。目前，國內(nèi)外關于磷脂酶 A1的固定化研究很少，且相關的應用研究主要集中在酶法脫膠方面。近年來由于直接利用自然酶進行工業(yè)化生產(chǎn)一般是不可行的，自然酶混溶在反應體系中不僅不易分離回收，而且酶的制取一般較困難，且成本高昂，難以反復或連續(xù)使用， 為了解決上述問題，固定化酶技術越來越受到人們的關注。酶可以通過吸附法固定在膜上，但吸附法固定的酶不牢固，易流失?；瘜W交聯(lián)法是通過共價鍵達到載體與酶結合的目的，因而固定的酶比較牢固。由于纖維素濾紙表面含有大量的羥基，容易改性而與酶共價結合，而采用高碘酸鈉進行氧化可使纖維素濾紙表面的羥基氧化成醛基，使固定化后的酶穩(wěn)定性及重復使用性增強。因此，纖維素濾紙是固定化酶的良好載體，被廣泛地應用于固定化酶和作為色譜支持物來分離和純化敏感的生物活性物質。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是針對自然酶混溶在反應體系中不僅不易分離回收，而且酶的制取一般較困難，且成本高昂，難以反復或連續(xù)使用等問題，而提出的用高碘酸鈉氧化法來進行固定化磷脂酶A1的方法。所述目的是通過如下方案實現(xiàn)的—種用高碘酸鈉氧化法固定化磷脂酶A1的方法，取一張含有羥基的膜懸浮于 0. 01 0. 3mol/L的高碘酸鈉溶液中，室溫下置于搖床中活化30 lOOmin，取出立即用去離子水洗至中性，吸干水分；然后將含有羥基的膜置于平皿中，在5 35°C條件下，分別與 0. 01 0. 09g/mL的酶液和pH為5. 8的磷酸鹽緩沖液，加入體積濃度0. 05 0. 6%戊二醛進行交聯(lián)反應1 6h，交聯(lián)反應結束后將所述含有羥基的膜懸浮于體積濃度為的氫硼化鈉溶液中，4°C反應20 40min，然后用HAI溶液、KCl溶液和水分別洗滌三次，晾干剪碎即得固定化磷脂酶~。
固定化條件優(yōu)選為高碘酸鈉濃度為0. 01 0. 09mol/L,活化時間31 49min， 溫度6 10°C，酶液濃度0. 01 0. 03g/mL，交聯(lián)時間1 2h，交聯(lián)劑戊二醛濃度0. 05 0. 15%。固定化條件優(yōu)選為高碘酸鈉濃度為0. 1 0. 19mol/L,活化時間50 69min，溫度11 25 °C，酶液濃度0. 04 0. 05g/mL,交聯(lián)時間3 4h，交聯(lián)劑戊二醛濃度0. 16 0. 28%。固定化條件優(yōu)選為高碘酸鈉濃度為0. 2 0. 29mol/L,活化時間70 99min，溫度26 34°C，酶液濃度0. 06 0. 08g/mL,交聯(lián)時間5 6h，交聯(lián)劑戊二醛濃度0. 29 0. 58%。固定化條件優(yōu)選為高碘酸鈉濃度為0. 15mol/L,活化80min，與濃度為0. 05g/ml 的酶液、PH為5. 8的磷酸鹽緩沖溶液于戊二醛體積濃度0. 4%，溫度4°C下，交聯(lián)4h時。利用高碘酸鈉氧化法固定化磷脂酶A1中，高碘酸鈉具有將表面具有大量羥基的濾紙表面羥基氧化成醛基的作用，根據(jù)醛基含量越高，與酶的交聯(lián)率越大的特性固定化磷脂酶A1，提高了酶在反應體系中的活性和穩(wěn)定性，調節(jié)和控制酶的活性與選擇性，從而有利于酶的回收，最終得到的固定化酶活為4. 8U/cm2，所得到的固定化酶的活力較常規(guī)固定化方法有所提高。本發(fā)明所述方法對自然酶混溶在反應體系中分離回收容易，酶的制取容易，成本低廉，可反復或連續(xù)使用。


圖1是用本發(fā)明方法固定化磷脂酶A1與游離酶在不同溫度下酶活力曲線圖。圖2是用本發(fā)明方法固定化磷脂酶A1與游離酶在不同PH值下酶活力曲線圖。圖3是重復使用次數(shù)對用本發(fā)明方法固定化磷脂酶A1相對酶活力的影響曲線圖。圖4是高碘酸鈉氧化后的纖維素濾紙膜的SEM圖。圖5是用本發(fā)明方法，高碘酸鈉氧化后的固定化酶酶表面結構的SEM圖。
