專利名稱：豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌病二聯(lián)滅活疫苗及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明豬鏈球菌病O型)、副豬嗜血桿菌病G型、5型)二聯(lián)滅活疫苗屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌病二聯(lián)滅活疫苗，同時(shí)還涉及一種豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌病二聯(lián)滅活疫苗的制備方法；制備的豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌病二聯(lián)滅活疫苗主要適用于母豬，公豬及仔豬。
背景技術(shù)：
豬鏈球菌和副豬嗜血桿菌均是條件性致病菌，在機(jī)體免疫力降低的情況下容易導(dǎo)致疾病的發(fā)生。豬鏈球菌是引起豬鏈球菌病的重要致病性細(xì)菌，其共有33種血清型，其中豬鏈球菌2型可引起豬急性敗血癥、腦膜腦炎、關(guān)節(jié)炎和急性死亡，也可導(dǎo)致生豬從業(yè)人員中的特定人群感染和死亡(J Clin Microbiol, 2002,40 (8) J922 四四.)。2005年6 8月，四川省資陽市、內(nèi)江市等地區(qū)暴發(fā)了豬鏈球菌2型病，并導(dǎo)致204人感染，38人死亡(畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，38 (4) 367 381.)。副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,HPS)能引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎，可以影響從2周齡的哺乳仔豬到4月齡的育肥豬，主要在斷奶后和保育階段發(fā)病， 多見于5 8周齡的豬，發(fā)病率一般在10% 15%，嚴(yán)重時(shí)死亡率高達(dá)50%。其易與豬鏈球菌、豬繁殖與呼吸障礙綜合癥、支原體肺炎以及其它疾病發(fā)生混合或繼發(fā)感染，而且據(jù)多篇文獻(xiàn)報(bào)道，副豬嗜血桿菌病容易被誤診(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，M(I) :55 58)。因此，在臨床上控制副豬嗜血桿菌病不僅對本病本身而且也為其它疾病的控制，進(jìn)而提高豬群整體健康水平提供了保障。目前，市面上使用的疫苗只有單獨(dú)預(yù)防豬鏈球菌病、副豬嗜血桿菌病的滅活疫苗。 同時(shí)預(yù)防豬鏈球菌病與副豬嗜血桿菌病的滅活疫苗，國內(nèi)外還未見報(bào)道。而且，由于抗生素的濫用，導(dǎo)致了耐藥菌株的產(chǎn)生，使藥物治療趨向無效、浪費(fèi)；抗生素藥物的殘留，也使得肉用動(dòng)物在出口時(shí)面臨不能通過的難題。因此，使用疫苗來預(yù)防豬鏈球菌病與副豬嗜血桿菌病是當(dāng)前最經(jīng)濟(jì)、最有效的方法。因此，急需發(fā)明一種新的能同時(shí)預(yù)防豬鏈球菌病、副豬嗜血桿菌病的二聯(lián)滅活疫苗以解決上述問題。本公司經(jīng)大量試驗(yàn)后，研制出了該二聯(lián)滅活疫苗，試驗(yàn)結(jié)果證明本疫苗效果良好。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌病二聯(lián)滅活疫苗，該疫苗能同時(shí)有效的預(yù)防豬鏈球菌病和副豬嗜血桿菌病，而且只需一針免疫，減少了豬只的應(yīng)激，降低了成本。臨床上達(dá)到“一針多防”的效果，而且不存在散毒的隱患，安全可靠。本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌病二聯(lián)滅活疫苗的制備方法，該方法制備的疫苗產(chǎn)生的抗體較高且持久。
