專利名稱：：戊型肝炎病毒的病毒樣顆粒的組裝機(jī)制及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和病毒學(xué)領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明闡明了戊型肝炎病毒(HepatitisEVirus,HEV)的病毒樣顆粒(virus-likeparticle,VLP)的組裝機(jī)制，并提供了一種用于將HEV衣殼蛋白或其變體或片段組裝成VLP的方法。此外，本發(fā)明還提供了用于控制HEVVLP的組裝的方法，其通過控制鹽濃度和/或溫度來控制HEV衣殼蛋白或其變體或片段至VLP的組裝。
背景技術(shù)：
：戊型病毒性肝炎是由戊型肝炎病毒OfepatitisEVirus,HEV)感染導(dǎo)致的，其是主要的病毒性肝炎之一，并且多數(shù)呈自限性。戊型病毒性肝炎的癥狀與甲型肝炎類似，但病死率更高，癥狀更重孕婦病死率可高達(dá)20%，并且慢性肝病患者合并HEV感染易引發(fā)肝衰竭，死亡率達(dá)70%。HEV主要通過腸道傳播，但亦可通過輸血或垂直途徑傳播，常常導(dǎo)致大規(guī)模的爆發(fā)流行。近半個世紀(jì)以來，文獻(xiàn)記載了萬例以上的戊型肝炎大爆發(fā)近十起，其中規(guī)模最大的一次發(fā)生于1986-1988年的中國新疆，共發(fā)病119，280例，死亡707人，其中包括414名孕婦。由于人們對HEV的研究很有限，因此長期以來戊型肝炎處于一種被忽視的狀態(tài)。進(jìn)入21世紀(jì)以來，隨著戊型肝炎診斷試劑的靈敏度和特異性的大幅度提高，越來越多的戊型肝炎病例被確診。據(jù)統(tǒng)計，全球大約有三分之一的人口曾感染過HEV。越來越多的證據(jù)顯示，戊型肝炎是一種人獸共患疾病。豬是HEV的最主要動物宿主，并且是人類戊型肝炎的重要傳染源。我國學(xué)者對全國20個省市120個養(yǎng)豬場以及進(jìn)口檢疫的9，055只豬的HEV感染情況進(jìn)行了血清學(xué)調(diào)查，結(jié)果證實(shí)我國商品豬中的HEV感染極其常見，總感染率高達(dá)83%，并且從國內(nèi)多個地區(qū)的豬中分離到了HEV病毒株。戊型肝炎病毒(HEV)是一種單股正鏈的RNA病毒，其衣殼是由單一結(jié)構(gòu)蛋白組裝成的T=3的二十面體對稱結(jié)構(gòu)，包裹約7.2kb的基因組。HEV病毒顆粒的直徑為約2734nm，無包膜。HEV基因組包含5'端帽狀結(jié)構(gòu)和多聚A尾，并且包含三個相互重疊的開放性讀碼框(ORF=ORFl,0RF2和0RF3)，其兩側(cè)分別為一個短的5'端非編碼區(qū)(5'UTR)和一個由多聚腺苷酸終止的短的3'端非編碼區(qū)(3'UTR)。ORFl長約51Λ，位于編碼區(qū)的5'末端，是HEV最大的開放讀碼框，其主要作用為在RNA合成酶的參與下，編碼與病毒RNA復(fù)制有關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白(pORFl)。0RF2長約21Λ，位于編碼區(qū)的3'末端，為HEV的主要結(jié)構(gòu)基因編碼區(qū)，其主要作用為編碼病毒衣殼蛋白P0RF2——一種含660個氨基酸的糖基化蛋白。近來還針對0RF2蛋白與HEV基因組5'末端的特異RNA結(jié)合活性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，兩者的相互作用可能有助于病毒衣殼的形成。ORF3是一個小的開放讀碼框，功能尚未被闡明。目前有研究提示，HEV0RF3蛋白可能在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、HEV顆粒組裝、釋放及免疫等方面起著重要的作用。根據(jù)0RF2結(jié)構(gòu)蛋白基因的同源性，HEV至少可分為4個主要的基因型。分子流行病學(xué)研究表明，HEV基因1型和2型主要感染人類，常導(dǎo)致爆發(fā)流行；基因3型和4型可同時感染動物和人類，呈散發(fā)性流行。四種型別的HEV代表株分別為緬甸株、墨西哥株、美國株和中國變異株。目前，將雞HEV歸為基因5型。各型HEV在0RF2氨基酸序列上具有較高的同源性，這導(dǎo)致在HEV血清學(xué)上世界各地的HEV均為同一血清型。各基因型病毒間的可交叉保護(hù)，大大簡化了疫苗研制的難度。目前，HEV的細(xì)胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)均未能獲得成功。然而，由于HEV的病毒樣顆粒(virus-likeparticle,VLP)具有良好的免疫反應(yīng)性和免疫原性，可用于研制重組戊型肝炎疫苗。因此，國內(nèi)外戊型肝炎疫苗的研制主要如下通過各種表達(dá)系統(tǒng)獲得結(jié)構(gòu)蛋白，然后在體內(nèi)或體外將結(jié)構(gòu)蛋白組裝成為病毒樣顆粒(VLP)，從而制備獲得VLP疫苗。目前，關(guān)于HEVVLP用于疫苗研究的報道包括如下(1)通過利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)HEV0RF2片段aall2_aa07，可在細(xì)胞裂解物中獲得體內(nèi)自組裝的HEVVLP(Robinson等，ProteinExprPurif.1998,12(1):75-84)；(2)利用大腸桿菌表達(dá)HEV0RF2片段aa368_aa606，其可在體外自組裝成為HEVVLP(Li等，Vaccine.2005，23J893-2901；Li等，JBC.2005，沘(5)3400-3406)。迄今為止，世界上進(jìn)入臨床試驗(yàn)的戊型肝炎疫苗有兩種一種是由GSK公司研制的包含桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)的HEV0RF2片段aal12-606的VLP疫苗，其在尼迫爾進(jìn)入了II期臨床試驗(yàn)，顯示了良好的免疫原性，然而由于各種原因，該研究被中斷；另一種是包含大腸桿菌表達(dá)的HEV0RF2片段aa368-aa606的VLP疫苗，其已經(jīng)完成III期臨床試驗(yàn)，顯示了良好的安全性和保護(hù)性(Zhu等，Lancet,2010).由此可見，HEVVLP具有良好的免疫反應(yīng)性和免疫原性，可用于研制戊型肝炎疫苗，是戊型肝炎疫苗的理想形式。因此，HEVVLP的組裝和調(diào)控機(jī)制對于戊型肝炎病毒的相關(guān)研究和戊型肝炎疫苗的生產(chǎn)具有重要的理論和實(shí)際指導(dǎo)意義。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)闡明了HEVVLP的組裝機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上提供了一種用于將HEV衣殼蛋白或其變體組裝成VLP的方法，提供了新的制備HEVVLP的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明中的相關(guān)術(shù)語的說明及解釋在本發(fā)明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的分析化學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室操作步驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的常規(guī)步驟。同時，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供相關(guān)術(shù)語的定義和解釋。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)”是指由大腸桿菌(菌株)與載體組成的表達(dá)系統(tǒng)，其中大腸桿菌(菌株)來源于市場上可得到的菌株，例如但不限于GI698，ER2566，BL21(DE3)，B834(DE3)，BLR(DE3)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“載體(vector)”是指，可將多聚核苷酸插入其中的一種核酸運(yùn)載工具。當(dāng)載體能使插入的多核苷酸編碼的蛋白獲得表達(dá)時，載體稱為表達(dá)載體。載體可以通過轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)或者轉(zhuǎn)染導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使其攜帶的遺傳物質(zhì)元件在宿主細(xì)胞中獲得表達(dá)。載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括但不限于質(zhì)粒；噬菌體；柯斯質(zhì)粒等等。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“HEV0RF2”是指戊型肝炎病毒(HEV)基因組的0RF2，其序列是本領(lǐng)域公知的(參見，例如DDBJ數(shù)據(jù)登錄號D11092)，并且編碼HEV的衣殼蛋白。