專利名稱：生物芯片上基于微乳液等溫?cái)U(kuò)增的dna測(cè)序方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種基于生物芯片的DNA測(cè)序方法，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的生物檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
人類全部基因序列的獲得有助于認(rèn)識(shí)許多遺傳疾病以及癌癥等疾病的致病機(jī)理， 對(duì)個(gè)體進(jìn)行疾病診斷、基因治療等新方法提供理論依據(jù)。并且根據(jù)基因組的序列，可以了解每個(gè)人DNA序列的差異以及不同個(gè)體對(duì)疾病的抵抗力，針對(duì)每個(gè)人的基因序列和特點(diǎn)進(jìn)行相應(yīng)的治療。根據(jù)基因組序列還可以預(yù)防個(gè)體可能發(fā)生的疾病，對(duì)疾病的預(yù)防診斷有較大的幫助。人類全基因組序列的獲得依賴于DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，目前完成一個(gè)哺乳動(dòng)物全基因組的測(cè)序大約需要上千萬美元和半年時(shí)間的工作。DNA測(cè)序成本正在以每二年降低一半的速度遞減，但是目前通用的DNA測(cè)序方法仍然成本較高，而且耗時(shí)較長(zhǎng)，滿足不了生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)發(fā)展的要求，同時(shí)也極大地制約了 DNA測(cè)序市場(chǎng)的發(fā)展。人們急需發(fā)展出快速、 廉價(jià)的個(gè)體化基因信息檢測(cè)技術(shù)?，F(xiàn)有的DNA各種檢測(cè)主要以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，耗時(shí)比較長(zhǎng)、步驟繁瑣、不能滿足生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)發(fā)展的要求，同時(shí)也制約了市場(chǎng)的發(fā)展。人們急需發(fā)展出快速、廉價(jià)的個(gè)體化基因信息檢測(cè)技術(shù)。Li等在2008年報(bào)道了 T7 gp4引發(fā)酶為基礎(chǔ)的全基因組擴(kuò)增的方式 (primase-based Whole Genome Amplification)，T7 gp4 引發(fā)酶為基礎(chǔ)的全基因組擴(kuò)增的方式簡(jiǎn)單、不需要引物和變性、在37度下恒溫60分鐘下即可以進(jìn)行(Li，Y. et al. Nucleic Acids Research, 2008，36，(13): e79)。這種擴(kuò)增方式特別對(duì)微量的DNA擴(kuò)增有較大的幫助，能短期內(nèi)對(duì)全基因組進(jìn)行擴(kuò)增。生物芯片是一種高通量的工具，能在較小的面積上固定大量的基因序列，把T7 gp4引發(fā)酶為基礎(chǔ)的全基因組擴(kuò)增的方式和生物芯片相結(jié)合將有助于推動(dòng)基因組測(cè)序的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于生物芯片的測(cè)序方法，能為高通量、高靈敏性、快速地進(jìn)行DNA測(cè)序。本發(fā)明方法包括以下步驟
1.對(duì)玻片表面進(jìn)行修飾，所述的修飾包括氨基修飾、醛基修飾或生物素修飾；
2.對(duì)待檢測(cè)的核酸片段進(jìn)行對(duì)應(yīng)的醛基、氨基或鏈親和素修飾；
3.將修飾后的待檢測(cè)的核酸片段和T7gp4引發(fā)酶混合物在微乳液中進(jìn)行擴(kuò)增；
4.把擴(kuò)增產(chǎn)物固定到修飾后的玻片上，為測(cè)序提供模板；