為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施一種豬鏈球菌病O型)、副豬嗜血桿菌病G型、5型)二聯(lián)滅活疫苗的制備方案， 其步驟如下a.分別將豬鏈球菌2-LT株菌種(CCTCC NO :M201U82)、副豬嗜血桿菌4-MD0322 株菌種(CCTCC NO :M2011283)和副豬嗜血桿菌 5-SH0165 株菌種(CCTCC NO :M2011284)增殖培養(yǎng)，得到豬鏈球菌2-LT菌液，副豬嗜血桿菌4-MD0322株菌液和副豬嗜血桿菌5-SH0165 株菌液。b.分別向a步驟培養(yǎng)好的豬鏈球菌2-LT株菌液、副豬嗜血桿菌4-MD0322株菌液和副豬嗜血桿菌5-SH0165株菌液中按總量加入0. 3% 0. 4%的甲醛溶液，置于37°C滅活 48 72小時(shí)，期間每隔3 4小時(shí)攪拌1次。c.將收集的豬鏈球菌2-LT株菌液，副豬嗜血桿菌4-MD0322株菌液和副豬嗜血桿菌5-SH0165株菌液按照1 1 1的體積比混合，再按吐溫-80與混合菌液4 6 94 96，優(yōu)選4 96的體積比，加入吐溫-80，制成水相，將白油(?？松梨贛arcol52)、司本-80和硬脂酸鋁按照94 6 1 2，優(yōu)選94 6 1的比例制成油相，水相與油相按照40 % 45 % 55 % 60 %體積比混合，優(yōu)選40 % 60%體積比。將水相緩慢加入油相均質(zhì)3 5分鐘后，制成均勻乳劑，即為油乳劑滅活疫苗。本二聯(lián)油乳劑滅活疫苗的保存條件為2 8°C。d、將步驟c得到的油乳劑滅活疫苗進(jìn)行分裝。本發(fā)明豬鏈球菌病O型)、副豬嗜血桿菌病G型、5型)二聯(lián)滅活疫苗的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的豬鏈球菌2型為豬鏈球菌2-LT株，所述的副豬嗜血桿菌4-MD0322株，副豬嗜血桿菌5-SH0165株。各菌株分離鑒定如下1.豬鏈球菌2型菌株LT株(豬鏈球菌2-LT)的分離、篩選和鑒定申請人:從湖北省羅田某豬場送檢的有神經(jīng)癥狀、急性死亡豬的心血中分離得到一株具有致病性的豬鏈球菌2型(Sti^ptococcus suis)菌株(菌株編號為LT株)， Streptococcus suis 2, CCTCC NO :M201U82，該菌株已保藏，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏日期2011年8月9日，保藏編號CCTCC NO M201U82，分類命名豬鏈球菌 2-LT Streptococcus suis 2-LT。1.1豬鏈球菌2-LT的分離待分離的病料——各組織病料是申請人的發(fā)明人于2004年9月分離于湖北羅田某豬場有神經(jīng)癥狀、急性死亡豬的心血中分離得到。其具體分離方法為無菌采集心血接種于TSA平皿上，37°C培養(yǎng)12-24小時(shí)后觀察。挑取直徑為0. lmm-1. 0mm、灰白色、半透明、表面光滑、圓形、邊緣整齊的小菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基中37°C搖床培養(yǎng)過夜。將純培養(yǎng)后的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。然后用光學(xué)顯微鏡觀察，革蘭氏染色呈陽性、成雙或短鏈狀球菌，對其傳代純化。1. 2豬鏈球菌2型的分類鑒定采用PCR方法、生化鑒定及玻片凝集試驗(yàn)進(jìn)行了鑒定，具體步驟如下(I)PCR方法鑒定根據(jù)參考文獻(xiàn)合成豬鏈球菌通用引物和豬鏈球菌2型特異性引物。其中豬鏈球菌通用引物JP4和JP5是根據(jù)谷氨酸鹽脫氫酶基因(gdh，基因登錄號gb|EF539838. 11)設(shè)計(jì)，上游引物為JP4(5，-CCATGGACAGATAAAGATGG-3，)；下游引物為JP5 (5 ‘ -GCAGCGTATTCTGTCAAACG-3 ‘)，可擴(kuò)增長度為 689bp 的目的 DNA 片段(其PCR圖片見圖1)。