專利名稱：五種檢疫性線蟲傳多面體病毒多重檢測用引物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)，具體地說涉及五種檢疫性線蟲傳多面體病毒 (Nepovirus)多重RT-PCR檢測用引物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
線蟲傳多面體病毒屬(^povirus)是類小RNA病毒目(Picornavirales)、伴生豇豆病毒科(Secoviridae)、豇豆花葉病毒亞科(Comovirinae)中的一個(gè)病毒屬，包含亞組A、 B和C等3個(gè)亞組，至少有34種病毒。線蟲傳多面體病毒廣泛分布于溫帶地區(qū)，有些病毒種類具有非常廣泛的自然寄主，對農(nóng)業(yè)安全生產(chǎn)造成重大威脅。12種病毒通過長針線蟲(劍線蟲屬Xiphinema、長針線蟲屬Longidorus、或擬長針線蟲屬Paralongidorus spp)持久性傳播、3種通過花粉傳播，一種通過螨類傳播，其他種類還沒有發(fā)現(xiàn)傳播介體。在線蟲傳多面體病毒中，種子和/或花粉傳播非常普遍，已報(bào)道21種病毒可以通過種子傳播。根據(jù) 2007年公布的《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》，該病毒屬中被列為檢疫性病毒的種類有南芥菜花葉病毒(Arabis mosaic virus，ArMV)、桃叢簇花葉病毒(Peach rosette mosaic virus，PRMV)、煙草環(huán)斑病毒(Tobacco ringspot virus，TRSV)、番茄黑環(huán)病毒(Tomato black ring virus, TBRV)、番爺環(huán)斑病毒(Tomato ringspot virus, ToRSV), 共5種。目前，已建立了針對南芥菜花葉病毒、桃叢簇花葉病毒、煙草環(huán)斑病毒、番茄黑環(huán)病毒、番茄環(huán)斑病毒等單個(gè)病毒的RT-PCR檢測方法，以及同時(shí)檢測ToRSV和TRSV等2種病毒的多重RT-PCR檢測方法(薛楊等，2005 ；吳興海等，2006)，Digiaro等(2007)建立了亞組 A 的 TRSV、GFLV, ArMV、GDefV 等 4 種病毒的多重 RT-PCR，亞組 B 的 GCMV、AILV、GARSV 和 TBRV等4種病毒的多重RT-PCR，但還未見報(bào)道針對我國5種檢疫性線蟲傳多面體病毒的多重RT-PCR檢測方法。本申請發(fā)明人根據(jù)5種檢疫性線蟲傳多面體病毒RNAl編碼的依賴于 RNA 的 RNA 聚合酶基因(RNA-cbpendent RNA polymerase gene, RdRp)序列設(shè)計(jì) 5 條特異性引物，并在其下游區(qū)域的保守區(qū)域設(shè)計(jì)一條可用于5種檢疫性線蟲傳多面體病毒的簡并引物，通過反轉(zhuǎn)錄(reverse transcription, RT)禾口聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(polymerase chain reaction, PCR)建立了 ArMV、PRMV、TBRV, ToRSV、TRSV 的多重 RT-PCR 檢測方法，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)特異性擴(kuò)增DNA片段的位置判定結(jié)果。本發(fā)明所建立的多重RT-PCR方法可以同時(shí)檢測5種檢疫性線蟲傳多面體病毒，極大提高檢測效率，降低檢測成本，滿足多目標(biāo)檢測要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供用于ArMV、PRMV、TBRV, ToRSV和TRSV等五種檢疫性線蟲傳多面體病毒多重RT-PCR檢測的引物序列及其應(yīng)用。本發(fā)明通過分析已報(bào)道的ArMV、PRMV、TBRV, ToRSV和TRSV等5種檢疫性線蟲傳多面體病毒RNAl上的RdRp基因序列設(shè)計(jì)5條特異性引物，并在其下游區(qū)域的保守區(qū)域設(shè)計(jì)一條可用于5種檢疫性線蟲傳多面體病毒的簡并引物。所述的引物對由5條正向引物和1條反向引物組成，其5條正向引物序列為ArMV-342 如SEQ ID NO 1所示，即為5，-TCC TGT GAG TAA TCA GCA GC-3，、PRMV-293 如 SEQ ID NO 2 所示，即為 5，-CGC CGC TCTATT TGT GGT-3，、TBRV-256 如 SEQ ID NO 3 所示，即為 5，-TTG TGG TTT GCC CTC TGG A-3，、 ToRSV-472 如 SEQ ID NO 4 所示，即為 5，-GGA CGG ACA TTT ATC AGC G_3，、TRSV-695 如SEQ ID NO :5所示，即為5，-GAT GAA TTG CTT GTG GAA CGT-3，；1條反向引物序列為 N印-2IR 如 SEQ ID NO 1 所示，即為 5，-YTT RTC MBT VCC ATC MGT AAT-3，，其中，Y = C/ T, V = G/A/C, R = A/G, B = G/T/C, M = A/C。