在本發(fā)明中，當(dāng)涉及HEV0RF2的序列時，其使用DDBJ數(shù)據(jù)登錄號D11092所示的序列來進(jìn)行描述。例如，表述“HEV0RF2編碼的多肽的第368-606位氨基酸殘基”(在本文中也簡寫為，HEV0RF2片段aa368-aa606或HEV0RF2aa368-aa606)中的第368-606位氨基酸殘基是指，D11092編碼的多肽的第368-606位氨基酸殘基。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，在HEV0RF2或其編碼的多肽中，可天然產(chǎn)生或人工引入突變或變異(包括但不限于，置換，缺失和/或添加)，而不影響其生物學(xué)功能(在本發(fā)明中即，編碼能夠形成HEVVLP的衣殼蛋白)。因此，在本發(fā)明中，術(shù)語“HEV0RF2”應(yīng)包括所有此類序列，包括例如Dl1092所示的序列以及其天然或人工的變體。并且，當(dāng)描述HEV0RF2(或其編碼的多肽)的序列片段時，其不僅包括D11092(或其編碼的多肽)的序列片段，還包括D11092(或其編碼的多肽)的天然或人工變體中的相應(yīng)序列片段。例如，表述“HEV0RF2編碼的多肽的第368-606位氨基酸殘基”包括，D11092編碼的多肽的第368-606位氨基酸殘基，以及D11092編碼的多肽的變體(天然或人工)中的相應(yīng)片段。根據(jù)本發(fā)明，表述“相應(yīng)序列片段”或“相應(yīng)片段”是指，當(dāng)對序列進(jìn)行最優(yōu)比對時，即當(dāng)序列進(jìn)行比對以獲得最高百分?jǐn)?shù)同一性時，進(jìn)行比較的序列中位于等同位置的片段。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“HEV衣殼蛋白，，是指，由HEV0RF2編碼的蛋白，其能夠組裝成HEV病毒樣顆粒。根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)在蛋白/多肽的背景中使用時，術(shù)語“變體”是指這樣的蛋白，其氨基酸序列與參照蛋白/多肽(例如，本發(fā)明的HEV衣殼蛋白)的氨基酸序列具有一個或多個(例如1-10個或1-5個或1-3個)氨基酸差異(例如，保守氨基酸置換)，或者具有至少60%，80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，或99%的同一性，并且其保留了參照蛋白/多肽的必要特性。在本發(fā)明中，蛋白/多肽(例如，本發(fā)明的HEV衣殼蛋白)的必要特性可以指，具有組裝成HEV病毒樣顆粒的能力。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“同一性”用于指兩個多肽之間或兩個核酸之間序列的匹配情況。當(dāng)兩個進(jìn)行比較的序列中的某個位置都被相同的堿基或氨基酸單體亞單元占據(jù)時(例如，兩個DNA分子的每一個中的某個位置都被腺嘌呤占據(jù)，或兩個多肽的每一個中的某個位置都被賴氨酸占據(jù))，那么各分子在該位置上是同一的。兩個序列之間的“百分?jǐn)?shù)同一性”是由這兩個序列共有的匹配位置數(shù)目除以進(jìn)行比較的位置數(shù)目XlOO的函數(shù)。例如，如果兩個序列的10個位置中有6個匹配，那么這兩個序列具有60%的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(總共6個位置中有3個位置匹配)。通常，在將兩個序列比對以產(chǎn)生最大同一性時進(jìn)行比較。這樣的比對可通過使用，例如，可通過計算機(jī)程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地進(jìn)行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48=443-453的方法來實(shí)現(xiàn)。還可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAMl20權(quán)重殘基表(weightresiduetable),12的缺口長度罰分和4的缺口罰分來測定兩個氨基酸序列之間的百分?jǐn)?shù)同一性。此外，可使用已整合入GCG軟件包(可在www.gcg.com上獲得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(JMoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣以及16、14、12、10、8、6或4的缺口權(quán)重(gapweight)和1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重來測定兩個氨基酸序列之間的百分?jǐn)?shù)同一性。如本文中使用的，術(shù)語“保守置換”意指不會不利地影響或改變包含氨基酸序列的蛋白/多肽的生物學(xué)功能的氨基酸置換。例如，可通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變引入保守置換。保守氨基酸置換包括用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替代氨基酸殘基的置換，例如用在物理學(xué)上或功能上與相應(yīng)的氨基酸殘基相似(例如具有相似大小、形狀、電荷、化學(xué)性質(zhì)，包括形成共價鍵或氫鍵的能力等)的殘基進(jìn)行的置換。已在本領(lǐng)域內(nèi)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸和組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。因此，優(yōu)選用來自相同側(cè)鏈家族的另一個氨基酸殘基替代相應(yīng)的氨基酸殘基。鑒定氨基酸保守置換的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的(參見，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人ProteinEng.12(10):879-884(1999)；禾口Burks等人Proc.NatlAcad.SetUSA94:412-417(1997)，其通過引用并入本文)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“p239”是指HEV0RF2片段aa368_aa606(其在aa368之前還包含由起始密碼子編碼的甲硫氨酸)，其具有組裝成為HEVVLP的能力，可用于制備戊型肝炎疫苗，并且可用于研究HEVVLP的組裝機(jī)制。p239多肽的示例性氨基酸序列如SEQIDNO2所示，其示例性編碼序列如SEQIDNO1所示。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“E2”是指，HEV0RF2片段aa394_aa606(其在aa394之前還包含由起始密碼子編碼的甲硫氨酸)，其不具有組裝成為HEVVLP的能力。E2多肽的示例性氨基酸序列如SEQIDNO4所示，其示例性編碼序列如SEQIDNO3所示。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“病毒樣顆粒(VLP)”是指不含病毒核酸的、在結(jié)構(gòu)上與天然的病毒顆粒相似的空殼結(jié)構(gòu)，其通常由病毒衣殼蛋白或其變體或片段組成。由于VLP在結(jié)構(gòu)上與天然的病毒顆粒十分相似，因此，其具有很強(qiáng)的免疫原性和免疫反應(yīng)性。同時，由于VLP不含病毒的遺傳物質(zhì)，因此，其不具有感染性。由于上述優(yōu)點(diǎn)，VLP已被開發(fā)用作疫苗，其中一些VLP疫苗已經(jīng)成功應(yīng)用于臨床，舉例但不限于=Merck的四價VLPGardasil疫苗，P239VLP疫苗等等。VLP在結(jié)構(gòu)上允許外源基因或基因片段的插入而形成嵌合型VLP，并且能夠?qū)⑼庠葱钥乖故驹谄浔砻?。此外，大部分VLP還具有包裹核酸或其他小分子的能力，因此，其還可作為基因或藥物的運(yùn)載工具。病毒樣顆粒在本申請中也簡稱為顆粒。如本發(fā)明中使用的，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在不存在變性因素的條件下能夠組裝成病毒樣顆粒時，該蛋白質(zhì)被稱為“具有組裝成病毒樣顆粒的能力”。在本發(fā)明中，“變性因素”是指，能夠使蛋白質(zhì)發(fā)生變性的因素，其包括但不限于，高溫(例如，加熱)，變性劑(例如尿素)等等。許多病毒衣殼蛋白或其變體或片段都具有組裝成病毒樣顆粒的能力。然而，并非所有的衣殼蛋白或其變體或片段都能夠組裝成病毒樣顆粒，例如E2蛋白?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法來鑒定具有組裝成病毒樣顆粒的能力的衣殼蛋白或其變體或片段。例如，可通過下述步驟來確定衣殼蛋白或其變體或片段是否具有組裝成病毒樣顆粒的能力在室溫下將衣殼蛋白或其變體或片段置于不含變性劑的溶液中，然后檢測病毒樣顆粒的存在。