豬鏈球菌2型的特異性引物是根據(jù)豬鏈球菌具有型特異性的莢膜多糖抗原基因 cps2J(基因登錄號JN024705. 1)設(shè)計(jì)，上游引物為 cps2J_F(5’ -TGATAGTGATTTGTCGGGAGG G-3，)，下游引物為cps2J-R(5，-GAGTATCTAAAGAATGCCTATTG-3，)，可擴(kuò)增長度為 557bp 目的DNA片段(PCR圖片如圖2)。(2)生化鑒定從TSA平板上挑取步驟(1)中鑒定為陽性的單菌落，進(jìn)行常規(guī)的生化鑒定試驗(yàn)。微量生化鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司，按照該公司產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。結(jié)果豬鏈球菌LT株的各項(xiàng)生化指標(biāo)均符合。(3)玻片凝集試驗(yàn)將分離的豬鏈球菌LT株接種TSB培養(yǎng)基，置37°C搖床170rpm/ min，培養(yǎng)8小時(shí)，使0D600達(dá)到1. 3 1. 5，采用玻片凝集的方法對該菌液進(jìn)行血清學(xué)分型鑒定。操作方法如下取潔凈玻片1張，用微量移液器吸取3 μ 1豬鏈球菌(SQ標(biāo)準(zhǔn)陽性血清(購自丹麥哥本哈根國立血清研究所)滴于載玻片上，另吸取3μ 1生理鹽水做對照，然后吸取3μ 1 菌液分別加入血清和生理鹽水中，充分混勻，(注每次加樣都要更換移液器的TIP頭)。輕輕搖動(dòng)載玻片，1 ailin后觀察結(jié)果。血清與待檢菌液混合后出現(xiàn)明顯可見的凝集塊，液體變?yōu)橥该鳎}水對照滴仍為均勻混濁狀態(tài)，即為凝集反應(yīng)陽性。若血清與菌液混合后為均勻混濁狀態(tài)，沒有出現(xiàn)明顯可見的凝集塊視為為陰性。玻片凝集試驗(yàn)表明，豬鏈球菌LT株僅與豬鏈球菌2型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清(購自丹麥哥本哈根國立血清研究所)發(fā)生凝集反應(yīng)，不與其他血清型凝集。根據(jù)革蘭氏染色、PCR方法、生化鑒定和玻片凝集試驗(yàn)，確定上述豬鏈球菌LT株為豬鏈球菌2型菌株，命名為豬鏈球菌2-LT。2.副豬嗜血桿菌4型MD0322株(副豬嗜血桿菌4-MD0322)的分離、篩選和鑒定申請人:從湖北省枝江市某豬場患多發(fā)性漿膜炎與關(guān)節(jié)炎的豬中分離得到一株副豬嗜血桿菌血清型4型(菌株編號為MD0322株)，Haemophilus parasuis 4，CCTCC NO M2011283，該菌株已保藏，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏日期2011年8月9日，保藏編號CCTCC NO :M201U83，分類命名副豬嗜血桿菌 4-MD0322Haemophilus parasuis 4—MD0322。2. 1副豬嗜血桿菌4-MD0322株的分離。待分離的病料——各組織病料是申請人的發(fā)明人于2001年8月分離于湖北枝江市某豬場患多發(fā)性漿膜炎與關(guān)節(jié)炎的豬分離得到。其具體分離方法為無菌操作從疑似病豬的關(guān)節(jié)液和腦組織等病料中取樣，首先在巧克力瓊脂平板或TSA固體培養(yǎng)基上劃線接種，37°C培養(yǎng)M 48小時(shí)后挑取單個(gè)菌落，再進(jìn)行純培養(yǎng)。挑取上述純培養(yǎng)菌落抹片，革蘭氏染色后觀察，細(xì)菌為革蘭氏陰性細(xì)小桿菌，具有多種不同的形態(tài)，可見單個(gè)的球桿菌、 桿菌或長的細(xì)長的以致絲狀的菌體。將其命名為副豬嗜血桿菌MD0322株。2. 2副豬嗜血桿菌MD0322株的分類鑒定
