專(zhuān)利名稱(chēng)：一種高產(chǎn)l-丙氨酸的xz-a26菌株及構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)L-丙氨酸的監(jiān)^沈菌株，屬大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，該菌株于2010年7月沈日保藏在位于“北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所”的“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，其保藏號(hào)為 CGMCC No. 4036。本發(fā)明還涉及該菌株的構(gòu)建方法及該菌株在制備L-丙氨酸中的應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
L-丙氨酸在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛的用途。在食品領(lǐng)域，L-丙氨酸的添加可明顯提高食品及飲料中的蛋白質(zhì)利用率，食用后能迅速恢復(fù)疲勞，振奮精神。L-丙氨酸可提高腌制品的腌制效果并改善風(fēng)味，提高含醇飲料的質(zhì)量等。L-丙氨酸具有獨(dú)特的改善風(fēng)味效果，它與其它氨基酸配合能加強(qiáng)食品、飲料風(fēng)味。它還可以改善有機(jī)酸的酸味，添加后能使有機(jī)酸更接近天然果酸的酸味。在醫(yī)藥領(lǐng)域，L-丙氨酸是合成維生素B6的重要原料，同時(shí)也是營(yíng)養(yǎng)劑補(bǔ)糖氨基酸營(yíng)養(yǎng)輸液的主要成分。由L-丙氨酸組成的復(fù)合氨基酸注射液_《14 氨基酸注射液-800》是主治肝腦病新藥，可治療肝功能不全時(shí)氨基酸代謝紊亂，促使肝昏迷病人蘇醒。L-丙氨酸還是一種很好的利尿藥。目前L-丙氨酸的生產(chǎn)是以天門(mén)冬氨酸為原料，通過(guò)酶催化技術(shù)(天冬氨酸脫羧酶)來(lái)生產(chǎn)。由于天冬氨酸的生產(chǎn)是以順酐為原料的，因此L-丙氨酸的生產(chǎn)成本及售價(jià)嚴(yán)重依賴(lài)于石油價(jià)格。目前國(guó)內(nèi)L-丙氨酸生產(chǎn)廠家均是使用酶催化技術(shù)。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-丙氨酸和酶催化技術(shù)相比有諸多優(yōu)點(diǎn)首先，用葡萄糖代替天冬氨酸作為生產(chǎn)原料。酶催化技術(shù)以天冬氨酸為原材料。目前天冬氨酸的生產(chǎn)是以順酐為原料，順酐的資源緊張和價(jià)格高漲導(dǎo)致天冬氨酸的供給也存在著巨大的隱患。微生物發(fā)酵法技術(shù)是以葡萄糖為原料。葡萄糖屬于可再生生物質(zhì)資源，目前主要是通過(guò)玉米淀粉制得，將來(lái)可以從木質(zhì)纖維素中提煉，成本可以長(zhǎng)期保持在穩(wěn)定的水平。利用葡萄糖為原材料，既有很大的價(jià)格優(yōu)勢(shì)，又能長(zhǎng)期維持價(jià)格的穩(wěn)定。其次，用微生物發(fā)酵法技術(shù)代替酶催化技術(shù)。酶催化技術(shù)需要對(duì)菌株進(jìn)行高密度培養(yǎng)，分泌出生產(chǎn)L-丙氨酸所需的天冬氨酸脫羧酶。該過(guò)程對(duì)氧氣的需求量很大；另外，由于天冬氨酸脫羧酶基因是克隆在質(zhì)粒上進(jìn)行高表達(dá)的，因此在菌株培養(yǎng)過(guò)程中，需要添加抗生素來(lái)維持質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳復(fù)制。這些因素導(dǎo)致酶催化生產(chǎn)工藝復(fù)雜。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，只需在起始階段往發(fā)酵罐中投加葡萄糖和無(wú)機(jī)鹽，并接入少量的菌種。