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“疏水相互作用”是指，非極性分子(例如，疏水氨基酸殘基)之間的一種弱的、非共價的相互作用。這些非極性分子在水相環(huán)境中具有避開水而相互聚集的傾向。疏水相互作用是通過疏水分子與水的相互排斥作用而發(fā)生的。這種作用使得疏水分子相互靠攏，同時使水相互集中，從而更大程度地結(jié)構(gòu)化。疏水相互作用對大多數(shù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)非常關(guān)鍵。例如，蛋白質(zhì)通過疏水相互作用使大部分疏水氨基酸殘基相互聚集。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“組裝”是指病毒的結(jié)構(gòu)蛋白(例如衣殼蛋白)之間或結(jié)構(gòu)蛋白與核酸之間通過各種相互作用，形成有規(guī)則的顆粒狀結(jié)構(gòu)的過程，其包括天然病毒顆粒的組裝和病毒樣顆粒的組裝。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“蛋白質(zhì)變性(denaturation)”是指，蛋白質(zhì)因受某些物理或化學(xué)因素的影響，分子的空間構(gòu)象被破壞，從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)發(fā)生改變并失去原有的生物學(xué)活性的現(xiàn)象。變性作用并不引起蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的破壞，而是引起二級結(jié)構(gòu)以上的高級結(jié)構(gòu)的破壞，變性后的蛋白質(zhì)稱為變性蛋白。如果變性條件劇烈持久，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象和生物學(xué)活性不可逆地被破壞，那么蛋白質(zhì)的變性是不可逆的(即，不可逆變性)。如果變性條件不劇烈，變性蛋白在一定條件下可恢復(fù)其天然構(gòu)象和生物學(xué)活性，那么蛋白質(zhì)的變性是可逆的(即，可逆變性)。在可逆變性的情況下，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化不大。這時，如果去除變性因素，那么變性蛋白質(zhì)將恢復(fù)其天然構(gòu)象和生物學(xué)活性，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)復(fù)性(renaturation)。蛋白質(zhì)可逆變性和復(fù)性的實(shí)例舉例如下當(dāng)將胃蛋白酶加熱至80-90°C時，其失去溶解性，也無消化蛋白質(zhì)的能力，然而如果將溫度再降低到37°C，則其又可恢復(fù)溶解性和消化蛋白質(zhì)的能力。根據(jù)本發(fā)明，宿主細(xì)胞的破碎可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種方法來實(shí)現(xiàn)，包括但不限于勻漿器破碎、均質(zhì)機(jī)破碎、超聲波處理、研磨、高壓擠壓、溶菌酶處理等等。根據(jù)本發(fā)明，各種緩沖液是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于，磷酸鹽緩沖液等等?？捎糜诒景l(fā)明的方法中的鹽包括但不限于酸式鹽，堿式鹽，中性鹽，例如堿金屬鹽、堿土金屬鹽、銨鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、碳酸氫鹽、磷酸鹽或磷酸氫鹽，特別是NaCl、NH4Cl,(NH4)2SCVNa2SO4中的一種或幾種。根據(jù)本發(fā)明，特別優(yōu)選的鹽是(NH4)2S04。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”具有相同的含義，可互換使用。根據(jù)本發(fā)明，氨基酸通常用本領(lǐng)域公知的單字母和三字母縮寫來表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“藥學(xué)可接受的載體和/或賦形劑”是指在藥理學(xué)和/或生理學(xué)上與受試者和活性成分相容的載體和/或賦形劑，其是本領(lǐng)域公知的(參見例如Remington‘sPharmaceuticalSciences.EditedbyGennaroAR,19thed.Pennsylvania=MackPublishingCompany,1995)，并且包括但不限于pH調(diào)節(jié)劑，表面活性劑，佐劑，離子強(qiáng)度增強(qiáng)劑。例如，PH調(diào)節(jié)劑包括但不限于磷酸鹽緩沖液；表面活性劑包括但不限于陽離子，陰離子或者非離子型表面活性劑，例如Tween-80；佐劑包括但不限于鋁佐劑(例如氫氧化鋁)，弗氏佐劑(例如完全弗氏佐劑)；離子強(qiáng)度增強(qiáng)劑包括但不限于氯化鈉。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，HEV衣殼蛋白(包括其變體或片段)在變性劑(例如尿素)存在的情況下，不能組裝成HEVVLP。在通常的情況下，需要將變性劑去除，HEV衣殼蛋白才能夠組裝成VLP。然而，發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)HEV衣殼蛋白或其變體或片段(例如，p239蛋白)在溶液中存在變性劑(例如，4M尿素)的情況下，當(dāng)向溶液中添加一定濃度的鹽(例如至少0.3M硫酸銨)時，能夠自組裝成VLP，而無需將溶液中的變性劑去除。此外，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，硫酸銨的加入有助于HEV衣殼蛋白或其變體或片段形成更加均一的VLP，并且VLP的組裝速度受溶液中的鹽濃度以及溫度的影響。因此，在一個方面，本發(fā)明提供了制備戊型肝炎病毒(HEV)的病毒樣顆粒(VLP)的方法，其包括步驟在變性劑存在的條件下，通過添加鹽使HEV衣殼蛋白或其變體或片段組裝成VLP，其中所述HEV衣殼蛋白或其變體或片段具有組裝成VLP的能力。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變性劑例如可以是尿素、脲、鹽酸胍或其組合。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變性劑是尿素，例如4M尿素。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述鹽例如可以是NaCl、NH4Cl、(NH4)2SO4,Na2SO4或其組合，并且特別優(yōu)選地是(NH4)2SO415在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述鹽的離子強(qiáng)度為至少0.9mo1/kg。例如，所述鹽可以是至少0.3M的(NH4)2SO40在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述HEV衣殼蛋白或其變體或片段例如可以是以包含體形式表達(dá)于大腸桿菌中的HEV衣殼蛋白或其變體或片段。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述HEV衣殼蛋白的變體或片段例如可以是p239蛋白。優(yōu)選地，所述P239蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。在另一個方面，本發(fā)明提供了制備戊型肝炎病毒(HEV)的病毒樣顆粒(VLP)的方法，其包括如下步驟1)提供具有組裝成VLP的能力的HEV衣殼蛋白或其變體或片段；2)將步驟1)的HEV衣殼蛋白或其變體或片段溶解于含變性劑的溶液中；3)向步驟幻獲得的溶液中添加鹽，以使所述HEV衣殼蛋白或其變體或片段組裝成VLP；任選地，在進(jìn)行步驟幻之前，對在含變性劑的溶液中的HEV衣殼蛋白或其變體或片段進(jìn)行純化，例如，通過陰離子交換層析和/或疏水相互作用層析進(jìn)行純化；任選地，在步驟幻之后，去除溶液中的變性劑，例如通過將含有HEVVLP的溶液透析到PBS溶液中來去除變性劑。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟1)中，例如通過將其以包含體形式表達(dá)于大腸桿菌中來提供所述HEV衣殼蛋白或其變體或片段。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述HEV衣殼蛋白的變體或片段是p239蛋白。優(yōu)選地，所述p239蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟2、中，所述變性劑例如可以是尿素、脲、鹽酸胍或其組合。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變性劑是尿素，例如4M尿素。