采用PCR方法、生化鑒定及免疫瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)或間接血凝試驗(yàn)進(jìn)行了鑒定，具體步驟如下(I)PCR 方法鑒定根據(jù)副豬嗜血桿菌16S rRNA(基因登錄號⑶226410. 1)序列設(shè)計(jì)引物，由上海生工公司合成上游引物5，-GGCTTC GTCACC CTC TGT-3，下游引物5，-GTGATG AGG AAG GGT GGT GT-3，可擴(kuò)增長度為 821bp 的目的 DNA 片段(其PCR圖片見圖3)。PCR結(jié)果表明其為副豬嗜血桿菌。(2)生化鑒定用接種環(huán)分別挑取上述PCR鑒定為陽性的單菌落，水平劃線于無NAD的綿羊鮮血平皿上，再挑取金黃色葡萄球菌垂直于水平線劃線，37°C培養(yǎng)M 48小時(shí)，看是否有“衛(wèi)星生長現(xiàn)象”(即在葡萄球菌菌苔附近待測菌菌落生長較大，而遠(yuǎn)側(cè)菌落生長較小甚至沒有菌落生長)，同時(shí)觀察是否具有溶血現(xiàn)象。取具有“衛(wèi)星生長現(xiàn)象，，且不溶血的單菌落純培養(yǎng)后接種于脲酶、氧化酶、接觸酶、硝酸鹽還原、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖、麥芽糖、乳糖、木糖和甘露糖等微型生化鑒定管(購自杭州天和微生物試劑有限責(zé)任公司)，按廠家說明書的方法操作，結(jié)果副豬嗜血桿菌MD0322株的各項(xiàng)生化指標(biāo)均符合。(3)免疫瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)將待檢副豬嗜血桿菌分離株接種于TSA固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)M小時(shí)，挑取單菌落重新接種TSA固體培養(yǎng)基純化擴(kuò)大，37°C培養(yǎng)12 16小時(shí)后再于TSA固體培養(yǎng)基上均勻劃線進(jìn)行大量增殖，37°C培養(yǎng)M小時(shí)，用PBS洗下菌苔，7000轉(zhuǎn)/分鐘，離心2分鐘，棄上清，估測細(xì)菌沉淀的體積，加入菌體體積9倍的pH7. 4的PBS，渦旋混合均勻后于121°C高壓蒸汽處理2小時(shí)，7000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，取上清即為用于瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的分型抗原。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)中的瓊脂濃度為1. 0%，中央孔分別加入副豬嗜血桿菌抗原，周圍孔加入2倍系列稀釋的血清。置37°C溫箱濕盒中作用，M小時(shí)后觀察結(jié)果，連續(xù)觀察三日，如在抗原孔相鄰的抗體孔之間出現(xiàn)沉淀線，則判定其效價(jià)。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)表明，副豬嗜血桿菌 MD0322株僅與副豬嗜血桿菌4型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清(購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室)發(fā)生反應(yīng)，不與其他血清型反應(yīng)。根據(jù)革蘭氏染色、PCR方法、生化鑒定和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，確定上述副豬嗜血桿菌 MD0322株為副豬嗜血桿菌4型菌株，命名為副豬嗜血桿菌4-MD0322。3.副豬嗜血桿菌5型SH0165株(副豬嗜血桿菌5_SH016O的分離、篩選和鑒定申請人:從湖北省枝江市某豬場患多發(fā)性漿膜炎與關(guān)節(jié)炎的豬中分離得到一株副豬嗜血桿菌血清型5型(菌株編號為SH0165)，Haemophilus parasuis 5，CCTCC NO: M2011284，該菌株已保藏，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏日期2011年8月9日，保藏編號CCTCC NO :M201U84，分類命名副豬嗜血桿菌 5_SH0165Haemophilus parasuis 5—SH0165。