另外， 微生物發(fā)酵法和酶催化技術(shù)相比，其最終發(fā)酵液中雜質(zhì)少很多，這既可以節(jié)約L-丙氨酸的分離提取成本，也可以節(jié)約廢水處理的成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種通過(guò)生物發(fā)酵法生產(chǎn)高濃度L-丙氨酸的大腸桿菌 (Escherichia coli)基因工程菌)(Z-A沈，該菌株保藏號(hào)為CGMCC No. 4036，其具有將糖類(lèi)原料發(fā)酵產(chǎn)生高濃度L-丙氨酸的能力，其是通過(guò)將嗜熱脂肪地芽孢桿菌染色體上的L-丙氨酸脫氫酶基因整合在大腸桿菌ATCC 8739染色體的乳酸脫氫酶處，再依次敲除所得大腸桿菌染色體的丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脫氫酶基因、乙酸激酶基因、富馬酸還原酶基因和丙氨酸消旋酶基因，然后在發(fā)酵罐中連續(xù)傳代培養(yǎng)而得的基因工程菌(如附

圖1)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述菌株的構(gòu)建方法，其包括下述步驟(I)L-丙氨酸脫氫酶基因的整合將大腸桿菌ATCC 8739的乳酸脫氫酶基因IdhA 擴(kuò)增并克隆到PEASY-Tl克隆載體上，得質(zhì)粒pXZ-AOl ；將含有卡那霉素基因Km和果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因sacB的DNA片段連接至質(zhì)粒p)(Z-A01的DNA擴(kuò)增片段上，得到質(zhì)粒p)(Z-A02 ； 將質(zhì)粒PXZ-A02的DNA擴(kuò)增片段電轉(zhuǎn)至帶有pKD46質(zhì)粒的大腸桿菌ATCC 8739，篩選卡那霉素抗性的菌落，得菌株)(Z-A01 ；將擴(kuò)增的L-丙氨酸脫氫酶基因連接至質(zhì)粒pXZ-AOl的DNA 片段，得到質(zhì)粒p)(Z-A03 ；然后將質(zhì)粒p)(Z-A03的DNA擴(kuò)增片段電轉(zhuǎn)至帶有pKD46質(zhì)粒的 )(Z-A01，培養(yǎng)篩選在蔗糖中不能生長(zhǎng)的菌落，得菌株)(Z-A02 ；(2)依次敲除上述所得大腸桿菌染色體的丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脫氫酶基因、乙酸激酶基因、富馬酸還原酶基因和丙氨酸消旋酶基因；丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除將菌株)(Z-A02的丙酮酸甲酸裂解酶基因擴(kuò)增并克隆到pEASY-Tl克隆載體上，得質(zhì)粒p)(Z-A04 ；將含有卡那霉素基因Km和果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因sacB的DNA片段連接至質(zhì)粒p)(Z-A04的DNA擴(kuò)增片段上，得到質(zhì)粒p)(Z-A05 ；將質(zhì)粒 PXZ-A05的DNA擴(kuò)增片段電轉(zhuǎn)至帶有PKD46質(zhì)粒的菌株)(Z-A02，篩選卡那霉素抗性的菌落， 得菌株)(Z-A03 ；將質(zhì)粒PXZ-A04的DNA擴(kuò)增片段進(jìn)行磷酸化處理后自連得到質(zhì)粒pXZ-A06 ； 然后將質(zhì)粒p)(Z-A06的DNA擴(kuò)增片段電轉(zhuǎn)至帶有PKD46質(zhì)粒的)(Z-A03，培養(yǎng)篩選在蔗糖中不能生長(zhǎng)的菌落，得菌株)(Z-A04 ；乙醇脫氫酶基因、乙酸激酶基因、富馬酸還原酶基因和丙氨酸消旋酶基因的敲除按照丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除方法，分別以所得菌株)(Z-A04、XZ-A06, XZ-A08和 )(Z-A10為起始原料，進(jìn)行乙醇脫氫酶基因、乙酸激酶基因、富馬酸還原酶基因和丙氨酸消旋酶基因的敲除，分別得到菌株!Ζ-·、XZ-A08, XZ-AlO和YL-KYl ；(3)在發(fā)酵罐中連續(xù)傳代培養(yǎng)步驟( 所得菌TL-KYl得到菌株H對(duì)大腸桿菌ATCC 8739的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行系統(tǒng)分析，設(shè)計(jì)出高效合成L-丙氨酸的策略。為了使細(xì)胞能夠積累L-丙氨酸，需要進(jìn)行三個(gè)方面的改造(如附圖1)首先，需要引入L-丙氨酸脫氫酶基因。