本發(fā)明還進(jìn)一步給出了應(yīng)用上述引物的多重RT-PCR檢測方法，其以樣品總RNA為模板，進(jìn)行多重RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)特異性擴(kuò)增的DNA片段判定結(jié)果。較佳地，RT-PCR的反應(yīng)過程中反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的溫度為42°C，PCR擴(kuò)增的退火溫度為 52°C，延伸溫度為72°C。其中，ArMV擴(kuò)增的 DNA 片段大小為 342bp、PRMV 為 ^!3bp、TBRV 為 25^3ρ JoRSV 為 472bp 和 TRSV 為 695bp。具體地說本發(fā)明以樣品總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。RT-PCR反應(yīng)包括反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增兩個(gè)過程。首先在25μ L反應(yīng)體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，即在0.6mL的反應(yīng)管中加入4. OyL RNA, 2μ L Nep-21R(10ymol/L),5. OyL DEPC 處理水，70°C 水浴 5min，立即冰浴 5min 后，加入 5 μ L 5 XM-MLV buffer, 1 μ L M-MLV Reverse Transcriptase, 1 μ L dNTP (各 lOmmol/L)， 0. 5μ L Ribolock RNase Inhibitor，補(bǔ)充 DEPC 處理水至 25 μ L，輕輕混勻后 42°C水浴 lh， 70°C滅活lOmin，合成第一鏈cDNA，_20°C保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)體系為25 μ L，即在0. 2mL的PCR反應(yīng)管中加入2. 0 μ LcDNA, 1. 0 μ L上游引物(10 μ mol/L)，1· 0 μ L 下游引物(10 μ mol/L)，0· 2 μ L DreamTaq DNA Polymerase, 2· 5 μ L 10ΧDreamTaq PCR buffer, 0. 5 μ L dNTP Mixture (各 lOmmol/L), 17. 80 μ L 滅菌水。反應(yīng)條件如下95°C 3min ；94°C 45s, 52°C 45s, 72°C lmin，；35 個(gè)循環(huán)；最后 72°C延伸 IOmin。取5 μ L的PCR產(chǎn)物采用2. 0%的瓊脂糖凝膠電泳電泳檢測。進(jìn)一步，還可以將本發(fā)明引物及相關(guān)試劑組裝成試劑盒，以方便使用。所述的引物在五種檢疫性線蟲傳多面體病毒多重檢測中的應(yīng)用不限于以上所述， 例如可以加入其它輔助手段進(jìn)行聯(lián)合檢測。本發(fā)明根據(jù)五種檢疫性線蟲傳多面體病毒RNAl上RdRp基因序列設(shè)計(jì)引物，該組引物可用于ArMV、PRMV, TBRV, ToRSV、TRSV等五種檢疫性線蟲傳多面體病毒多重RT-PCR 檢測。本發(fā)明檢測方法能夠快速準(zhǔn)確地判斷樣品是否有檢疫性線蟲傳多面體病毒(ArMV、 PRMV, TBRV, ToRSV、TRSV)，為進(jìn)出口安全提供了保證。


圖1是ArMV、PRMV, TBRV, ToRSV、TRSV等五種檢疫性線蟲傳多面體病毒單重及多重RT-PCR方法檢測結(jié)果。1為空白對照，2-6分別為TBRV、PRMV、ArMV、ToRSV和TRSV的單重RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果，7為五種檢疫性線蟲傳多面體病毒的多重RT-PCR檢測結(jié)果。圖2是ArMV、PRMV、TBRV、ToRSV、TRSV等五種檢疫性線蟲傳多面體病毒多重RT-PCR 方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果。1為陽性對照，2-11分別為同屬病毒藍(lán)莓葉斑駁病毒(BLMoV)、櫻桃卷葉病毒(CLRV)、葡萄扇葉病毒(GFLV)、懸鉤子環(huán)斑病毒(RpRSV)以及葡萄、黃瓜、桃子、 菜豆、普通煙、莧色藜等健康寄主葉片。圖3是ArMV、PRMV、TBRV、ToRSV、TRSV等五種檢疫性線蟲傳多面體病毒多重RT-PCR 方法的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果。M :100bp DNA Marker ；1 5°倍稀釋；2 倍稀釋；3 :5_2倍稀釋；