3. 1副豬嗜血桿菌5型SH0165株的分離。待分離的病料——各組織病料是申請人的發(fā)明人于2001年4月分離于河北省石家莊市送檢的病料中分離得到。其具體分離方法為無菌操作從疑似病豬的心血、肺組織、脾組織、關(guān)節(jié)液等病料中取樣，首先在巧克力瓊脂平板或TSA固體培養(yǎng)基上劃線接種，37°C 培養(yǎng)M 48小時(shí)后挑取單個(gè)菌落，再進(jìn)行純培養(yǎng)。挑取上述純培養(yǎng)菌落抹片，革蘭氏染色后觀察，細(xì)菌為革蘭氏陰性細(xì)小桿菌，具有多種不同的形態(tài)，可見單個(gè)的球桿菌、桿菌或長的細(xì)長的以致絲狀的菌體。將其命名為副豬嗜血桿菌SH0165株。3. 2副豬嗜血桿菌SH0165株的分類鑒定采用PCR方法、生化鑒定及免疫瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)或間接血凝試驗(yàn)進(jìn)行了鑒定，操作方法同上述2. 2。各項(xiàng)試驗(yàn)確定上述副豬嗜血桿菌SH0165株為副豬嗜血桿菌5型菌株，命名為副豬嗜血桿菌5-SH0165。本疫苗主要應(yīng)用于豬場中種豬和仔豬對豬鏈球菌病和副豬嗜血桿菌病的預(yù)防，降低豬場豬鏈球菌病和副豬嗜血桿菌病的發(fā)病率，提高仔豬存活效率。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)預(yù)防豬鏈球菌2型和豬副豬嗜血桿菌4型、5型引起的疾病，對于同血清型的免疫保護(hù)效果達(dá)到80%以上，相對于目前的商品疫苗來講，可以單針免疫較多的血清型，達(dá)到“一針防多病”的目的，且使用方便，減少了豬只應(yīng)激，而且不存在散毒的隱患，安全可靠。


圖1為一種豬鏈球菌通用引物擴(kuò)增的PCR示意圖。M =DNA分子Marker ； 1 4 豬鏈球菌分離菌株和豬鏈球菌2型標(biāo)準(zhǔn)菌株；5 豬鏈球菌LT分離株。圖2為一種豬鏈球菌2型引物擴(kuò)增的PCR示意圖。1 豬鏈球菌LT分離株；2 =DNA分子Marker3 5 豬鏈球菌分離株；6 陰性對照 (H20。圖3為一種副豬嗜血桿菌16SrRNA引物擴(kuò)增的PCR示意圖。M為Marker DL-2000 ；1為副豬嗜血桿菌4-MD0322株；2為陰性對照，3、4、5分別為其他待測菌。
具體實(shí)施例方式為了本發(fā)明更加容易理解，下面將進(jìn)一步闡述本發(fā)明的實(shí)施例。結(jié)合實(shí)施對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述和論證。實(shí)施例1 一種豬鏈球菌病O型)、副豬嗜血桿菌病G型、5型)二聯(lián)滅活疫苗的制備方案， 其步驟如下本品是選用豬鏈球菌2型LT株、副豬嗜血桿菌4型MD0322株和副豬嗜血桿菌5型 SH0165株接種于適宜的培養(yǎng)基培養(yǎng)，將培養(yǎng)物經(jīng)甲醛容易滅活，去除殘留毒素，加白油佐劑配置而成，用于預(yù)防由豬鏈球菌2型和副豬嗜血桿菌4型、5型所引起的各種細(xì)菌感染。這包括了目前流行的幾種最重要的細(xì)菌性疾病。制造及檢驗(yàn)本品用的菌種為豬鏈球菌2-LT 株(CCTCC NO :M2011282)、副豬嗜血桿菌 4-MD0322 株(CCTCC NO :M2011283)和副豬嗜血桿菌5-SH0165株(CCTCC NO :M2011284)均在湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏。制造及檢驗(yàn)本品用的菌種為豬鏈球菌2-LT株、副豬嗜血桿菌4-MD0322株和副豬嗜血桿菌5-SH0165株均凍干保存。1疫苗制造及半成品檢驗(yàn)1. 1生產(chǎn)用種子的制備1.1.1 一級種子的繁殖將凍干菌種接種于TSA固體培養(yǎng)基，置37°C培養(yǎng)M小時(shí)，然后選取生長良好的菌落，接種TSA固體培養(yǎng)基若干個(gè)，置37°C培養(yǎng)12 16小時(shí)，做為一級種子。