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟3)中，所述鹽例如可以是NaCl、NH4Cl、(NH4)2SCVNa2SO4或其組合，并且特別優(yōu)選地是(NH4)2S04。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述鹽的離子強(qiáng)度為至少0.9mol/kg。例如，所述鹽可以是至少0.3M的(NH4)2S04。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，HEV病毒樣顆粒具備良好的免疫反應(yīng)性和免疫原性，可用于研制重組戊型肝炎疫苗。因此，在一個方面，本發(fā)明還提供了制備用于預(yù)防和/或治療戊型肝炎的疫苗的方法，其包括1)根據(jù)本發(fā)明的方法來制備HEV病毒樣顆粒；2)將所獲得的HEV病毒樣顆粒與藥學(xué)可接受的載體和/或賦形劑組合，從而制備疫苗。在另一個方面，本發(fā)明還提供了用于預(yù)防和/或治療戊型肝炎的疫苗，其是根據(jù)本發(fā)明的上述方法獲得的，或包含根據(jù)本發(fā)明的方法制備而得的HEV病毒樣顆粒。任選地，本發(fā)明的疫苗還可以包含藥學(xué)可接受的載體和/或賦形劑。在另一個方面，本發(fā)明提供了控制HEV衣殼蛋白或其變體或片段組裝成VLP的組裝速度的方法，其包括步驟控制包含HEV衣殼蛋白或其變體或片段的溶液的鹽濃度和/或控制所述溶液的溫度，其中所述HEV衣殼蛋白或其變體或片段具有組裝成VLP的能力。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述HEV衣殼蛋白或其變體或片段例如可以是以包含體形式表達(dá)于大腸桿菌中的HEV衣殼蛋白或其變體或片段。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述HEV衣殼蛋白的變體或片段是p239蛋白。優(yōu)選地，所述p239蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述溶液包含或不包含變性劑。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變性劑例如可以是尿素、脲、鹽酸胍或其組合。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變性劑是尿素，例如4M尿素。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述溶液包含的鹽為NaCl、NH4Cl、(NH4)2SO4,Na2SO4或其組合，優(yōu)選(NH4)2S04。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)所述溶液的鹽濃度升高和/或所述溶液的溫度升高時，所述組裝速度加快。在另一個方面，本發(fā)明提供了鹽用于促進(jìn)具有組裝成VLP的能力的HEV衣殼蛋白或其變體或片段組裝成VLP的用途。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述HEV衣殼蛋白或其變體或片段例如可以是以包含體形式表達(dá)于大腸桿菌中的HEV衣殼蛋白或其變體或片段。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述HEV衣殼蛋白的變體或片段是p239蛋白。優(yōu)選地，所述p239蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述鹽例如可以是NaCl、NH4Cl、(NH4)2SO4,Na2SO4或其組合，并且特別優(yōu)選地是(NH4)2SO415在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述鹽的離子強(qiáng)度為至少0.9mol/kg。例如，所述鹽可以是至少0.3M的(NH4)2SO40在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述鹽在變性劑存在或不存在的條件下用于促進(jìn)VLP的組裝。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變性劑例如可以是尿素、脲、鹽酸胍或其組合。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變性劑是尿素，例如4M尿素。在另一個方面，本發(fā)明提供了破壞HEV衣殼蛋白或其變體或片段的顆粒組裝能力的方法，其包括將HEV衣殼蛋白或其變體或片段中的位于與HEV0RF2aa368_395對應(yīng)的區(qū)域中的疏水氨基酸突變?yōu)橛H水氨基酸。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述HEV衣殼蛋白的變體或片段包含與HEV0RF2aa368-395對應(yīng)的區(qū)域。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述HEV衣殼蛋白的變體或片段是P239蛋白。優(yōu)選地，所述p239蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述位于與HEV0RF2aa368_395對應(yīng)的區(qū)域中的疏水氨基酸可以是HEV0RF2的第372、375或395位亮氨酸。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述亮氨酸被突變?yōu)楣劝彼?。在另一個方面，本發(fā)明提供了促進(jìn)HEV衣殼蛋白或其變體或片段組裝成VLP的方法，其包括將HEV衣殼蛋白或其變體或片段中的位于與HEV0RF2aa368_395對應(yīng)的區(qū)域中的親水氨基酸突變?yōu)槭杷被?。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述HEV衣殼蛋白的變體或片段包含與HEV0RF2aa368-395對應(yīng)的區(qū)域。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述HEV衣殼蛋白的變體或片段是P239蛋白。優(yōu)選地，所述p239蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0:2所示。如本發(fā)明中所使用的，表述“與HEV0RF2aa368-395對應(yīng)的區(qū)域”是指，當(dāng)序列與HEV0RF2編碼的多肽進(jìn)行最優(yōu)比對時，即當(dāng)進(jìn)行比對以獲得最高百分?jǐn)?shù)同一性時，進(jìn)行比較的序列中與HEV0RF2aa368-395處于等同位置的區(qū)域。發(fā)明的有益效果目前用于制備HEV病毒樣顆粒的表達(dá)系統(tǒng)可以分為真核表達(dá)系統(tǒng)和原核表達(dá)系統(tǒng)。在真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的HEV衣殼蛋白天然構(gòu)象破壞少，能自發(fā)形成VLP，往往表達(dá)出來后即為具有正確構(gòu)象的VLP。但目前真核表達(dá)系統(tǒng)例如桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)存在表達(dá)量低，培養(yǎng)成本高等缺陷，給大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)帶來了極大困難，并且不利于在細(xì)胞內(nèi)研究VLP的組裝機(jī)制。在原核表達(dá)系統(tǒng)中，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有培養(yǎng)成本低，表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)。然而，在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白往往失去正確的天然構(gòu)象，以包含體形式表達(dá)于沉淀中。目前對表達(dá)于包含體中的蛋白進(jìn)行復(fù)性和顆粒組裝是一個難題。復(fù)性困難和效率低下使得從包含體中獲得具有正確構(gòu)象的VLP難以在大規(guī)模生產(chǎn)中實(shí)施，只能局限于小規(guī)模的實(shí)驗(yàn)室研究中。本發(fā)明在闡明HEV衣殼蛋白組裝成VLP的機(jī)制的基礎(chǔ)上，提供了新的將HEV衣殼蛋白組裝成VLP的方法，有效地解決了上述問題。首先，本發(fā)明使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)HEV衣殼蛋白(p239蛋白)，確保了較高表達(dá)量。其次，本發(fā)明的方法使得能夠簡單、快速且方便地使表達(dá)于包含體中的HEV衣殼蛋白進(jìn)行復(fù)性和顆粒組裝，并且組裝得到的HEVVLP經(jīng)證實(shí)具有良好的免疫反應(yīng)性和免疫原性，與天然病毒顆粒形態(tài)相似，是適合于大規(guī)模生產(chǎn)的良好疫苗形式。