4:5_3倍稀釋；5 :5_4倍稀釋；6 :5_5倍稀釋；7 :5_6倍稀釋；8 空白對照。
具體實(shí)施例方式下面實(shí)施例用于對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例15種檢疫性線蟲傳多面體病毒多重RT-PCR方法的建立1.引物設(shè)計(jì)和合成根據(jù)5種檢疫性線蟲傳多面體病毒RNAl上的RdRp基因序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)5條特異性引物，并在其下游區(qū)域的保守區(qū)域設(shè)計(jì)一條可用于5種檢疫性線蟲傳多面體病毒的簡并引物。特異引物(正向)序列為ArMV-342(SEQ ID NO 1) :5，-TCC TGT GAG TAA TCA GCA GC-3，PRMV-293(SEQ ID NO 2) :5，-CGC CGC TCT ATT TGT GGT-3，TBRV-256(SEQ ID NO 3) :5，-TTG TGG TTT GCC CTC TGG A-3’ToRSV-472(SEQ ID NO :4) :5，-GGA CGG ACA TTT ATC AGC G_3’TRSV-695(SEQ ID NO :5) :5，-GAT GAA TTG CTT GTG GAA CGT-3，簡并引物(反向)序列為Nep-21R(SEQ ID NO :6) :5，-YTT RTC MBT VCC ATC MGT AAT-3’其中，Y= C/T, V = G/A/C, R = A/G, B = G/T/C, M = A/C。2.總RNA的提取 1)取0. Ig發(fā)病葉片，用液氮研磨成粉末狀，移入滅菌的1. 5ml離心管中，然后加入 Iml的Trizol試劑，劇烈震蕩搖勻；2)室溫下保持5min，加入0. 2ml氯仿，劇烈振蕩15s，然后在室溫下保持IOmin后， 4°C，12000g 離心 15min ；3)將上層水相轉(zhuǎn)移到新的1. 5ml離心管中，加入0. 5ml異丙醇，顛倒混勻，室溫下保持IOmin ；4) 40C，12000g離心lOmin，RNA就會在管的側(cè)壁和底部形成沉淀；5)倒掉上清液，加入Iml 75%的乙醇洗滌沉淀，然后4°C，7500g離心5min (如沉淀懸浮起來，則用12000g)，棄去乙醇；6)沉淀于室溫下充分干燥后，溶于40 μ L dH20(DEPC處理)中，55 °C水浴IOmin 后，-20°C保存?zhèn)溆谩?. 5種檢疫性線蟲傳多面體病毒多重RT-PCR擴(kuò)增方法的建立以總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。即在0. 6mL的反應(yīng)管中加入4. 0 μ L RNA, 2 μ L Nep-21R(10 μ mol/L)，5· 0 μ L DEPC 處理水，70°C水浴 5min，立即冰浴 5min 后，力口入 5 μ L
5XM-MLV buffer, 1 μ L M-MLV Reverse Transcriptase, 1 μ L dNTP (各 lOmmol/L)，0· 5 μ L Ribolock RNase Inhibitor,補(bǔ)充 DEPC 處理水至 25 μ L,輕輕混勻后 42°C水浴 lh, 70°C滅活lOmin，合成第一鏈cDNA，_20°C保存?zhèn)溆谩CR反應(yīng)體系為25μ L，即在0. 2mL的PCR反應(yīng)管中加入2. 0μ L cDNA, 2. 5 μ L IOX 引物混合物(9·6μΜ N 印-21R，2.4yM TBRV-256, 2. 4 μ M PRMV-293,1. 6 μ M ArMV-342,1· 6 μ M ToRSV-472 禾口 1· 6 μ M TRSV-695)，0· 4 μ L DreamTaq DNA Polymerase, 2· 5 μ L IOXDreamTaq PCR buffer, 0. 5 μ L dNTP Mixture (各 lOmmol/L), 17. 10 μ L 滅菌水。反應(yīng)條件如下95°C 3min ；94°C 45s, 52°C 45s, 72°C lmin，40 個(gè)循環(huán)；最后 72°C延伸 IOmin0取5 μ L的PCR產(chǎn)物采用2. 0%的瓊脂糖凝膠電泳電泳檢測。