在2 8°C保存，保存期不超過5日。在培養(yǎng)基上傳代，不超過5代。1. 1. 2 二級種子繁殖取一級種子接種于TSB液體培養(yǎng)基中，置37°C培養(yǎng)12 16 小時(shí)，按《中國獸藥典》附錄進(jìn)行純粹檢驗(yàn)，合格后作為二級種子。在2 8°C保存，保存期不超過5日。1. 2制苗用培養(yǎng)基為TSB液體培養(yǎng)基。1. 3制苗菌液制備1. 3. 1細(xì)菌培養(yǎng)三種血清型的菌液分別培養(yǎng)制備。將鑒定合格的豬鏈球菌2型二級種子液按接種于TSB液體培養(yǎng)基，置37°C培養(yǎng)12小時(shí)；將鑒定合格的副豬嗜血桿菌 4型，5型二級種子液按接種于TSB液體培養(yǎng)基，置37°C培養(yǎng)M小時(shí)。1. 3. 2純粹檢驗(yàn)及細(xì)菌計(jì)數(shù)取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，并按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行純粹檢驗(yàn)，應(yīng)純粹。1. 3. 3滅活檢驗(yàn)合格的菌液，按菌液總量的0. 4%加入甲醛溶液，37°C滅活48小時(shí)，期間每隔4小時(shí)攪拌1次，然后取樣按《中國獸藥典》進(jìn)行滅活檢驗(yàn)，應(yīng)無細(xì)菌生長。1.3. 4濃縮將滅活檢驗(yàn)合格的菌液離心，再按滅活前的活菌計(jì)數(shù)結(jié)果用生理鹽水調(diào)節(jié)豬鏈球菌2型菌液濃度到1. 125X 101(lCFU/ml，調(diào)節(jié)副豬嗜血桿菌4型和5型的菌液濃度到1. OX 101(lCFU/ml。取樣做無菌檢驗(yàn)，應(yīng)無細(xì)菌生長。1. 4 配苗1. 4. 1油相的制備取埃克森美孚進(jìn)口白油94份(以毫升為單位)，加入硬脂酸鋁1 份(以克為單位)，邊加邊攪拌，直到透明為止，再加入司本-80 6份(以毫升為單位)，充分混勻，130°C滅菌30分鐘，冷卻至室溫備用。1.4.2水相的制備將濃縮好的三種菌液按11 1比例混合，加入滅菌后的吐溫-80，邊加邊攪拌，至完全溶解，使其終濃度為4. 0%。1. 4. 3乳化水相與油相的比例為1 1. 5。將水相緩慢加入油相均質(zhì)3 5分鐘后，剪切，制成均勻乳劑。1. 5分裝定量分裝，加塞密封，置2 8°C保存。實(shí)施例5效力研究1試驗(yàn)方案用觀 35日齡健康斷奶仔豬30頭，其中15頭各肌肉注射實(shí)施例1制得的疫苗 anl，含1個(gè)使用劑量，首免后21日進(jìn)行第二次免疫；剩下15頭作為未免疫對照組。免疫后測定動(dòng)物體溫，觀察臨床表現(xiàn)。二免后14日，豬鏈球菌2型采用靜脈攻毒，副豬嗜血桿菌采用腹腔內(nèi)攻毒。分別用2. OXlO6CFU 豬鏈球菌 2-LT 株，7. OXlO9CFU 的副豬嗜血桿菌 4-MD03220 株和 6. OXlO9CFU 的副豬嗜血桿菌5-SH0165株攻毒，攻毒后觀察其臨床癥狀和死亡情況，計(jì)算每批疫苗的保護(hù)率。2試驗(yàn)結(jié)果2. 1疫苗接種后體溫狀況疫苗接種豬無明顯體溫反應(yīng)，食欲、精神正常，無其他可見臨床反應(yīng)出現(xiàn)，疫苗注射局部無腫脹等炎性反應(yīng)(表1)。表1 疫苗接種仔豬08 35日齡)后的平均體溫變化
組量 免疫組 2ml
接種前 39.1 士 0.5
對照組不注射鄧.2 士 0.4如表1所示，疫苗對28 35日齡健康斷奶仔豬免疫接種2ml后的觀察結(jié)果表明， 疫苗接種豬僅表現(xiàn)一過性的體溫升高，并且平均體溫升高不超過1°C。另外，所有仔豬接種后食欲、精神均表現(xiàn)正常，無其它可見臨床反應(yīng)。2. 2疫苗免疫效力測定仔豬二免后14天，分別用2. OX IO6CFU豬鏈球菌2型LT株，7. OX IO9CFU的副豬嗜血桿菌4型(MD03220)和6. OX IOi3CFU的副豬嗜血桿菌5型(SH0165)攻毒，結(jié)果如表2 所示。表2 疫苗免疫保護(hù)力結(jié)果