具體實施例方式下面結合附圖詳細闡述本發(fā)明優(yōu)選的實施方式。實施例一一種用高碘酸鈉氧化法固定化磷脂酶A1的方法，取一張纖維素濾紙膜懸浮于IOml 濃度為0. 01 0. 3mol/L的高碘酸鈉溶液中，室溫下置于搖床中搖動30 lOOmin，取出立即用去離子水洗至中性，吸干水分；然后取Icm2纖維素濾紙膜置于平皿中，在5 35°C條件下，分別與0. 01 0. 09g/mL的酶液和pH為5. 8的磷酸鹽緩沖液，加入體積濃度0. 05 0. 6%戊二醛進行交聯(lián)反應1 6h，交聯(lián)反應結束后將所述纖維素濾紙膜懸浮于IOml體積濃度為1 %的氫硼化鈉溶液中，40C反應20 40min，然后用0. Imol的HAI溶液、2mol的KCl 溶液和水分別洗滌三次，晾干剪碎即得固定化磷脂酶~。 用所述方法得到的固定化磷脂酶A1與游離酶進行對比，分別在不同溫度條件下測定酶活，如圖1所示。由圖1可知，固定化酶的最適反應溫度為35°C，而自由酶的最適反應溫度為35°C，與自由酶相比固定化酶膜的最適反應溫度沒有明顯變化，并且它在50°C時所表現(xiàn)的酶活力還是比較穩(wěn)定的，說明固定化酶最適溫度范圍變寬。因此，固定化酶酶活變化較游離酶小，固定化酶比游離酶穩(wěn)定，不易失活。選擇不同的反應pH，用本發(fā)明所述方法進行固定化磷脂酶A1，測定固定化磷脂酶活力并與游離磷脂酶進行比較，如圖2所示。由圖2可知，游離磷脂酶的最適pH值為8. 0， 固定化磷脂酶的最適PH值為9. 0，向堿性偏移1. 0。固定化酶的最適pH為9. 0，顯示固定化酶比游離酶較耐堿，且固定化后的磷脂酶的PH變化范圍不大。以無油磷脂為溶質，以緩沖液溶解聚乙烯醇為溶劑。無油磷脂占磷酸鹽緩沖液溶解聚乙烯醇的比重為5%。以所述粉末磷脂為底物，對用本發(fā)明所述方法固定化磷脂酶A1 進行酶解反應，分別在相同條件下連續(xù)進行7批次操作，測定其酶活力，以第一批次酶活力作為100%計算相對活力，結果如圖3示。由圖3可知，固定化酶具有良好的操作穩(wěn)定性，在連續(xù)使用7個批次后其相對活力仍保持65%以上。采用本發(fā)明所述固定化條件將磷脂酶A1固定在纖維素濾紙膜上，用SEM對固定化后的磷脂酶A1進行掃描，如圖4和圖5所示。由圖像對比可知圖4中經(jīng)氧化后纖維素濾紙膜松散的呈纖維狀，因此有較大的空間來負載酶。圖5是將磷脂酶A1固定在纖維素濾紙膜表面制成的固定化酶膜，從圖中可看出用纖維素濾紙膜來固定磷脂酶，膜表面負載了部分酶，但由于氧化后的纖維素濾紙膜的羥基被氧化成醛基，所以酶被很好的固定在膜上。因此，進一步驗證了將酶固定在膜上更利于酶穩(wěn)定性。實施例二 本實施例與實施例一的區(qū)別在于，固定化條件為高碘酸鈉濃度為0.01 0. 09mol/L,活化時間31 49min，溫度6 10°C，酶液濃度0. 01 0. 03g/mL,交聯(lián)時間1 2h，交聯(lián)劑戊二醛濃度0. 05 0. 15 %。實施例三本實施例與實施例一的區(qū)別在于，固定化條件為高碘酸鈉濃度為0. 1 0. 19mol/L，活化時間50 69min，溫度11 25°C，酶液濃度0. 04 0. 05g/mL，交聯(lián)時間 3 4h，交聯(lián)劑戊二醛濃度0. 16 0.沘％。實施例四本實施例與實施例一的區(qū)別在于，固定化條件為高碘酸鈉濃度為0.2 0. 29mol/L,活化時間70 99min，溫度26 34°C，酶液濃度0. 06 0. 08g/mL,交聯(lián)時間 5 乩，交聯(lián)劑戊二醛濃度0.四 0. 58 %。實施例五本實施例與實施例一的區(qū)別在于，固定化條件為，纖維素濾紙膜在高碘酸鈉濃度為0. 15mol/L,活化80min，與濃度為0. 05g/ml的酶的pH為5. 