第三，本發(fā)明所提供的將HEV衣殼蛋白組裝成VLP的方法操作簡單，重復(fù)性好，可應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。因此，本發(fā)明的方法使得將大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用于戊型肝炎疫苗的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)成為可能。此外，本發(fā)明證實(shí)，通過控制鹽濃度和/或溫度，可以控制HEV衣殼蛋白或其變體至VLP的組裝，并且證實(shí)，在一定濃度的鹽(例如，0.3M硫酸銨)存在的情況下，組裝獲得的HEVVLP更加均一。這對于戊型肝炎疫苗的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的控制和標(biāo)準(zhǔn)化十分有利。最后，本發(fā)明的HEVVLP可在變性劑(例如，尿素)存在的情況下組裝得到。因此，本發(fā)明所提供的新的VLP組裝方法，為控制VLP組裝提供了一種新的思路，也為蛋白質(zhì)的聚集提供了一種全新的視界。下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，下列附圖和實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的范圍的限定。根據(jù)附圖和優(yōu)選實(shí)施方案的下列詳細(xì)描述，本發(fā)明的各種目的和有利方面對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將變得顯然。圖1衍生自戊型肝炎病毒衣殼蛋白的p239和E2(對照蛋白)在4M尿素中的形式。圖IA顯示了p239在4M尿素中的沉降速率實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；圖IB顯示了E2在4M尿素中的沉降速率實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；圖IC顯示了p239在4M尿素中的沉降平衡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；圖ID顯示了E2在4M尿素中的沉降平衡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。從圖1中可知，在不存在鹽的情況下，p239和E2在4M尿素中均呈現(xiàn)單一組分，為均一的二聚體形式，不能組裝成VLP。圖2用不同濃度的硫酸銨孵育M小時后的p239和E2的沉降系數(shù)的測定。將p239(圖2A-D)和E2(圖2E-H)分別在含有不同濃度的硫酸銨的4M尿素中孵育M小時，然后透析至PBS溶液中以進(jìn)行復(fù)性。其中，p239圖2A，OM(NH4)2SO4；圖2Β，0·3Μ(NH4)2SO4；圖2C，0.5M(NH4)2SO4；圖2D，1.OM(NH4)2SO40E2圖2E,OM(NH4)2SO4；圖2F，0.3M(NH4)2SO4；圖2G，0.5M(NH4)2SO4；圖2H，1.OM(NH4)2SO40從圖2中可知，硫酸銨的孵育有利于p239形成VLP顆粒(圖2A-D)，而對E2沒有影響(圖2E-H)。另外，未經(jīng)硫酸銨處理的p239復(fù)性后呈現(xiàn)兩種不同大小的組分(圖2A)，這表明硫酸銨的處理可促使p239形成更均一的顆粒。圖3用不同濃度的硫酸銨孵育6小時后的p239在尿素中的狀態(tài)分析。圖3A，遠(yuǎn)紫外圓二色光譜結(jié)果，黑線為未組裝的P239，紅線為在4M尿素+0.3M(NH4)2SO4中處理6小時的P239，蘭線為經(jīng)組裝的p239顆粒；圖!3B，近紫外圓二色光譜結(jié)果，黑線為未組裝的p239，紅線為在4M尿素+0.3M(NH4)2SO4中處理6小時的p239，蘭線為經(jīng)組裝的p239顆粒；圖3C，分子篩層析分析結(jié)果，1暗綠線為未組裝的P239，2亮綠線為在4M尿素+0.3M(NH4)2S04中處理6小時的p239，3棕線為在4M尿素+0.5M(NH4)2SO4中處理6小時的p239，4粉紅線為在4M尿素+1.OM(NH4)2SO4中處理6小時的p239，5蘭線為經(jīng)組裝的p239顆粒；圖3D，動態(tài)光散射分析結(jié)果，在4M尿素+0.3M(NH4)2SO4中處理6小時的p239。從圖3可知，在尿素中加入一定濃度的硫酸銨并且孵育6小時后，p239即可組裝成VLP，而無需去除變性劑尿素。該結(jié)果表明，在存在變性劑的情況下，P239的組裝可通過一定的鹽濃度來誘導(dǎo)。圖4不同的鹽離子和不同的鹽濃度對p239蛋白的顆粒組裝的影響。將未組裝的P239蛋白加入到含不同濃度(0.3Μ，0·5Μ或1.0Μ)的(NH4)2S04，Na2SO4,NH4Cl或NaCl的4M尿素中并且孵育6小時，然后測定p239的沉降系數(shù)。結(jié)果顯示，離子強(qiáng)度的升高可促進(jìn)p239的組裝，并且P239的組裝需要一定的離子強(qiáng)度，即至少約0.9mol/kg的離子強(qiáng)度(0.3M硫酸銨的離子強(qiáng)度為0.9mo1/kg)。圖5:p239蛋白在含不同濃度(0.3M，0.5M或1.0M)的(NH4)2S04的4M尿素中的組裝的動態(tài)過程(在孵育后第1、2、3、4、5、6、7和8小時的時間點(diǎn)進(jìn)行分析)。圖5A，用0.3M(NH4)2SO4,25°C處理的p239的組裝過程；圖5B，用0.3M(NH4)2SO4,37°C處理的p239的組裝過程；圖5C，用0.5M(NH4)2SO4,25°C處理的p239的組裝過程；圖5D，用0.5M(NH4)2SO4,37°C處理的p239的組裝過程；圖5E，用1.OM(NH4)2S04，25°C處理的p239的組裝過程；圖5F，用1.OM(NH4)2S04，37°C處理的p239的組裝過程；圖5G，對照樣品E2蛋白在含有0.0Μ、0·3Μ、0.5Μ或1.OM(NH4)2SO4的4Μ尿素中于37°C孵育M小時后的沉降速率分析。從圖5中可以看出，P239的組裝速度與溫度和(NH4)2SO4濃度呈正相關(guān)濃度越高，組裝速度越快，并且溫度越高，組裝速度也越快。圖6:p239在含有不同濃度的硫酸銨的尿素中，在不同溫度下的組裝動態(tài)過程的組分分析。圖6A，在25°C孵育溫度和不同(NH4)2SO4*度下，p239組裝過程中的組分分布；圖6B，在37°C孵育溫度和不同(NH4)2SO4濃度下，p239組裝過程中的組分分布；圖6C，在25°C孵育溫度和不同(NH4)2SO4濃度下，p239組裝過程中的各組分的變化曲線；圖6D，在37°C孵育溫度和不同(NH4)2SO4濃度下孵育Mhr后，p239顆粒和E2蛋白的沉降系數(shù)的分布范圍。從圖6A-6C可以看出，隨著溫度的增加或(NH4)2SO4濃度的提高，p239的組裝速度加快。從圖6D可以看出，(NH4)2SO4濃度對p239顆粒和E2蛋白的沉降系數(shù)的影響趨勢是一致的隨著(NH4)2SO4濃度的提高，沉降系數(shù)下降。圖7在4M尿素中組裝的p239顆粒的最終組裝狀態(tài)的分析。p239蛋白在含有0.5M(NH4)2SO4的尿素中在37°C下孵育12小時，以組裝成p239顆粒，然后將其透析至PBS溶液中，從而得到P239顆粒的最終組裝狀態(tài)。圖7A，p239顆粒最終組裝狀態(tài)的透射電鏡分析，Bar=IOOnm；圖7B，p239顆粒最終組裝狀態(tài)的沉降速率分析；圖7C，p239顆粒最終組裝狀態(tài)的分子篩高效液相色譜分析；圖7D，p239顆粒最終組裝狀態(tài)的動態(tài)光散射分析。從圖7可以看出，p239蛋白組裝成了均一的HEV病毒樣顆粒。圖8:p239蛋白組裝成為病毒樣顆粒時在三倍軸位置的相互作用。圖8A，三倍軸位置的α-螺旋的相互作用；圖8Β，三倍軸位置的局部放大圖，其顯示，HEV衣殼蛋白的第397位和第443位的酪氨酸殘基側(cè)鏈在相互作用中具有重要貢獻(xiàn)。圖9:ρ239蛋白在組裝過程中形成的三聚化中間態(tài)的N端結(jié)構(gòu)域模型。圖9Α，ρ239蛋白N端結(jié)構(gòu)域的骨架；圖9Β，ρ239蛋白N端結(jié)構(gòu)域形成的疏水核(藍(lán)色表面)，其中HEV衣殼蛋白的第372，375和395位的亮氨酸殘基對疏水作用有重要貢獻(xiàn)；圖9C，ρ239蛋白三聚化中間態(tài)的結(jié)構(gòu)模型(朝內(nèi)看視圖)；圖9D，ρ239蛋白三聚化中間態(tài)的結(jié)構(gòu)模型(朝外看視圖)。注該模型摘自HEV3型病毒樣晶體結(jié)構(gòu)中與ρ239對應(yīng)的部分(所述晶體結(jié)構(gòu)在PDB數(shù)據(jù)庫中的編號為2ΖΤΝ，參見Yamashita等，ProcNatlAcadSciUSA,2009,10612986-12991)。圖10:p239蛋白N端結(jié)構(gòu)域的突變分析。圖10A，p239及其3個點(diǎn)突變蛋白(L372E、L375E和L395E)的SDS-PAGE和Western印跡分析；圖10B，p239及其3個點(diǎn)突變蛋白(L372E、L375E和L395E)的分子篩層析分析。從圖10可以看出，3個點(diǎn)突變蛋白(L372E、L375E和L395E)均不能組裝成為顆粒，并且失去了與戊肝恢復(fù)期患者血清的免疫反應(yīng)性。