(頭)(頭)
死亡數(shù)保護(hù)率(健活數(shù)/ (頭)試驗(yàn)數(shù))
免疫豬鏈球菌2型5005/5組副豬嗜血桿菌4型5104/5副豬嗜血桿菌5型5114/5對照豬鏈球菌2型5441/5組副豬嗜血桿菌4型5541/5副豬嗜血桿菌5型5550/5實(shí)施例2 豬鏈球菌2-LT株(豬鏈球菌2-LT)的分離和鑒定。待分離的病料——各組織病料是申請人的發(fā)明人于2004年9月分離于湖北羅田某豬場有神經(jīng)癥狀、急性死亡豬的心血由分離得到。其具體分離方法為無菌采集心血接種于TSA平皿上，37°C培養(yǎng)12- 小時(shí)后觀察。挑取直徑為0. lmm-1. 0mm、灰白色、半透明、表面光滑、圓形、邊緣整齊的小菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基中37°C搖床培養(yǎng)過夜。將純培養(yǎng)后的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。然后用光學(xué)顯微鏡觀察，革蘭氏染色呈陽性、成雙或短鏈狀球菌，對其傳代純化。豬鏈球菌2型的分類鑒定，采用PCR方法、生化鑒定及玻片凝集試驗(yàn)進(jìn)行了鑒定， 具體步驟如下
(I)PCR方法鑒定根據(jù)參考文獻(xiàn)合成豬鏈球菌通用引物和豬鏈球菌2型特異性引物。其中豬鏈球菌通用引物JP4和JP5是根據(jù)谷氨酸鹽脫氫酶基因(gdh，基因登錄號 gblEF539838. 11)設(shè)計(jì)，上游引物為JP4(5，-CCATGGACAGATAAAGATGG-3，)；下游引物為JP5 (5 ‘ -GCAGCGTATTCTGTCAAACG-3 ‘)，可擴(kuò)增長度為 689bp 的目的 DNA 片段(其PCR圖片見圖1)。豬鏈球菌2型的特異性引物是根據(jù)豬鏈球菌具有型特異性的莢膜多糖抗原基因 cps2J(基因登錄號JN024705. 1)設(shè)計(jì)，上游引物為 cps2J_F(5’ -TGATAGTGATTTGTCGGGAGG G-3，)，下游引物為cps2J-R(5，-GAGTATCTAAAGAATGCCTATTG-3，)，可擴(kuò)增長度為 557bp 目的DNA片段。PCR模板的制備取Iml菌液到無菌的1.5ml離心管中，12000r/min離心5分鐘，去掉上清，用 200 μ 1無菌水懸浮混勻，100°C水浴中煮10分鐘，然后迅速置于冰上冷卻5分鐘，12000r/ min離心2分鐘，上清即為PCR模板。PCR反應(yīng)體系(總體積25 μ 1)IOXTaq Buffer2. 5 μ 1，2μΜ dNTPs 1. 5μ 1，20 μ M 上、下游引物各 1 μ 1，TaqDNA 聚合酶1 μ 1，無菌水14μ 1，模板4μ 1。退火溫度為94°C30 秒，58°C 60 秒，72°C 40 秒，30 循環(huán)。PCR結(jié)果觀察取PCR 擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物 10 μ 1 和 Mark2000plus 5 μ 1，加到含 EB 的 0. 8% (V/V)瓊脂糖膠中，在80伏電壓下電泳30分鐘，然后在紫外線燈下觀察。(2)生化鑒定從TSA平板上挑取步驟(1)中鑒定為陽性的單菌落，進(jìn)行常規(guī)的生化鑒定試驗(yàn)。微量生化鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司，按照該公司產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。結(jié)果豬鏈球菌LT株的各項(xiàng)生化指標(biāo)均符合(見表1)。(3)玻片凝集試驗(yàn)將分離的豬鏈球菌LT株接種TSB培養(yǎng)基，置37°C搖床170rpm/ min，培養(yǎng)8小時(shí)，使0D600達(dá)到1. 3 1. 5，采用玻片凝集的方法對該菌液進(jìn)行血清學(xué)分型鑒定。