L-丙氨酸脫氫酶能夠?qū)⒈徂D(zhuǎn)化為L(zhǎng)-丙氨酸，同時(shí)消耗一個(gè)NADH。其次，需要敲除丙酮酸競(jìng)爭(zhēng)途徑基因。由于丙酮酸在大腸桿菌中是一個(gè)關(guān)鍵的中間代謝節(jié)點(diǎn)，因此需要將丙酮酸天然代謝途徑失活，從而使代謝流全部轉(zhuǎn)入L-丙氨酸的合成。這些競(jìng)爭(zhēng)途徑包括乳酸脫氫酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脫氫酶基因、乙酸激酶基因、富馬酸還原酶基因。第三，需要敲除L-丙氨酸降解途徑基因。L-丙氨酸在大腸桿菌中能夠被丙氨酸消旋酶轉(zhuǎn)化為D-丙氨酸，這會(huì)大大降低L-丙氨酸的手性純度。因此需要敲除丙氨酸消旋酶，避免D-丙氨酸的積累。L-丙氨酸工程菌株的構(gòu)建根據(jù)上述的設(shè)計(jì)方案，在大腸桿菌ATCC 8739的染色體上進(jìn)行基因的敲除和整
I=I O首先，將嗜熱脂肪地芽孢桿菌的L-丙氨酸脫氫酶基因整合在大腸桿菌ATCC 8739染色體的乳酸脫氫酶處，得到大腸桿菌)(Z-A02。本發(fā)明所用到的序列如核苷酸序列表。通過(guò)PCR擴(kuò)增的方法，從嗜熱脂肪地芽孢桿菌的基因組DNA中擴(kuò)增出L-丙氨酸脫氫酶基因。所用引物為alaD-F/alaD-R(序列1和2)。為了使L-丙氨酸脫氫酶基因能夠在工程菌中高效、穩(wěn)定地表達(dá)，將其整合至大腸桿菌ATCC 8739染色體的乳酸脫氫酶處。基因整合采用兩步同源重組的方法(如附圖2)。第一步，使用引物ldhA-up/ldhA-down(序列3和4)擴(kuò)增大腸桿菌的乳酸脫氫酶基因(IdhA)，擴(kuò)增產(chǎn)物包含乳酸脫氫酶編碼基因及其上下游各500個(gè)堿基，并將其克隆到pEASY-Tl克隆載體(北京全式金生物技術(shù)有限公司) 上，得到質(zhì)粒p)(Z-A01。第二步，以p)(Z-A01質(zhì)粒DNA為模板，使用引物ldhA-l/ldhA-2 (序列5和6)擴(kuò)增出一段DNA片段，擴(kuò)增產(chǎn)物包含pEASY-Tl載體和乳酸脫氫酶編碼基因上下游的500個(gè)左右堿基。第三步，將含有卡那霉素基因(Km)和果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因(sacB) 的DNA片段連接至第二步的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到質(zhì)粒p)(Z-A02。第四步，以p)(Z-A02質(zhì)粒DNA 為模板，使用引物ldhA-up/ldhA-down(序列3和4)擴(kuò)增出DNA片段I，用于第一次同源重組。首先將PKD46質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌ATCC 8739，然后將DNA片段I電轉(zhuǎn)至帶有pKD46的大腸桿菌ATCC 8739，篩選卡那霉素抗性的菌落。經(jīng)過(guò)PCR驗(yàn)證，挑選一個(gè)正確的單菌落， 將其命名為XZ-A0L·第五步，將L-丙氨酸脫氫酶基因連接至第二步的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到質(zhì)粒p)(Z-A03。第六步，以p)(Z-A03質(zhì)粒DNA為模板，使用引物ldhA-up/ldhA-down (序列3 和4)擴(kuò)增出DNA片段II，用于第二次同源重組。首先將pKD46質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至)(Z-A01，然后將 DNA片段II電轉(zhuǎn)至帶有pKD46的)(Z-A01，將其轉(zhuǎn)移至含有10%蔗糖的LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng) M小時(shí)后在含有6%蔗糖的LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)PCR驗(yàn)證，挑選一個(gè)正確的單菌落，將其命名為)(Z-A02。本發(fā)明的L-丙氨酸工程菌株的構(gòu)建中所使用的質(zhì)粒及構(gòu)建如下表1。表1 本發(fā)明的L-丙氨酸工程菌株的構(gòu)建中所使用的質(zhì)粒
