專利名稱：一種在線原位監(jiān)測固態(tài)發(fā)酵真菌生物量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明專利屬于固態(tài)發(fā)酵生物量的在線原位監(jiān)測領(lǐng)域，具體指一種應(yīng)用原位數(shù)字圖像分析技術(shù)、結(jié)合現(xiàn)代化學(xué)計量學(xué)方法的非破壞性測定固態(tài)發(fā)酵真菌生物量的方法。
背景技術(shù)：
測定發(fā)酵過程生產(chǎn)菌株的生物量變化是建立固態(tài)發(fā)酵微生物生長動力學(xué)的基礎(chǔ)， 對于研究發(fā)酵過程微生物生長控制及發(fā)酵工藝優(yōu)化調(diào)控有重要的意義，因此一直成為發(fā)酵動力學(xué)研究的重要內(nèi)容。固態(tài)發(fā)酵的生產(chǎn)菌株多為絲狀真菌，發(fā)酵過程中菌絲體與基質(zhì)纏繞、黏連，兩者難以分離，因此固態(tài)發(fā)酵生物量不適合用直接計數(shù)法來測定。之后的研究發(fā)展出基于代謝活動或者生物體中某些特殊物質(zhì)的含量推知生物量等化學(xué)方法，前者根據(jù)微生物代謝過程產(chǎn)生的二氧化碳量或者胞外酶的濃度來估測生物量，后者通過測定氨基葡糖、麥角固醇等細(xì)胞壁化學(xué)成分來測定，但是上述化學(xué)方法都不能避免雜質(zhì)干擾、結(jié)果可比性差、無法實時在線測定等問題。尤其對于大型封閉式發(fā)酵，測定發(fā)酵不同階段微生物的生長情況更為困難一方面取樣困難、容易感染雜菌；另一方面由于發(fā)酵基質(zhì)異質(zhì)性嚴(yán)重，所取樣品代表性差，不能反映發(fā)酵整體水平。因此生物量的在線監(jiān)測一直都是固態(tài)發(fā)酵的難題，這也成為固態(tài)發(fā)酵實現(xiàn)智能控制的阻礙因素。目前的在線監(jiān)測技術(shù)中以近紅外光譜分析為主，但是這種方法仍然存在造價高、監(jiān)測范圍小、計算模型參數(shù)需要大量數(shù)據(jù)來訓(xùn)練等問題，因而在固態(tài)發(fā)酵行業(yè)沒有實現(xiàn)有效推廣。因此，發(fā)展一種簡便易行、能夠在線原位監(jiān)測固態(tài)發(fā)酵生物量的方法勢在必行。于20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的分形學(xué)說起初用于定量描述具有某種自相似特征的不規(guī)則物體，分形維數(shù)用于表征物體不規(guī)則的程度。后來這一學(xué)說被廣泛應(yīng)用于各種專業(yè)， 在真菌表征方面也證明了它的有效性。真菌菌絲都有不規(guī)則和自相似的特征，由于資源的數(shù)量和質(zhì)量在種間換算不同，在不遭受破壞的前提下，通過圖象分析其菌絲體營養(yǎng)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)資源的數(shù)量和質(zhì)量影響菌絲體延展率、外部資源的生物量生產(chǎn)和分布；利用分形模型對霉菌菌落的顯微圖像進(jìn)行紋理分析，發(fā)現(xiàn)表面的覆蓋維數(shù)是描述菌落的有效特征(羅紅燕等，2009，微生物學(xué)雜質(zhì)，第四卷第4期，75-77頁)。上述研究表明，使用基于計算機數(shù)字圖像處理所得到的菌體分形維數(shù)與菌絲體生長之間有密切的相關(guān)性，能夠用于表征菌體生長特征。另外，將分形維數(shù)同物體可定量性質(zhì)相關(guān)聯(lián)的研究也廣泛存在。一些學(xué)者研究了分形維數(shù)同多孔介質(zhì)有效導(dǎo)熱系數(shù)之間的關(guān)系，通過回歸分析得到的等效導(dǎo)熱系數(shù)與固體顆粒分形維數(shù)的指數(shù)關(guān)系模型(李守巨等，2009，巖土力學(xué)，第30卷第5期，1465-1470頁)； 還有一些研究表明，粉體堆積密度、多孔體的滲透率同其分形維數(shù)之間有明確的函數(shù)關(guān)系 (秦宣云等，2008，湖北民族學(xué)院學(xué)報，第沈卷第2期，131-134頁；羅慧等，2007，三明學(xué)院學(xué)報，第M卷第4期，396-398頁)。上述函數(shù)模型都經(jīng)實驗證明具有較好的指導(dǎo)性。因此， 確定具有分形特征的物質(zhì)性質(zhì)與其分形維數(shù)之間的函數(shù)關(guān)系非?？尚校瑢τ诜瞧茐男缘毓罍y物質(zhì)性質(zhì)有良好的指導(dǎo)意義。