5.對(duì)固定在生物芯片上的模板進(jìn)行在片延伸測(cè)序。所述的核酸片段是脫氧核糖核酸、核糖核酸或它們的核酸序列擴(kuò)增產(chǎn)物、克隆產(chǎn)物中的一種。所述的T7 gp4引發(fā)酶混合物包括T7 gp4引發(fā)酶、緩沖液、谷氨酸、二硫蘇糖醇、氯化鎂、谷氨酸鉀、dNTP、牛血清蛋白、T7 gp2. 5、T7 DNA聚合酶、Τ7測(cè)序酶。所述的微乳液制備方法為
油相為 4. 5% Span 80，0. 40% Tween 80 和 0. 05% Triton X-100 其他為礦物油，液相溶液為T7 gp4引發(fā)酶混合物。液相溶液滴加到油相中，然后將油液混合物在超聲波儀中超聲5分鐘，形成穩(wěn)定的乳液。本發(fā)明的有益效果1.本發(fā)明把微乳液等溫?cái)U(kuò)增和生物芯片技術(shù)相結(jié)合，高通量 、快速、高靈敏地對(duì)核酸進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序。2.本發(fā)明這種模板制備方法，實(shí)施簡(jiǎn)單而且有效。


圖1為本發(fā)明方法示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。如圖1所示，本實(shí)施例步驟如下
1.對(duì)玻片表面進(jìn)行修飾對(duì)玻片表面進(jìn)行醛基修飾，用肥皂水洗凈玻片，1:1的甲醇與鹽酸浸泡30分鐘，雙蒸水清洗后用硫酸浸泡30分鐘，再用雙蒸水洗凈，95%乙醇清洗。對(duì)清洗后的玻片，用49:1的硅烷與95%乙醇浸泡30分鐘，乙醇與雙蒸水清洗吹干后，110度烘箱內(nèi)烘30分鐘，95%乙醇與雙蒸水清洗吹干后，用戊二醛與0. OlPB 4:1的比例浸泡2小時(shí)，用0. OlPB清洗，用95%乙醇清洗2次，最后用雙蒸水清洗4次。2.用做測(cè)序的擴(kuò)增產(chǎn)物的制備通過對(duì)滾環(huán)成環(huán)序列5’ -P-TAGCTAGAATCAAAAATG TTGAGTACGACGAATCTGTATGCTAATGCGGCGTGATGTATTATGCGTATAGAAATAATACAGA-3'，
5，-ACCTTTATGTCAACATTTTTGATTCTAGCTATCTGTATTATTTCACCTAGCTT-3，，濃度均為 IOMm 各4μ1混合后通過變性，自然復(fù)性后成環(huán)，通過用Τ4連接酶進(jìn)行連接。加入0. 3μ1的濃度為 IOOMm 的探針 5’ -Acry-T a(0ATTAGCATACAGATTCGTCGTACT_3’，通過變性，自然復(fù)性后雜交上。然后分別加入100XBSA，dNTP，Bst酶，40度30小時(shí)滾環(huán)。對(duì)產(chǎn)物濃度進(jìn)行測(cè)定， 取 IOng 的DNA產(chǎn)物，加入 20 μ pffGA Master Mix: (20mM Tris - Glutamate pH 7.5，6mM DTT, 9mM MgCl2, IOOmM potassium glutamate, 550 mM of each of the four dNTPs, 330 mM rATP, 440 mM rCTP, 0. 05 mg/ml BSA, 3. 6 mg T7 gp2. 5，0. 047 mg native T7 DNA polymerase, 0.47 mg T7 Sequenase, 0.45 mg T7 gp4, 25 ng nucleotide diphosphokinase, 15 ng pyrophosphatase, 750 ng creatine kinase, and IOmM creatine phosphate in a final reaction volume of 25 ml.) (Li, Y. et al. Nucleic Acids Research, 2008, 36，(13): e79)，在油相為 4. 5% Span 80，0. 40% Tween 80 和 0. 05% Triton X-100其他為礦物油，液相溶液滴加到油相中，然后將油水混合物在超聲波儀中超聲 5 分鐘，形成穩(wěn)定的乳液(Dressman，D. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 2003，100, 8817-8822)，進(jìn)行反應(yīng) 60 分鐘。