8的磷酸鹽緩沖溶液于戊二醛濃度0. 4%，溫度4°C下，交聯(lián)4h時，獲得的固定化磷脂酶A1酶活最高為4. 8U/cm2。含有羥基的膜除了本發(fā)明所述纖維素濾紙膜之外，醋酸纖維素聚丙烯復合膜同樣可以實現(xiàn)本發(fā)明所述目的。但本發(fā)明不限于所列舉的含有羥基的膜，其它現(xiàn)有技術中含有羥基的膜，只要采本發(fā)明所述方法能夠實現(xiàn)所述目的，都在本專利的保護范圍之內(nèi)。上述實施方式只是對本專利的示例性說明而并不限定它的保護范圍，本領域人員還可以對其進行局部改變，只要沒有超出本專利的精神實質，都視為對本專利的等同替換， 都在本專利的保護范圍之內(nèi)。
權利要求
1.一種用高碘酸鈉氧化法固定化磷脂酶A1的方法，其特征在于取一張含有羥基的膜懸浮于0. 01 0. 3mol/L的高碘酸鈉溶液中，室溫下置于搖床中活化30 lOOmin，取出立即用去離子水洗至中性，吸干水分；然后將含有羥基的膜置于平皿中，在5 35°C條件下，分別與0. 01 0. 09g/mL的酶液和pH為5. 8的磷酸鹽緩沖液，加入體積濃度0. 05 0. 6%戊二醛進行交聯(lián)反應1 6h，交聯(lián)反應結束后將所述含有羥基的膜懸浮于體積濃度為的氫硼化鈉溶液中，4°C反應20 40min，然后用HAI溶液、Kcl溶液和水分別洗滌三次，晾干剪碎即得固定化磷脂酶~。
2.根據(jù)權利要求1所述的用高碘酸鈉氧化法固定化磷脂酶A1的方法，其特征在于固定化條件為高碘酸鈉濃度為0. 01 0. 09mol/L，活化時間31 49min，溫度6 10°C，酶液濃度0. 01 0. 03g/mL,交聯(lián)時間1 2h，交聯(lián)劑戊二醛濃度0. 05 0. 15%。
3.根據(jù)權利要求1所述的用高碘酸鈉氧化法固定化磷脂酶A1的方法，其特征在于固定化條件為高碘酸鈉濃度為0. 1 0. 19mol/L，活化時間50 69min，溫度11 25°C，酶液濃度0. 04 0. 05g/mL，交聯(lián)時間3 4h，交聯(lián)劑戊二醛濃度0. 16 0. 28%。
4.根據(jù)權利要求1所述的用高碘酸鈉氧化法固定化磷脂酶A1的方法，其特征在于固定化條件為高碘酸鈉濃度為0. 2 0. ^mol/L，活化時間70 99min，溫度沈 34°C，酶液濃度0. 06 0. 08g/mL，交聯(lián)時間5 6h，交聯(lián)劑戊二醛濃度0. 29 0. 58%。
5.根據(jù)權利要求1所述的用高碘酸鈉氧化法固定化磷脂酶A1的方法，其特征在于固定化條件為高碘酸鈉濃度為0. 15mol/L,活化80min，與濃度為0. 05g/ml的酶液、pH為5. 8 的磷酸鹽緩沖溶液于戊二醛體積濃度0. 4%，溫度4°C下，交聯(lián)4h。
全文摘要
本發(fā)明是針對自然酶混溶在反應體系中不僅不易分離回收，而且酶的制取一般較困難，且成本高昂，難以反復或連續(xù)使用等問題，而提出的用高碘酸鈉氧化法固定化磷脂酶A1的方法，包括高碘酸鈉的氧化活化和磷脂酶A1的固定化步驟。本發(fā)明中，高碘酸鈉具有將表面具有大量羥基的濾紙表面羥基氧化成醛基的作用，根據(jù)醛基含量越高，與酶的交聯(lián)率越大的特性固定化磷脂酶A1，提高了酶在反應體系中的活性和穩(wěn)定性，調節(jié)和控制酶的活性與選擇性，從而有利于酶的回收，最終得到的固定化酶活為4.8U/cm2，所得到的固定化酶的活力較常規(guī)固定化方法有所提高。
文檔編號C12N11/12GK102277348SQ20111023337
公開日2011年12月14日 申請日期2011年8月16日 優(yōu)先權日2011年8月16日
發(fā)明者于博涵, 于殿宇, 劉晶, 張佳寧, 張?zhí)m威, 時敏, 李志平, 李琳, 李越, 王雪, 陳曉慧, 馬鶯 申請人:哈爾濱工業(yè)大學