如前所述，真菌菌絲體生長具有顯著的分形特征，可通過計算機數(shù)字圖像處理的方法計算其分形維數(shù)；具有某種分形特征的物質(zhì)性質(zhì)同分形維數(shù)之間的關(guān)聯(lián)可以用函數(shù)來表示。因此，將固態(tài)發(fā)酵菌體生長的分形維數(shù)同生物量相關(guān)聯(lián)具有較高的可行性，能夠?qū)崿F(xiàn)基于數(shù)字圖像處理的固態(tài)發(fā)酵真菌生物量無破壞性在線原位監(jiān)測，但是這種方法尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對目前固態(tài)發(fā)酵過程生物量無法在線準(zhǔn)確測定的問題，本發(fā)明專利提供一種固態(tài)發(fā)酵真菌生物量的在線原位監(jiān)測方法，具體指一種應(yīng)用原位數(shù)字圖像分析技術(shù)、結(jié)合現(xiàn)代化學(xué)計量學(xué)方法的非破壞性測定固態(tài)發(fā)酵真菌生物量的方法。本發(fā)明提供一種固態(tài)發(fā)酵真菌生物量的在線原位監(jiān)測方法，包括以下步驟步驟一建模樣品準(zhǔn)備在反應(yīng)器外使用生產(chǎn)菌株進(jìn)行發(fā)酵試驗，控制溫度、濕度等發(fā)酵條件恒定，平行實驗至少做50組；步驟二 建模數(shù)據(jù)采集使用高分辨率攝像頭測定不同發(fā)酵階段菌體生長圖像，并通過數(shù)字圖像分析方法計算圖像中菌體-基質(zhì)混合物的分形維數(shù)，同時使用化學(xué)法測定相應(yīng)的菌體生物量；步驟三模型建立與優(yōu)化使用數(shù)學(xué)軟件擬合分形維數(shù)和菌體生物量之間的函數(shù)關(guān)系，以所測樣品集的交叉驗證均方差(RMSEVC)為指標(biāo)優(yōu)化模型參數(shù)，選取RMSECV盡可能小的組合。RMSECV計算公式如下式中而是標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法測得的值，e是基于分形維數(shù)的預(yù)測值，η是樣品集內(nèi)樣品數(shù)目；步驟四將模型用于在線測定反應(yīng)器內(nèi)的菌體生物量控制反應(yīng)器內(nèi)發(fā)酵基質(zhì)、孢子接種量、發(fā)酵條件等因素與步驟一中反應(yīng)器外發(fā)酵實驗相同，利用反應(yīng)器內(nèi)置高分辨率攝像頭拍攝不同時間的菌體-基質(zhì)圖像，通過數(shù)字圖像處理計算圖像中菌體-基質(zhì)混合物的分形維數(shù)，將分形維數(shù)帶入所得數(shù)學(xué)模型，計算求解相應(yīng)生物量。所述的數(shù)字圖像分析方法包括如下步驟將所得圖像分辨率調(diào)整在640X480至 1280Χ IOM之間，對讀取的圖像進(jìn)行直方圖均衡化處理、低通濾波處理、閾值分割、圖像二值化處理，最終提取圖像輪廓。所述閾值分割方法包括雙峰直方圖閾值分割法，平均灰度法，最小誤差閾值分割法，最大類間方差法，模糊C均值聚類方法，最大熵方法，矩量保持法。所述的分形維數(shù)包括自相似維數(shù)，Hausdorff維數(shù)以及計盒子維數(shù)。所述高分辨率攝像頭的拍攝速度為200幀/秒 400幀/秒之間。使用高分辨率攝像頭分別對發(fā)酵物的正上面、正側(cè)面取像，在反應(yīng)器內(nèi)取像方法和反應(yīng)器外取像方法一