操作方法如下取潔凈玻片1張，用微量移液器吸取3μ 1豬鏈球菌(SQ標(biāo)準(zhǔn)陽性血清(購自丹麥哥本哈根國立血清研究所)滴于載玻片上，另吸取3μ 1生理鹽水做對照，然后吸取3μ 1 菌液分別加入血清和生理鹽水中，充分混勻(注每次加樣都要更換移液器的TIP頭)。輕輕搖動(dòng)載玻片，1 anin后觀察結(jié)果。血清與待檢菌液混合后出現(xiàn)明顯可見的凝集塊，液體變?yōu)橥该?，而鹽水對照滴仍為均勻混濁狀態(tài)，即為凝集反應(yīng)陽性。若血清與菌液混合后為均勻混濁狀態(tài)，沒有出現(xiàn)明顯可見的凝集塊視為為陰性。玻片凝集試驗(yàn)表明，豬鏈球菌LT株僅與豬鏈球菌2型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清發(fā)生凝集反應(yīng)，不與其他血清型凝集。表1豬鏈球菌2型生化鑒定試驗(yàn)
權(quán)利要求
1.一種豬鏈球菌，其特征在于豬鏈球菌(Streptococcus suis ) 2-LT，CCTCC NO: M2011282。
2.一種副豬嗜血桿菌，其特征在于副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)4-MD0322,CCTCC NO :M2011283。
3.一種副豬嗜血桿菌，其特征在于副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)5-SH0165,CCTCC NO :M2011284。
4.權(quán)利要求1或2或3所述的一種豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌病二聯(lián)滅活疫苗的制備方法，其步驟是a.分別將豬鏈球菌2-LT株菌種、副豬嗜血桿菌4-MD0322株菌種和副豬嗜血桿菌 5-SH0165株菌種增殖培養(yǎng)，得到豬鏈球菌2-LT菌液、副豬嗜血桿菌4-MD0322株菌液和副豬嗜血桿菌5-SH0165株菌液；b.分別向a步驟培養(yǎng)好的豬鏈球菌2-LT株菌液、副豬嗜血桿菌4-MD0322株菌液和副豬嗜血桿菌5-SH0165株菌液中按總量加入0. 3% 0. 4%的甲醛溶液，置于37°C滅活48 72小時(shí)，期間每隔3 4小時(shí)攪拌1次；c.將收集的豬鏈球菌2-LT株菌液、副豬嗜血桿菌4-MD0322株菌液和副豬嗜血桿菌 5-SH0165株菌液按照1:1:1的體積比混合，再按吐溫_80與混合菌液4 6 94 96，加入吐溫-80，制成水相，將白油、司本-80和硬脂酸鋁按照94 6 1 2的比例制成油相，水相與油相按照40% 45%: 55% 60%體積比混合，將水相加入油相均質(zhì)3 5分鐘后，制成均勻乳劑，為油乳劑滅活疫苗，本二聯(lián)油乳劑滅活疫苗的保存條件為2 8°C ；d.將步驟c得到的油乳劑滅活疫苗進(jìn)行分裝。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌病二聯(lián)滅活疫苗及制備方法，其步驟a．分別將豬鏈球菌株菌種、副豬嗜血桿菌株菌種和副豬嗜血桿菌株菌種增殖培養(yǎng)，得到豬鏈球菌菌液、副豬嗜血桿菌株菌液和副豬嗜血桿菌株菌液。b．分別向豬鏈球菌株菌液、副豬嗜血桿菌株菌液和副豬嗜血桿菌株菌液中加入甲醛溶液，滅活；c．將收集的豬鏈球菌株菌液、副豬嗜血桿菌株菌液和副豬嗜血桿菌株菌液混合，加入吐溫-80制成水相，將白油、司本-80和硬脂酸鋁制成油相，水相與油相混合，制成均勻乳劑，為油乳劑滅活疫苗；d．將油乳劑滅活疫苗進(jìn)行分裝。該疫苗能有效的預(yù)防豬鏈球菌病和副豬嗜血桿菌病，只需一針免疫，降低了成本，而且不存在散毒的隱患，安全可靠。
文檔編號C12R1/21GK102329746SQ20111023419
公開日2012年1月25日 申請日期2011年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月16日
發(fā)明者周明光, 康超, 徐高原, 王楊波, 蔡旭旺, 金梅林, 陳關(guān)平, 陳波, 陳煥春, 陳章表 申請人:武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司