在圖IOA中，N表示該樣品為未經(jīng)加熱處理的樣品，H表示該樣品為在沸水浴中溫育了3分鐘的樣品；(+)表示該樣品包含二聚體或具有單抗反應(yīng)活性和(_)表示該樣品不包含二聚體或無單抗反應(yīng)活性。序列信息本發(fā)明涉及的序列的信息提供于下面的表1中。表1:序列的描述序列號(SEQIDNO:)描述1編碼p239蛋白的核苷酸序列2P239蛋白的氨基酸序列3編碼E2蛋白的核苷酸序列4E2蛋白的氨基酸序列序列1(SEQIDNO:1)ATGATAGCGCTTACCCTGTTTAACCTTGCTGACACCCTGCTAGGCGGTCTACCCACAGAATTGATTTCGTCGGCAGGTGGACAGCTGTTCTACTCTCGTCCCGTTGTCTCGGCCAATGGCGAGCCGACTGTTAAGCTTTATACATCTGTAGAGAATGCTCAGCAGGATAAGGGTATTGCAATCCCGCATGACATCGACCTCGGGGAGTCTCGTGTAGTTATTCAGGATTATGACAACCAACATGAGCAGGACCGACCGACACCTTCCCCAGCCCCATCGCGCCCTTTTTCTGTCCTCCGAGCTAATGATGTGCTTTGGCTTTCTCTCACCGCTGCCGAGTATGACCAGTCCACTTACGGCTCTTCGACCGGCCCAGTCTATGTCTCTGACTCTGTGACCTTGGTTAATGTTGCGACCGGCGCGCAGGCCGTTGCCCGGTCACTCGACTGGACCAAGGTCACACTTGATGGTCGCCCCCTTTCCACCATCCAGCAGCATTCAAAGACCTTCTTTGTCCTGCCGCTCCGCGGTAAGCTCTCCTTTTGGGAGGCAGGTACTACTAAAGCCGGGTACCCTTATAATTATAACACCACTGCTAGTGACCAACTGCTCGTTGAGAATGCCGCTGGGCATCGGGTTGCTATTTCCACTTACACCACTAGCCTGGGTGCTGGCCCCGTCTCTATTTCCGCGGTTGCTGTTTTAGCCCCCCCTCCGCGCTAG序列2(SEQIDNO2)MIALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGIAIPHDIDLGESRWIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQSTYGSSTGPVYVSDSVTLVNVATGAQAVARSLDffTKVTLDGRPLSTTQQYSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQLLVENAAGHRVAISTYTTSLGAGPVSISAVAVLAPPPR序列3(SEQIDNO3)ATGCAGCTGTTCTACTCTCGTCCCGTTGTCTCGGCCAATGGCGAGCCGACTGTTAAGCTTTATACATCTGTAGAGAATGCTCAGCAGGATAAGGGTATTGCAATCCCGCATGACATCGACCTCGGGGAGTCTCGTGTAGTTATTCAGGATTATGACAACCAACATGAGCAGGACCGACCGACACCTTCCCCAGCCCCATCGCGCCCTTTTTCTGTCCTCCGAGCTAATGATGTGCTTTGGCTTTCTCTCACCGCTGCCGAGTATGACCAGTCCACTTACGGCTCTTCGACCGGCCCAGTCTATGTCTCTGACTCTGTGACCTTGGTTAATGTTGCGACCGGCGCGCAGGCCGTTGCCCGGTCACTCGACTGGACCAAGGTCACACTTGATGGTCGCCCCCTTTCCACCATCCAGCAGCATTCAAAGACCTTCTTTGTCCTGCCGCTCCGCGGTAAGCTCTCCTTTTGGGAGGCAGGTACTACTAAAGCCGGGTACCCTTATAATTATAACACCACTGCTAGTGACCAACTGCTCGTTGAGAATGCCGCTGGGCATCGGGTTGCTATTTCCACTTACACCACTAGCCTGGGTGCTGGCCCCGTCTCTATTTCCGCGGTTGCTGTTTTAGCCCCCCCTCCGCGCTAG序列4(SEQIDNO4)MQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGIAIPHDIDLGESRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQSTYGSSTGPVYVSDSVTLVNVATGAQAVARSLDWTKVTLDGRPLSTTQQYSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQLLVENAAGHRVAISTYTTSLGAGPVSISAVAVLAPPPR具體實(shí)施例方式現(xiàn)參照下列意在舉例說明本發(fā)明(而非限定本發(fā)明)的實(shí)施例來描述本發(fā)明。除非特別指明，本發(fā)明中所使用的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法和免疫檢測法，基本上參照J(rèn).Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南，第3版，Johnffiley&Sons,Inc.,1995中所述的方法進(jìn)行。實(shí)施例中未注明具體條件者，均按照本領(lǐng)域通常已知的常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，實(shí)施例以舉例方式描述本發(fā)明，且不意欲限制本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例1衍生自HEV衣殼蛋白的p239在尿素中的狀態(tài)按照之前描述的方法(中國發(fā)明專利=ZL02822218.O；Li等人，JBC,2005；和Li等人，Vaccine，2005)，克隆、表達(dá)和純化衍生自戊型肝炎病毒衣殼蛋白的p239(HEV0RF2aa368-606，其核酸序列和氨基酸序列分別如SEQIDNO1和SEQIDNO2所示)。p239蛋白保留了HEV衣殼蛋白的組裝為病毒樣顆粒的能力，用于分析HEVVLP的組裝機(jī)制。p239蛋白主要以包含體的形式在大腸桿菌中表達(dá)。經(jīng)過洗滌純化后，包含體中的大部分P239蛋白溶解于4M尿素溶液中，然后使用陰離子交換層析和疏水相互作用層析在含有4M尿素的溶液中將P239蛋白純化至95%以上的純度，以用于后續(xù)的分析。此外，以同樣的方法表達(dá)和純化衍生自HEV衣殼蛋白的E2蛋白(HEV0RFha394-606，其核酸序列和氨基酸序列分別如SEQIDNO:3和SEQIDN0:4所示)。E2蛋白喪失了組裝為病毒樣顆粒的能力(參見Li等人，JBC，2005)，用作對照。按照之前描述的方法，使用分析型超速離心機(jī)(XL-Α型，美國Beckman公司生產(chǎn))，通過沉降速率法和沉降平衡法(SchuckP等，BiophysJ,2000,78:1606-1619)測定p239在4M尿素溶液中的狀態(tài)。測定結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，P239蛋白在4M尿素溶液中呈現(xiàn)單一組分，其沉降系數(shù)為1.7s，摩擦系數(shù)為1.94(圖1A)，分子量為45772士730Da(理論單體分子量為25521Da)(圖1C)。這表明，p239蛋白在4M尿素溶液中為組分單一的二聚體形式，且為結(jié)構(gòu)較為舒展的非球狀蛋白(球狀蛋白的摩擦系數(shù)為1.2)。對照蛋白E2在4M尿素溶液中亦為均一的二聚體形式，其沉降系數(shù)為2.Os,摩擦系數(shù)為1.94(圖1B)，分子量為40981士1523Da(理論單體分子量為23097Da)(圖ID)。上述結(jié)果說明，在4M尿素溶液中，P239蛋白的狀態(tài)與E2蛋白相同，二者均為均一的二聚體形式，并且無顆粒組分。實(shí)施例2:p239顆粒組裝的關(guān)鍵因素的發(fā)現(xiàn)利用疏水相互作用層析對4M尿素溶液中的p239蛋白進(jìn)行純化時，需要使用硫酸銨來增加蛋白的疏水性。通常，在進(jìn)行WienylFK印harose層析時，上樣液中含有IM硫酸銨，并且最終用含有0.1-0.2M硫酸銨的溶液進(jìn)行p239蛋白的洗脫。在洗脫后，一般通過去除溶液中的變性劑尿素來使P239蛋白復(fù)性并組裝為顆粒。在本申請中，發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，將尿素溶液中的硫酸銨增加到至少0.3M，并且放置一段時間后，p239蛋白在尿素存在的情況下即可組裝為顆粒，而無需去除尿素(即，與尿素是否存在無關(guān))。以下是對P239蛋白的組裝機(jī)制和過程的研究結(jié)果。將經(jīng)純化的p239蛋白(在4M尿素溶液中)稀釋至1.Omg/ml，并且向溶液中添加(NH4)2SO4直至終濃度為0M、0.3M、0.5M或1M，并且尿素的濃度保持4M不變。將各個蛋白樣品分別置于37°C孵育M小時，然后分別對PBS溶液進(jìn)行透析復(fù)性。