該發(fā)明專利與背景技術(shù)相比，其優(yōu)勢在于與傳統(tǒng)化學(xué)法相比，該測定方法無污染、可重復(fù)性性強，結(jié)果偏差?。慌c近紅外光譜測定相比，該方法成本低，測定范圍廣，相關(guān)器件易于安裝實現(xiàn)；測定結(jié)果可重復(fù)性強，誤差控制在5 %以內(nèi)，與傳統(tǒng)測定方法結(jié)果非常相近；此外，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)在線原位測定，無須取樣，對發(fā)酵過程影響最小。
具體實施例方式實施例1在線原位監(jiān)測綠色木霉固態(tài)發(fā)酵過程中生物量的變化綠色木霉是固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的主要生產(chǎn)菌種，發(fā)酵底物為木質(zhì)纖維素材料。 本實施例用以在線原位監(jiān)測綠色木霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的步驟如下1、建模樣品準(zhǔn)備。以汽爆稻草和麥麩(比例為4 1)作為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基含水量在75%左右，滅菌后接種10%綠色木霉孢子液(濃度為5 X 108個/mL)，在溫度30°C、濕度98%條件下培養(yǎng)7天，平行實驗做50組。每隔1 取三組發(fā)酵物用高分辨率數(shù)字?jǐn)z像頭拍照，同時用氨基葡萄糖法測定發(fā)酵物中的生物量。2、數(shù)字圖像處理求解菌體-基質(zhì)分形維數(shù)。包括圖像處理、輪廓提取、求解分形維
數(shù)三步。(1)圖像處理。將所得圖像分辨率調(diào)整在640X480至1280X10M之間，對讀取的圖像進(jìn)行直方圖均衡化處理得到更為清晰、明快的圖像，然后通過理想低通濾波器處理去除圖像中噪聲，通過OSTU (最大類間平方差)自適應(yīng)閾值分割法為圖像選擇合適的頻域和空間閾值，進(jìn)而根據(jù)所得閾值對圖像進(jìn)行二值化處理。(2)圖像輪廓提取，使用邊緣檢測算法提取二值化圖像的輪廓。(3)計盒子法求解圖像的分形維數(shù)。計盒子法是數(shù)字圖像處理計算分形維數(shù)使用最多的方法，其步驟為使用不同尺度r去測量時可以得到如下關(guān)系L = rDsN(r)上式中，L為空襲輪廓線長度；N(r)是尺度為r時識別為空襲的正方形網(wǎng)格數(shù)(以特征尺度r的箱盒覆蓋試驗區(qū)域，如果箱盒中有顯色的像素點，該箱盒計入計算)。則顯色的箱盒數(shù)N (r)與特征尺度r有如下關(guān)系InN(r) = -Dslnr+c(c 為常量)采用線性回歸方法，擬合lnN(r)與Inr的方程，即可求得分形維數(shù)Ds。以上求解分形維數(shù)的方法使用matlab圖像處理工具包來完成。3、數(shù)學(xué)模型的建立與優(yōu)化。使用origin以及matlab等數(shù)學(xué)建模軟件對菌體_基質(zhì)分形維數(shù)同生物量之間的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行建模，通過比較各種可能組合下預(yù)測模型的決定系數(shù)(R2)，選取R2盡可能大的組合。采用內(nèi)部交叉證實對預(yù)測數(shù)學(xué)模型進(jìn)行驗證。內(nèi)部交叉證實是指依次剔除建模樣品集中一個(或多個)樣品，用剩余樣品來建模預(yù)測被剔除樣品的含量，比較被剔除樣品預(yù)測值與化學(xué)值的差異，由此判斷所建模型的預(yù)測準(zhǔn)確性，用交叉驗證均方差(RMSEVC)考察，RMSEVC越小，模型預(yù)測準(zhǔn)確性越高。本實施例所建立的綠色木霉生物量與其分形維數(shù)之間的函數(shù)關(guān)系如下X = 25. 735e01805D