3.把擴(kuò)增產(chǎn)物固定到修飾后的玻片上并進(jìn)行檢測(cè)上述擴(kuò)增產(chǎn)物用異丙醇沉淀并吹干后，固定在丙烯酰胺修飾的芯片上。用 μΜ Cy5-probe (5‘ -Cy5-GCGGCGTGATGTA) 與固定的產(chǎn)物雜交，經(jīng)掃描后，能獲得清晰以及熒光強(qiáng)度較高的圖像。對(duì)雜交后的滾環(huán)產(chǎn)物用淬滅劑(CuSO4) 5分鐘后，熒光完全淬滅(Gao，L. et al. Talanta. 2010, 81(1-2): 418-23.)。 4.在片延伸測(cè)序?qū)Υ銣绾蟮臐L環(huán)產(chǎn)物進(jìn)行延伸，用IXreaction buffer, 0. IU/ μ Therminator DNA聚合酶以及0. lPMCy5_dNTP混合液在65度10分鐘下進(jìn)行延伸。延伸堿基分別為T，T，A，T，G，C，G，T，延伸后能獲得清晰的熒光圖像，在這個(gè)基礎(chǔ)上繼續(xù)延伸 G，C，G，T后能獲得比較強(qiáng)的熒光圖像。
權(quán)利要求
1.生物芯片上基于微乳液等溫?cái)U(kuò)增的DNA測(cè)序方法，其特征在于該方法包括以下步驟步驟1.對(duì)玻片表面進(jìn)行修飾，所述的修飾包括氨基修飾、醛基修飾或生物素修飾； 步驟2.對(duì)待檢測(cè)的核酸片段進(jìn)行對(duì)應(yīng)的醛基、氨基或鏈親和素修飾； 步驟3.將修飾后的待檢測(cè)的核酸片段和T7 gp4引發(fā)酶混合物在微乳液中進(jìn)行擴(kuò)增； 步驟4.把擴(kuò)增產(chǎn)物固定到修飾后的玻片上，為測(cè)序提供模板； 步驟5.對(duì)固定在生物芯片上的模板進(jìn)行在片延伸測(cè)序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA測(cè)序方法，其特征在于步驟2中所述的核酸片段是脫氧核糖核酸、核糖核酸或它們的核酸序列擴(kuò)增產(chǎn)物、克隆產(chǎn)物中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA測(cè)序方法，其特征在于步驟3中所述的T7gp4引發(fā)酶混合物包括T7 gp4引發(fā)酶、緩沖液、谷氨酸、二硫蘇糖醇、氯化鎂、谷氨酸鉀、dNTP、牛血清蛋白、T7 gp2. 5、T7 DNA聚合酶、Τ7測(cè)序酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA測(cè)序方法，其特征在于步驟3中所述的微乳液其制備方法為油相為 4. 5% Span 80，0. 40% Tween 80 和 0. 05% Triton X-100 其他為礦物油，液相溶液為T7 gp4引發(fā)酶混合物，液相溶液滴加到油相中，然后將油液混合物在超聲波儀中超聲5分鐘，形成穩(wěn)定的乳液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物芯片上基于微乳液等溫?cái)U(kuò)增的DNA測(cè)序方法。本發(fā)明方法首先對(duì)玻片表面進(jìn)行修飾，對(duì)待檢測(cè)的核酸片段進(jìn)行對(duì)應(yīng)的醛基、氨基或鏈親和素修飾；其次將修飾后的待檢測(cè)的核酸片段和T7gp4引發(fā)酶混合物在微乳液中進(jìn)行擴(kuò)增；然后把擴(kuò)增產(chǎn)物固定到修飾后的玻片上，為測(cè)序提供模板；最后對(duì)固定在生物芯片上的模板進(jìn)行在片延伸測(cè)序。本發(fā)明把微乳液等溫?cái)U(kuò)增和生物芯片技術(shù)相結(jié)合,可高通量﹑快速﹑高靈敏地對(duì)核酸進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102260747SQ20111023383
公開日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月16日
發(fā)明者劉偉, 厲力華, 應(yīng)南嬌, 徐偉棟, 李宏, 王晟, 郭曉冬, 高力, 黃愛愛 申請(qǐng)人:杭州電子科技大學(xué)