另外，還以同樣的方式處理E2蛋白，用作對照。處理后，如實(shí)施例1中所述，通過沉降速率法測定各個P239樣品和E2樣品在PBS溶液中的狀態(tài)。結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，硫酸銨的處理促進(jìn)了p239顆粒的形成(圖2A-D)。特別地，未經(jīng)硫酸銨處理的P239樣品(即，OM(NH4)2SO4)復(fù)性后呈現(xiàn)兩種不同大小的組分(圖2A)，表明硫酸銨的處理可促使p239形成更均一的顆粒；經(jīng)0.5M(NH4)2SO4處理的p239樣品呈現(xiàn)最均一的顆粒(圖2C)。相比之下，經(jīng)同樣方式處理的E2蛋白全部呈現(xiàn)為單一的2.7S組分，這表明E2蛋白仍為二聚體形式，而未發(fā)生顆粒組裝(圖2E-H)。D239m^Mm^m^mmim如之前所描述的，利用遠(yuǎn)紫外圓二色(CircularDichroism，CD)光譜、近紫外圓二色光譜(BeychokS，1966，Science,154(754):1288_1四9)，分子篩層析分析(RegnierFE,1983,Science,222(4621):245-252)和動態(tài)光散射分析(BnachowiczE，2006，BiochimBiophysActa,1764(3):405-413)等方法檢測p239蛋白在含不同濃度(0.3Μ、0·5M或1.OM)的硫酸銨的4Μ尿素中在37°C孵育6小時后的狀態(tài)。在室溫下在CD光譜儀(J-810型，日本JASCO公司生產(chǎn))上測定未組裝的p239蛋白(在4M尿素中)、經(jīng)0.3M硫酸銨處理的p239蛋白(在含0.3M硫酸銨的4M尿素中)以及經(jīng)切向流復(fù)性的P239顆粒(即，經(jīng)組裝的p239顆粒)的遠(yuǎn)紫外和近紫外⑶光譜。所使用的參數(shù)如下靈敏度/cm；波段寬度Inm；時間常數(shù)Isec；掃描速度50nm/min。⑶數(shù)據(jù)以橢圓值(θ)表示，單位為毫度(mdeg)。遠(yuǎn)紫外CD光譜分析所使用的樣品濃度*%ig/ml，掃描波長為190j60nm，比色皿光徑為0.Olcm；近紫外⑶光譜所使用的樣品濃度為0.5mg/ml，掃描波長為沈0-320歷，比色皿光徑為1cm。結(jié)果如圖3所示。⑶光譜分析的結(jié)果顯示，經(jīng)硫酸銨處理的p239蛋白的⑶光譜與經(jīng)組裝的P239顆粒的CD光譜更為相似，而與未組裝的P239蛋白的CD光譜存在顯著不同(參見圖3A和3B)，這說明經(jīng)硫酸銨處理的p239蛋白在結(jié)構(gòu)上與p239顆粒更為相似。分子篩層析分析的結(jié)果顯示，經(jīng)硫酸銨(0.3M、0.5M或1.0M)處理的p239樣品在4M尿素存在的情況下，已經(jīng)形成了與經(jīng)組裝的P239顆粒相同的顆粒組分，其顯著區(qū)別于未組裝的p239蛋白(參見圖3C)。動態(tài)光散射分析的結(jié)果顯示，經(jīng)硫酸銨處理的p239蛋白在4M尿素存在的情況下，已經(jīng)形成半徑為約20nm的顆粒(參見圖3D)。這些證據(jù)均表明，在尿素中加入一定濃度的硫酸銨并在37°C孵育6小時后，p239蛋白即可組裝成顆粒，而無需去除變性劑尿素(與尿素的存在與否無關(guān))，這說明P239蛋白的顆粒組裝可通過一定的鹽濃度來誘導(dǎo)。莉懷_碰棘0239胃_碰會_向在本實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)一步考察各種鹽((NH4)2SO4,Na2SO4,NH4Cl和NaCl)和鹽濃度(0.3M，0.5M或1.0M)對p239蛋白的顆粒組裝的影響。具體而言，將未組裝的p239蛋白加入到含不同濃度的(NH4)2SO4,Na2SO4,NH4Cl或NaCl的4M尿素溶液中，并于37°C孵育6小時，然后如實(shí)施例1中所述，進(jìn)行沉降系數(shù)的測定，觀察不同鹽離子和鹽濃度對P239蛋白的顆粒組裝的影響。結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示，不同種類的鹽離子均能促使239蛋白在尿素中組裝成顆粒，但需要達(dá)到一定的離子強(qiáng)度P239蛋白才能最終組裝成顆粒0.3MNaCl或NH4Cl不能誘使P239蛋白在尿素中組裝形成顆粒，溶液中的p239蛋白主要為沉降系數(shù)為1.6S的二聚體形式；當(dāng)NaCl或NH4Cl的濃度提高至IM時，p239蛋白開始組裝；0.3MNa2SO4或(NH4)2SO4足以誘使P239蛋白組裝形成顆粒；上述結(jié)果說明，P239蛋白的顆粒組裝需要一定的離子強(qiáng)度，即大于或等于0.9mol/kg的離子強(qiáng)度可促使p239蛋白組裝成顆粒。此外，圖4的結(jié)果還表明，不同陰離子對顆粒組裝的影響存在差異S042_的作用明顯優(yōu)于Cl_。p239在尿素中組裝的動態(tài)過程將(NH4)2SO4添加至p239蛋白/4M尿素中，使(NH4)2S04的終濃度分別為0.3Μ、0·5Μ和1Μ，蛋白終濃度為1.0mg/ml，尿素濃度仍維持4Μ不變，然后將其分別置于25°C和37°C兩種溫度下進(jìn)行孵育，每1小時取樣一次，共獲得8個樣品(孵育后第1、2、3、4、5、6、7和8小時的樣品)。按照實(shí)施例1中描述的方法，對獲得的所有樣品進(jìn)行沉降系數(shù)測定，以分析P239蛋白的顆粒組裝的動態(tài)過程。結(jié)果如圖5所示。結(jié)果顯示，不同濃度的(NH4)2SO4均可誘使p239蛋白在存在4M尿素的變性條件下發(fā)生組裝，且組裝需要一定的時間才能得到穩(wěn)定的組分，并且在組裝過程中形成了中間態(tài)(沉降系數(shù)4.5-5.5S)。結(jié)果還顯示，P239蛋白的組裝速度與溫度和(NH4)2SO4濃度都呈正相關(guān)(圖5A-5F)。(1)(NH4)2SO4濃度越高，組裝速度越快。特別地，在用0.3M或0.5M(NH4)2SO4進(jìn)行處理的情況下，在組裝過程中可觀察到明顯的中間態(tài)組分，而在IM(NH4)2SO4所誘導(dǎo)的組裝過程中，則未觀察到中間態(tài)組分，這進(jìn)一步證實(shí)組裝速度與(NH4)2SO4濃度呈正相關(guān)。(2)溫度越高，組裝速度越快。特別地，在用0.3M(NH4)#04進(jìn)行處理的情況下，在25°C下顆粒組裝在孵育6小時后達(dá)到穩(wěn)定，而在37°C下顆粒組裝僅需4小時即可達(dá)到穩(wěn)定。顆粒組裝達(dá)到穩(wěn)定所需的時間如下0.3M(NH4)2S04/25°C(6小時)=0.5M(NH4)2S04/250C(6小時)=1.OM(NH4)2S04/25°C(6小時)>0.3M(NH4)2S04/37°C(4小時)>0.5M(NH4)2S04/37°C(2小時)>1.OM(NH4)2S04/37°C(1小時)。由此可見，溫度對組裝速度的影響大于(NH4)2SO4濃度的影響。對照蛋白E2在含有0.0M、0.3M、0.5M或1.OM(NH4)2SO4的4M尿素中于37°C孵育M小時后均未形成顆粒組分(圖5G)。此外還發(fā)現(xiàn)，(NH4)2SO4濃度越高，p239顆粒和E2蛋白的沉降系數(shù)越小，這表明(NH4)2SO4對沉降系數(shù)的測量有一定的干擾。進(jìn)一步對圖5的結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。分析結(jié)果示于圖6中。特別地，圖6A和圖6B比較了不同孵育溫度(25°C/37°C)和不同(NH4)2S04濃度下，p239組裝過程中的組分分布。該結(jié)果顯示，隨著時間的推移或溫度的增加或(NH4)2SO4濃度的提高，p239蛋白的組裝速度加快，中間態(tài)也隨之消失，這說明P239蛋白的組裝過程是由(NH4)2SO4S導(dǎo)的疏水相互作用的吸能過程。圖6C顯示了在25°C孵育溫度和不同(NH4)#04濃度下，p239組裝過程中的各組分的變化曲線。該結(jié)果顯示，在0.3M和LOM(NH4)2SO4濃度下，組裝過程中前5小時的組分變化較為顯著和劇烈，而在0.5M(NH4)#04濃度下，組裝過程較為緩和，各種組分的變化較為一致，可能是更優(yōu)的顆粒組裝過程。圖6D顯示了在37°C和不同(NH4)2SO4濃度下孵育對小時后，P239顆粒和E2蛋白的沉降系數(shù)的分布情況。該結(jié)果顯示，(NH4)2SO4濃度對P239顆粒和E2蛋白的沉降系數(shù)的影響趨勢是一致的隨著(NH4)2SO4*度的提高，沉降系數(shù)下降；并且，由于E2蛋白在不同(NH4)#04濃度下均為二聚體形式，因此，該結(jié)果也說明在各(NH4)2SO4濃度下獲得的p239顆粒也是一致的。實(shí)施例3:p239顆粒的最終組裝狀態(tài)根據(jù)實(shí)施例2描述的p239組裝過程，將p239蛋白在4M尿素+0.5M(NH4)2SO4中在37°C下孵育12小時，然后透析至PBS溶液中，從而得到p239顆粒的最終組裝狀態(tài)。使用透射電鏡觀察、沉降速率分析、分子篩層析分析、動態(tài)光散射分析等方法對P239顆粒的顆粒性進(jìn)行研究。誘射電鏡觀察使用的儀器為日本電子公司生產(chǎn)的200kV透射電鏡，放大倍數(shù)為25，000倍。