X表示每單位干基質(zhì)中含有的生物量(mg/g)，D為菌體-基質(zhì)分形維數(shù)。上述所得模型的決定系數(shù)R2 = 0. 955，交叉驗證均方差為5. 61mg/g。4、原位測定反應(yīng)器中固態(tài)發(fā)酵生物量。在發(fā)酵不同時期，使用反應(yīng)器內(nèi)置攝像頭對發(fā)酵中的基質(zhì)進(jìn)行拍照，按照步驟2計算圖像中菌體-基質(zhì)分形維數(shù)，結(jié)合步驟3所得模型計算相應(yīng)的菌體量，采用化學(xué)法測定的結(jié)果作為對比。預(yù)測值和化學(xué)法所得結(jié)果使用T檢驗在0. 05的水平下無顯著性差別。實施例2在線原位檢測黑曲霉固態(tài)發(fā)酵過程中生物量的變化黑曲霉是固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)α-酸性淀粉酶的主要生產(chǎn)菌株，發(fā)酵基質(zhì)為85%麩皮，10%玉米淀粉，5%豆餅粉，料水比1 1。本實施例用以在線原位監(jiān)測黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)α-酸性淀粉酶的步驟如下1、建模樣品準(zhǔn)備。以85%麩皮，10%玉米淀粉，5%豆餅粉作為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基含水量在60 %左右，滅菌后接種10 %黑曲霉孢子液(濃度為5 X 108個/mL)，在溫度30°C、濕度98%條件下培養(yǎng)5天，平行實驗做50組。每隔1 取三瓶發(fā)酵物用高分辨率數(shù)字?jǐn)z像頭拍照，同時用氨基葡萄糖法測定發(fā)酵物中的生物量。2、數(shù)字圖像處理求解菌體-基質(zhì)分形維數(shù)。包括圖像處理、輪廓提取、求解分形維
數(shù)三步。(1)圖像處理。將所得圖像分辨率調(diào)整在640X480至1280X10M之間，對讀取的圖像進(jìn)行直方圖均衡化處理得到更為清晰、明快的圖像，然后通過理想低通濾波器處理去除圖像中噪聲，通過OSTU (最大類間平方差)自適應(yīng)閾值分割法為圖像選擇合適的頻域和空間閾值，進(jìn)而根據(jù)所得閾值對圖像進(jìn)行二值化處理。(2)圖像輪廓提取，使用邊緣檢測算法提取二值圖像的輪廓。(3)計盒子法求解圖像的分形維數(shù)。以上求解分形維數(shù)的方法使用matlab圖像處理工具包來完成。3、數(shù)學(xué)模型的建立與優(yōu)化。使用origin以及matlab等數(shù)學(xué)建模軟件對菌體_基質(zhì)分形維數(shù)同生物量之間的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行建模，通過比較各種可能組合下預(yù)測模型的決定系數(shù)(R2)，選取R2盡可能大的組合。采用內(nèi)部交叉證實對預(yù)測數(shù)學(xué)模型進(jìn)行驗證。內(nèi)部交叉證實是指依次剔除建模樣品集中一個(或多個)樣品，用剩余樣品來建模預(yù)測被剔除樣品的含量，比較被剔除樣品預(yù)測值與化學(xué)值的差異，由此判斷所建模型的預(yù)測準(zhǔn)確性，用交叉驗證均方差(RMSEVC)考察，RMSEVC越小，模型預(yù)測準(zhǔn)確性越高。本實施例所建立黑曲霉生物量與其分形維數(shù)之間的函數(shù)關(guān)系如下X = 32. 875e17953+0133DX表示每單位干基質(zhì)中含有的生物量(mg/g)，D為菌體-基質(zhì)分形維數(shù)。上述所得模型的決定系數(shù)R2 = 0. 902，交叉驗證均方差為8. 23mg/g。4、原位測定反應(yīng)器中固態(tài)發(fā)酵生物量。在發(fā)酵不同時期，使用反應(yīng)器內(nèi)置攝像頭對發(fā)酵中的基質(zhì)進(jìn)行拍照，按照步驟2計算圖像中菌體-基質(zhì)分形維數(shù)，結(jié)合步驟3所得模型計算相應(yīng)的菌體量，采用化學(xué)法測定的結(jié)果作為對比。預(yù)測值和化學(xué)法所得結(jié)果次用T檢驗在0. 05的水平下無顯著性差別。
權(quán)利要求