權(quán)利要求
1.一種高產(chǎn)L-丙氨酸的監(jiān)^沈菌株，保藏號(hào)為CGMCC No. 4036，其具有發(fā)酵產(chǎn)生高濃度L-丙氨酸的能力，其是通過(guò)將嗜熱脂肪地芽孢桿菌染色體上的L-丙氨酸脫氫酶基因整合在大腸桿菌ATCC 8739染色體的乳酸脫氫酶處，再依次敲除所得大腸桿菌染色體的丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脫氫酶基因、乙酸激酶基因、富馬酸還原酶基因和丙氨酸消旋酶基因，然后在發(fā)酵罐中連續(xù)傳代培養(yǎng)而得的基因工程菌。
2.權(quán)利要求1的保藏號(hào)為CGMCCNo. 4036的XLH菌株的構(gòu)建方法，包括下述步驟(1)L-丙氨酸脫氫酶基因的整合將大腸桿菌ATCC8739的乳酸脫氫酶基因擴(kuò)增并克隆到pEASY-Tl克隆載體上，得質(zhì)粒p)(Z-A01 ；將含有卡那霉素基因Km和果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因sacB的DNA片段連接至質(zhì)粒p)(Z-A01的DNA擴(kuò)增片段上，得到質(zhì)粒p)(Z-A02 ；將質(zhì)粒 PXZ-A02的DNA擴(kuò)增片段電轉(zhuǎn)至帶有pKD46質(zhì)粒的大腸桿菌ATCC 8739，篩選卡那霉素抗性的菌落，得菌株)(Z-A01 ；將擴(kuò)增的L-丙氨酸脫氫酶基因連接至質(zhì)粒pXZ-AOl的DNA片段，得到質(zhì)粒p)(Z-A03 ；然后將質(zhì)粒p)(Z-A03的DNA擴(kuò)增片段電轉(zhuǎn)至帶有pKD46質(zhì)粒的)(Z-A01，培養(yǎng)篩選在蔗糖中不能生長(zhǎng)的菌落，得菌株)(Z-A02 ；其中，乳酸脫氫酶基因IdhA的擴(kuò)增引物、 質(zhì)粒p)(Z-A02的DNA擴(kuò)增引物以及質(zhì)粒p)(Z-A03的DNA擴(kuò)增引物為核苷酸序列表中序列3 和序列4，質(zhì)粒p)(Z-A01的DNA擴(kuò)增引物為核苷酸序列表中序列5和序列6，L-丙氨酸脫氫酶基因擴(kuò)增引物為核苷酸序列表中序列1和序列2 ；(2)依次敲除上述所得大腸桿菌染色體的丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脫氫酶基因、乙酸激酶基因、富馬酸還原酶基因和丙氨酸消旋酶基因；丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除將菌株)(Z-A02的丙酮酸甲酸裂解酶基因擴(kuò)增并克隆到pEASY-Tl克隆載體上，得質(zhì)粒p)(Z-A04 ；將含有卡那霉素基因Km和果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因sacB的DNA片段連接至質(zhì)粒p)(Z-A04的DNA擴(kuò)增片段上，得到質(zhì)粒p)(Z-A05 ；將質(zhì)粒 PXZ-A05的DNA擴(kuò)增片段電轉(zhuǎn)至帶有PKD46質(zhì)粒的菌株)(Z-A02，篩選卡那霉素抗性的菌落， 得菌株)(Z-A03 ；將質(zhì)粒PXZ-A04的DNA擴(kuò)增片段進(jìn)行磷酸化處理后自連得到質(zhì)粒pXZ-A06 ； 然后將質(zhì)粒p)(Z-A06的DNA擴(kuò)增片段電轉(zhuǎn)至帶有PKD46質(zhì)粒的)(Z-A03，培養(yǎng)篩選在蔗糖中不能生長(zhǎng)的菌落，得菌株)(Ζ-Α04;其中，丙酮酸甲酸裂解酶基因的擴(kuò)增引物、質(zhì)粒pXZ-A05 的DNA擴(kuò)增引物以及質(zhì)粒ρ)(Ζ-Α06的DNA擴(kuò)增引物為核苷酸序列表中序列7和序列8，質(zhì)粒 ΡΧΖ-Α04的DNA擴(kuò)增引物為核苷酸序列表中序列9和序列10 ；乙醇脫氫酶基因、乙酸激酶基因、富馬酸還原酶基因和丙氨酸消旋酶基因的敲除按照丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除方法，以所得菌株)(Ζ-Α04為起始原料進(jìn)行乙醇脫氫酶基因的敲除，得到菌株)(Ζ-Α06 ；然后以)(Ζ-Α06為原料進(jìn)行乙酸激酶基因的敲除，得到菌株 ΧΖ-Α08 ；再以為原料進(jìn)行富馬酸還原酶基因的敲除，得到菌株)(Ζ-Α10 ；再以)(Ζ-Α10 為原料進(jìn)行丙氨酸消旋酶基因的敲除，得到菌株TL-KYl ；其中，所用乙醇脫氫酶基因的擴(kuò)增引物、質(zhì)粒ΡΧΖ-Α08的DNA擴(kuò)增引物以及質(zhì)粒 ΡΧΖ-Α09的DNA擴(kuò)增引物為核苷酸序列表中序列11和序列12，質(zhì)粒ρ)(Ζ-Α07的DNA擴(kuò)增引物為核苷酸序列表中序列13和序列14 ；乙酸激酶基因的擴(kuò)增引物、質(zhì)粒ρ)(Ζ-Α11的DNA擴(kuò)增引物以及質(zhì)粒ρ)(Ζ-Α12的DNA擴(kuò)增引物為核苷酸序列表中序列15和序列16，質(zhì)粒ρΧΖ-ΑΙΟ的DNA擴(kuò)增引物為核苷酸序列表中序列17和序列18 ；富馬酸還原酶基因的擴(kuò)增引物、質(zhì)粒PXZ-A14的DNA擴(kuò)增引物以及質(zhì)粒pXZ-A15的DNA擴(kuò)增引物為核苷酸序列表中序列19和序列20，質(zhì)粒pXZ-A13的DNA擴(kuò)增引物為核苷酸序列表中序列21和序列22 ；丙氨酸消旋酶基因的擴(kuò)增引物、質(zhì)粒p)(Z-A17的DNA擴(kuò)增引物以及質(zhì)粒p)(Z-A18的DNA 擴(kuò)增引物為核苷酸序列表中序列23和序列M，質(zhì)粒PXZ-A16的DNA擴(kuò)增引物為核苷酸序列表中序列25和序列26 ；(3)在發(fā)酵罐中連續(xù)傳代培養(yǎng)步驟( 所得菌)(Z-A12得到菌株)(Z-A^。
3.權(quán)利要求1所述的保藏號(hào)為CGMCCNo. 4036的菌株在生產(chǎn)L-丙氨酸中的應(yīng)用，其特征在于采用厭氧培養(yǎng)條件，培養(yǎng)溫度為30-42°C，控制pH在6. 5-7. 5，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)保藏號(hào)為CGMCC No. 4036的TL- 菌株，分離提取L-丙氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述培養(yǎng)基中糖類(lèi)原料包括葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、木薯、玉米、甜菜、木質(zhì)纖維素及其水解物和糖漿中的一種或多種；氮源為無(wú)機(jī)含氮化合物，包括氯化銨、乙酸銨、硫酸銨和磷酸銨中的一種或多種；微量無(wú)機(jī)鹽包括可溶性的鐵鹽、鈷鹽、銅鹽、鋅鹽、錳鹽和鉬酸鹽中的一種或多種。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種高產(chǎn)L-丙氨酸的XZ-A26菌株，保藏號(hào)為CGMCC No.4036，其具有發(fā)酵產(chǎn)生高濃度L-丙氨酸的能力，其是通過(guò)將嗜熱脂肪地芽孢桿菌染色體上的L-丙氨酸脫氫酶基因整合在大腸桿菌ATCC8739染色體的乳酸脫氫酶處，再依次敲除大腸桿菌染色體的丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脫氫酶基因、乙酸激酶基因、富馬酸還原酶基因和丙氨酸消旋酶基因，然后在發(fā)酵罐中連續(xù)傳代培養(yǎng)而得的基因工程菌。本發(fā)明還涉及該菌株的構(gòu)建方法及該菌株在制備L-丙氨酸中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)代謝工程的方法，構(gòu)建出能發(fā)酵生產(chǎn)高濃度L-丙氨酸的大腸桿菌CGMCC No.4036，利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸的產(chǎn)量高達(dá)115g/L，適合工業(yè)化生產(chǎn)L-丙氨酸。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102329765SQ201110235159
公開(kāi)日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2011年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月31日
發(fā)明者張冬竹, 張學(xué)禮 申請(qǐng)人:安徽華恒生物工程有限公司