將獲得的p239顆粒用2%磷鎢酸pH7.0負(fù)染，固定于噴炭的銅網(wǎng)上，進(jìn)行觀察。電鏡結(jié)果見圖7A，其中可見樣品大部分呈現(xiàn)直徑為20nm左右、大小均勻的病毒樣顆粒。沉降速率分析使用的儀器為美國BeckmanXL-A分析型超速離心機(jī)，其配有光學(xué)檢測系統(tǒng)及An-50Ti和An-60Ti轉(zhuǎn)頭。如實(shí)施例1中所述，采用沉降速率法分析p239顆粒的沉降系數(shù)。結(jié)果如圖7B所示，p239顆粒的沉降系數(shù)為22.6s。分子篩層析分析采用德國安捷倫的1120CompactLC高效液相色譜層析系統(tǒng)以及TSKGelPW5000xl7.8x300mm柱子進(jìn)行分子篩層析分析。以2倍柱體積的緩沖液IxPBS預(yù)先平衡層析柱，直至^Onm處的吸收值無明顯變化。將檢測器的吸收值歸零，然后由自動進(jìn)樣器進(jìn)樣并進(jìn)行分析。結(jié)果如圖7C所示，p239顆粒的保留時間為13.7min。動態(tài)光散射測定使用的儀器為美國ftOteinSolutions公司生產(chǎn)的DynaProMS/X型動態(tài)光散射儀(含溫度控制器)，使用的算法為Regulation算法。所獲得的p239顆粒樣品經(jīng)0.22μm濾膜過濾后進(jìn)行測量。測量結(jié)果見圖7D。結(jié)果顯示，p239顆粒在溶液中為組分單一的、水化分子動力學(xué)半徑為13.5nm的顆粒。實(shí)施例4:p239蛋白的顆粒組裝機(jī)制的研究圓二餼光譜(CD)分析根據(jù)之前描述的HEV病毒樣顆粒的晶體結(jié)構(gòu)(YamashitaT等.ProcNatlAcadSciUSA(2009)106:12986-12991；GuuTS等·ProcNatlAcadSciUSA(2009)10612992-12997)(參見圖8)，p239蛋白在由二聚體進(jìn)一步組裝成為顆粒時，α-螺旋在二十面體對稱結(jié)構(gòu)的三倍軸方向上發(fā)生相互作用(圖8Α)，且β-折疊上Tyr殘基的苯環(huán)側(cè)鏈對α-螺旋的取向有穩(wěn)定作用(圖8Β)。比較ρ239蛋白組裝前后的圓二色光譜(參見圖3Α和3Β)發(fā)現(xiàn)在遠(yuǎn)紫外⑶光譜中，未組裝的ρ239蛋白與經(jīng)組裝的ρ239顆粒在190nm附近振幅差別較大，這可能是由于組裝發(fā)生在α-螺旋附近所致；在近紫外CD光譜中，未組裝的Ρ239蛋白與經(jīng)組裝的ρ239顆粒差別較小，并且主要的差別發(fā)生在275nm附近(見圖3B)，這可能與Tyr的疏水環(huán)境變化相關(guān)。HEV0RF2aa368~aa395區(qū)域中的疏水氨基酸的突變對d239蛋白的顆粒組裝的影p239蛋白與E2蛋白在顆粒組裝方面的顯著差異表明，HEV0RF^ia368-aa395對于HEVVLP的組裝十分重要。為此，發(fā)明人進(jìn)一步分析了HEV0RF2aa368-aa395區(qū)域的氨基酸殘基(即，P239蛋白的N端序列)的自然突變保守性(參見表幻。結(jié)果顯示，該區(qū)域中的多個疏水氨基酸殘基(lie或Leu)(在表2中用粗體表示)高度保守。表2.p239蛋白N端結(jié)構(gòu)域(HEV0RF2aa368-395)氨基酸殘基的自然突變率權(quán)利要求1.制備戊型肝炎病毒(HEV)的病毒樣顆粒(VLP)的方法，其包括步驟在變性劑存在的條件下，通過添加鹽使HEV衣殼蛋白或其變體或片段組裝成VLP，其中所述HEV衣殼蛋白或其變體或片段具有組裝成VLP的能力，所述變性劑例如可以是尿素、脲、鹽酸胍或其組合，優(yōu)選尿素；所述鹽例如可以是NaCl、NH4Cl、(NH4)2S04、Na2SO4或其組合，優(yōu)選(NH4)2S04；優(yōu)選地，所述鹽的離子強(qiáng)度為至少0.9mol/kg，例如至少0.3M的(NH4)2SO4；所述HEV衣殼蛋白或其變體或片段例如可以是以包含體形式表達(dá)于大腸桿菌中的HEV衣殼蛋白或其變體或片段；所述HEV衣殼蛋白的變體或片段例如可以是p239蛋白，優(yōu)選地，所述p239蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。2.制備戊型肝炎病毒(HEV)的病毒樣顆粒(VLP)的方法，其包括如下步驟1)提供具有組裝成VLP的能力的HEV衣殼蛋白或其變體或片段；2)將步驟1)的HEV衣殼蛋白或其變體或片段溶解于含變性劑的溶液中；3)向步驟幻獲得的溶液中添加鹽，以使所述HEV衣殼蛋白或其變體或片段組裝成VLP；其中，在步驟1)中，例如通過將其以包含體形式表達(dá)于大腸桿菌中來提供所述HEV衣殼蛋白或其變體或片段；例如，所述HEV衣殼蛋白的變體或片段可以是p239蛋白，優(yōu)選地，所述p239蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO2所示；在步驟幻中，所述變性劑例如可以是尿素、脲、鹽酸胍或其組合，優(yōu)選尿素；在步驟3)中，所述鹽例如可以是NaCl、NH4Cl、(NH4)2S04、Na2SO4或其組合，優(yōu)選(NH4)2SO4；優(yōu)選地，所述鹽的離子強(qiáng)度為至少0.9mol/kg，例如至少0.3M的(NH4)2SO4；任選地，在進(jìn)行步驟幻之前，對在含變性劑的溶液中的HEV衣殼蛋白或其變體或片段進(jìn)行純化，例如，通過陰離子交換層析和/或疏水相互作用層析進(jìn)行純化；任選地，在步驟幻之后，去除溶液中的變性劑，例如通過將含有HEVVLP的溶液透析到PBS溶液中來去除變性劑。3.控制HEV衣殼蛋白或其變體或片段組裝成VLP的組裝速度的方法，其包括步驟控制包含HEV衣殼蛋白或其變體或片段的溶液的鹽濃度和/或控制所述溶液的溫度，其中所述HEV衣殼蛋白或其變體或片段具有組裝成VLP的能力，所述HEV衣殼蛋白或其變體或片段例如可以是以包含體形式表達(dá)于大腸桿菌中的HEV衣殼蛋白或其變體或片段；所述HEV衣殼蛋白的變體或片段例如可以是p239蛋白，優(yōu)選地，所述p239蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO2所示；所述溶液包含或不包含變性劑；所述變性劑例如可以是尿素、脲、鹽酸胍或其組合，優(yōu)選尿素；所述鹽例如可以是NaCl、NH4Cl、(NH4)2S04、Na2SO4或其組合，優(yōu)選(NH4)2S04；其中，當(dāng)所述溶液的鹽濃度升高和/或所述溶液的溫度升高時，所述組裝速度加快。4.鹽用于促進(jìn)具有組裝成VLP的能力的HEV衣殼蛋白或其變體或片段組裝成VLP的用途，其中，所述HEV衣殼蛋白或其變體或片段例如可以是以包含體形式表達(dá)于大腸桿菌中的HEV衣殼蛋白或其變體或片段；所述HEV衣殼蛋白的變體或片段例如可以是p239蛋白，優(yōu)選地，所述p239蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO2所示；所述鹽例如可以是NaCl、NH4Cl、(NH4)2S04、Na2SO4或其組合，優(yōu)選(NH4)2S04；所述鹽可以在變性劑存在或不存在的條件下用于促進(jìn)VLP的組裝；所述變性劑例如尿素、脲、鹽酸胍或其組合，優(yōu)選尿素。5.破壞HEV衣殼蛋白或其變體或片段的顆粒組裝能力的方法，其包括將HEV衣殼蛋白或其變體或片段中的位于與HEV0RF2aa368-395對應(yīng)的區(qū)域中的疏水氨基酸突變?yōu)橛H水氨基酸，例如，所述HEV衣殼蛋白的變體或片段可以是p239蛋白；優(yōu)選地，所述p239蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO2所示；例如，所述位于與HEV0RF2aa368-395對應(yīng)的區(qū)域中的疏水氨基酸可以是HEV0RF2的第372、375或395位亮氨酸；例如，所述亮氨酸可以被突變?yōu)楣劝彼帷?.促進(jìn)HEV衣殼蛋白或其變體或片段組裝成VLP的方法，其包括將HEV衣殼蛋白或其變體或片段中的位于與HEV0RF2aa368-395對應(yīng)的區(qū)域中的親水氨基酸突變?yōu)槭杷被帷?.制備用于預(yù)防和/或治療戊型肝炎的疫苗的方法，其包括1)根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法來制備HEV病毒樣顆粒；2)將所獲得的HEV病毒樣顆粒與藥學(xué)可接受的載體和/或賦形劑組合，從而制備疫苗。全文摘要本發(fā)明闡明了戊型肝炎病毒(HepatitisEVirus，HEV)的病毒樣顆粒(virus-likeparticleVLP)的組裝機(jī)制，并提供了一種用于將HEV衣殼蛋白或其變體或片段組裝成VLP的方法。此外，本發(fā)明還提供了用于控制HEVVLP的組裝的方法，其通過控制鹽濃度和/或溫度來控制HEV衣殼蛋白或其變體或片段至VLP的組裝。文檔編號C12N7/04GK102321591SQ20111023480公開日2012年1月18日申請日期2011年8月17日優(yōu)先權(quán)日2011年8月17日發(fā)明者夏寧邵,張軍,李少偉,杜海蓮,楊春燕,鮮陽凌申請人:廈門萬泰滄海生物技術(shù)有限公司,廈門大學(xué)