1. 一種固態(tài)發(fā)酵真菌生物量的在線原位監(jiān)測方法，其特征在于包括以下步驟 步驟一建模樣品準(zhǔn)備在反應(yīng)器外使用生產(chǎn)菌株進(jìn)行發(fā)酵試驗，控制溫度、濕度等發(fā)酵條件恒定，平行實驗至少做50組；步驟二 建模數(shù)據(jù)采集使用高分辨率攝像頭測定不同發(fā)酵階段菌體生長圖像，并通過數(shù)字圖像分析方法計算圖像中菌體-基質(zhì)混合物的分形維數(shù)，同時使用化學(xué)法測定相應(yīng)的菌體生物量； 步驟三模型建立與優(yōu)化使用數(shù)學(xué)軟件擬合分形維數(shù)和菌體生物量之間的函數(shù)關(guān)系，以所測樣品集的交叉驗證均方差(RMSEVC)為指標(biāo)優(yōu)化模型參數(shù)，選取RMSECV盡可能小的組合。RMSECV計算公式如式中Ci是標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法測得的值，e是基于分形維數(shù)的預(yù)測值，η是樣品集內(nèi)樣品數(shù)目；步驟四將模型用于在線測定反應(yīng)器內(nèi)的菌體生物量控制反應(yīng)器內(nèi)發(fā)酵基質(zhì)、孢子接種量、發(fā)酵條件等因素與步驟一中反應(yīng)器外發(fā)酵實驗相同，利用反應(yīng)器內(nèi)置高分辨率攝像頭拍攝不同時間的菌體-基質(zhì)圖像，通過數(shù)字圖像處理計算圖像中菌體-基質(zhì)混合物的分形維數(shù)，將分形維數(shù)帶入所得數(shù)學(xué)模型，計算求解相應(yīng)生物量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固態(tài)發(fā)酵真菌生物量在線原位監(jiān)測方法，其特征在于，所述的數(shù)字圖像分析方法包括如下步驟將所得圖像分辨率調(diào)整在640X480至1280Χ IOM之間，對讀取的圖像進(jìn)行直方圖均衡化處理、低通濾波處理、閾值分割、圖像二值化處理，最終提取圖像輪廓。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固態(tài)發(fā)酵真菌生物量在線原位監(jiān)測方法，其特征在于，所述的分形維數(shù)包括自相似維數(shù)，Hausdorff維數(shù)以及計盒子維數(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固態(tài)發(fā)酵真菌生物量在線原位監(jiān)測方法，其特征在于，高分辨率攝像頭的拍攝速度為200幀/秒 400幀/秒之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固態(tài)發(fā)酵真菌生物量在線原位監(jiān)測方法，其特征在于，使用高分辨率攝像頭分別對發(fā)酵物的正上面、正側(cè)面取像，在反應(yīng)器內(nèi)取像方法和反應(yīng)器外取像方法一致。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的固態(tài)發(fā)酵真菌生物量在線原位監(jiān)測方法，其特征在于，閾值分割方法包括雙峰直方圖閾值分割法，平均灰度法，最小誤差閾值分割法，最大類間方差法，模糊C均值聚類方法，最大熵方法，矩量保持法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種固態(tài)發(fā)酵真菌生物量的在線原位監(jiān)測方法。其特征在于使用生產(chǎn)菌株在反應(yīng)器外進(jìn)行發(fā)酵試驗，拍攝不同發(fā)酵階段的菌體-基質(zhì)圖像，通過數(shù)字圖像處理求得分形維數(shù)，同時用化學(xué)法測定相應(yīng)的菌體生物量，計算分形維數(shù)與菌體生物量之間的函數(shù)關(guān)系；使用反應(yīng)器中內(nèi)置攝像頭拍攝固態(tài)發(fā)酵過程菌體生長圖像并計算其分形維數(shù)，根據(jù)分形維數(shù)-生物量函數(shù)關(guān)系可得相應(yīng)生物量。本發(fā)明可實現(xiàn)固態(tài)發(fā)酵真菌生物量在線監(jiān)測，促進(jìn)固態(tài)發(fā)酵自動化控制。
文檔編號C12R1/885GK102392068SQ201110236660
公開日2012年3月28日 申請日期2011年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月17日
發(fā)明者段穎異, 陳洪章 申請人:中國科學(xué)院過程工程研究所