PCR反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)特異性擴(kuò)增的DNA片段判定樣品中是否含有檢疫性線蟲傳多面體病毒。其中，ArMV擴(kuò)增的DNA片段大小為342bp、PRMV為^!3bp、TBRV為256bp JoRSV 為 472bp 和 TRSV 為 695bp。實(shí)施例25種檢疫性線蟲傳多面體病毒多重RT-PCR方法的特異性確定取BLMoV、CLRV、GFLV、RpRSV等同屬病毒的陽性樣品以及健康寄主葡萄、黃瓜、桃子、菜豆、普通煙、莧色藜葉片，按實(shí)施例2方法分別提取總RNA，再按實(shí)施例3的方法進(jìn)行 RT-PCR擴(kuò)增，凝膠電泳檢測結(jié)果。其中，陽性對照可以特異擴(kuò)增出預(yù)期大小的目的條帶。分別為 ArMV 為;342bp、PRMV 為 ^3bp、TBRV 為 256bp、iToRSV 為 472bp 和 TRSV 為 695bp，而同屬病毒陽性對照以及健康寄主均未擴(kuò)增出非特異性條帶，檢測結(jié)果如圖2所示。表明建立的多重RT-PCR方法具有良好的特異性，可用于五種檢疫性線蟲傳多面體病毒屬病毒的檢測。實(shí)施例35種檢疫性線蟲傳多面體病毒多重RT-PCR方法的靈敏度確定按照實(shí)施例2方法分別提取總RNA，再按實(shí)施例3的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將cDNA模板進(jìn)行5倍系列稀釋，進(jìn)行多重RT-PCR靈敏性檢測。檢測結(jié)果如圖3所示。表明建立的多重 RT-PCR方法的檢測靈敏性可以達(dá)到5_3倍，符合檢測的要求。
權(quán)利要求
1.五種檢疫性線蟲傳多面體病毒多重檢測用引物，其核苷酸序列為ArMV-342 :5’ -TCC TGT GAG TAA TCA GCA GC-3’ PRMV-293 :5’ -CGC CGC TCT ATT TGT GGT-3’ TBRV-256 :5’ -TTG TGG TTT GCC CTC TGG A-3’ ToRSV-472 :5’ -GGA CGG ACA TTT ATC AGC G-3’ TRSV-695 :5’ -GAT GAA TTG CTT GTG GAA CGT-3’ Nep-21R :5’ -YTT RTC MBT VCC ATC MGTA AT-3’ 其中，Y = C/T, V = G/A/C, R = A/G, B = G/T/C, M = A/C。
2.一種檢測五種檢疫性線蟲傳多面體病毒的多重方法，該方法以樣品總RNA為模板， 利用權(quán)利要求1所述的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)特異性擴(kuò)增DNA片段的位置判定結(jié)果。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，RT-PCR的反應(yīng)過程中反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的溫度為 420C，PCR擴(kuò)增的退火溫度為52°C，延伸溫度為72°C。
4.含有權(quán)利要求1所述五種檢疫性線蟲傳多面體病毒多重檢測用引物的試劑盒。
5.權(quán)利要求1所述的引物在五種檢疫性線蟲傳多面體病毒多重檢測中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種五種檢疫性線蟲傳多面體病毒(南芥菜花葉病毒、桃叢簇花葉病毒、番茄環(huán)斑病毒、番茄黑環(huán)病毒、煙草環(huán)斑病毒)多重RT-PCR檢測用引物及其應(yīng)用，所述引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1～6所示。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了檢測五種檢疫性線蟲傳多面體病毒的方法，該方法以樣品總RNA為模板，利用本發(fā)明特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)特異性擴(kuò)增DNA片段的位置判定結(jié)果。本發(fā)明引物特異性好，檢測方法快速準(zhǔn)確，為進(jìn)出口安全提供了保證。
文檔編號C12N15/11GK102277450SQ201110234258
公開日2011年12月14日 申請日期2011年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月16日
發(fā)明者廖富榮, 林石明, 沈建國, 郭木金, 陳紅運(yùn), 陳青 申請人:廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心