專利名稱：一種半連續(xù)發(fā)酵生產生物丁醇的方法
技術領域：
本發(fā)明提供了一種半連續(xù)發(fā)酵生產生物丁醇的方法，屬于生物工程技術領域。具體涉及半連續(xù)發(fā)酵方法在糖丁酸梭菌CZo1SiriiZi腫saccharobutylicum DSM 13864發(fā)酵甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜及木質纖維素水解糖漿等糖質原料制備生物丁醇過程中的應用。
背景技術：
正丁醇(butanol)習慣上簡稱丁醇，化學式為C4HltlO,無色透明液體，具有強烈的氣味，稍溶于水，有毒、易燃，屬二級易燃危險品。丁醇是一種重要的C4平臺化合物，也是一種戰(zhàn)略性產品，用途非常廣泛，可用于鄰苯二甲酸正丁酯、脂肪二元酸和磷酸丁酯、丙烯酸丁酯及醋酸丁酯等的合成；可經過氧化生產丁醛或丁酸；還可用作油脂、醫(yī)藥和香料的提取溶劑以及醇酸樹脂的添加劑等。此外，可用作有機染料和印刷油墨的溶劑、脫蠟劑。我國丁醇主要用于生產醋酸丁酯、丙烯酸丁酯、鄰苯二甲酸二丁酯及醫(yī)藥中間體等。丁醇還是一種重要的具有極大潛力的新型生物燃料，無論是燃燒值還是辛烷值丁醇都與汽油接近。同時，丁醇可按高比例與汽油進行混合作為燃料，而不需要對汽車進行改裝；比使用汽油與乙醇的混合燃料更實惠。丁醇的低蒸汽壓力和疏水性，使得丁醇的運輸依靠現(xiàn)有的汽油輸送管道及分銷渠道成為可能，這充分表明丁醇是理想的汽油替代燃料。國內外丁醇的生產主要通過石油化工合成獲得。近年來，隨著石油化工方法生產丁醇的成本大幅提高，給發(fā)酵法生產生物丁醇帶來了新的機遇。在中國，傳統(tǒng)工業(yè)化發(fā)酵生產丙酮丁醇主要是以玉米等糧食類淀粉質原料為底物(Appl Microbiol Biotechnol 2009, 83:415-423)，這不僅提高了發(fā)酵成本而且危及國家糧食安全。為了解決這一難題，近年來許多高校和研究機構開始用糖蜜(J Mol Microbiol Biotechnol 2000, 2:115-124，)、木質纖維素水解液(Biomass Bioenergy 2010，34:559-565)等價廉的糖質原料來代替糧食淀粉質原料發(fā)酵生產丙酮丁醇。糖蜜是制糖工業(yè)的副產品，其中主要含有大量可發(fā)酵糖(主要是蔗糖)，因而是發(fā)酵工業(yè)中較廉價的碳源原料。目前，用糖蜜來發(fā)酵生產丙酮丁醇的方法主要以分批發(fā)酵為主，也有補料分批的研究。Qureshi等人在 80g/L的糖蜜中加入25. 3 g/L葡萄糖，用C. beijerinckii BAlOl進行分批發(fā)酵，分批總溶劑為 22. 8 g/L (J Ind Microbiol Biotechnol 2001，26:290-295) ；Syed 等人用誘變菌 C. acetobutylicum MEMS-7 發(fā)酵 6% 的糖蜜，丁醇分批產量達 18. 3 g/L (Turk J Biochem 2008, 33:25-30,)；裴建新等人從土壤中篩選出兩株C知ijeri/^iii，用糖蜜進行分批發(fā)酵，最高總溶劑為11.33 g/L (釀酒科技2010，5(191) :32-35)。范俊輝等人從土壤中分離出1株適合利用甜菜糖蜜發(fā)酵生產丁醇的丙酮丁醇梭菌C. acetobutylicum 2N，以補料分批發(fā)酵方式降低底物抑制，33°C發(fā)酵48 h后，丁醇和總溶劑的濃度分別為14.15 g/L和 19.65 g/L，丁醇質量分數(shù)超過70% (生物加工過程2010，8(6):6_9)。目前，工業(yè)上還沒有關于發(fā)酵甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜及木質纖維素水解糖漿等糖質原料糖蜜半連續(xù)發(fā)酵生產生物丁醇的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種半連續(xù)發(fā)酵生產生物丁醇的方法，為工業(yè)化發(fā)酵生產生物丁醇提供一種運行成本低、能源消耗低、生產強度高、易于自動化操作的半連續(xù)發(fā)酵生產新方法。本發(fā)明的技術方案一種半連續(xù)發(fā)酵生產生物丁醇的方法，先經種子培養(yǎng)，然后整個發(fā)酵過程為二級半連續(xù)發(fā)酵一級罐提供菌體，二級罐發(fā)酵生產生物丁醇溶劑；步驟為
(1)種子培養(yǎng)
以糖丁酸梭菌(C/osirii/i腫saccharobutylicum )DSM 13864為發(fā)酵生產生物丁醇的菌種，C/osirii/iwB saccharobuty licum DSM 13864購自德國微生物菌種保藏中心(DSMZ)。種子培養(yǎng)基為RCM培養(yǎng)基(/L):酵母膏0.5_5g，牛肉膏5_30g，蛋白胨2_20g， 可溶性淀粉0-5g，葡萄糖2-10g，半胱氨酸鹽酸鹽0-5g，NaCl 2-10g, NaAc 2_10g，刃天青 0. 5_5mg, pH 5. 5-7. 5。將菌種孢子液轉接于種子培養(yǎng)基中，置于真空干燥器中抽真空(0.065MPa)，種子培養(yǎng)條件為20-40°C，培養(yǎng)時間5-20 h。(2)半連續(xù)發(fā)酵
半連續(xù)發(fā)酵過程分為二級一級罐(1-2個)提供菌體，二級罐(1-5個)發(fā)酵生產生物丁醇溶劑。一級補料培養(yǎng)基(SSMl) (/L)總糖 0. 5%-5%，CaCO3 2-10 g, (NH4)2SO4 0.5-5 g, K2HPO4 0. 2-2 g，玉米漿干粉 5-30g, MnSO4 · H2O 0-0. 5g, pH 5. 5-7. 5。二級補料培養(yǎng)基(SSM2) (/L)總糖 4%-20%，CaCO3 2-10 g, (NH4)2SO4 0.5-5 g, K2HPO4 0. 2-2 g，玉米漿干粉 5-30g, MnSO4 · H2O 0-0. 5g, pH 5. 5-7. 5。一級罐為1-2個，二級罐為1-5個，一級罐培養(yǎng)時間為5-15 h，二級罐培養(yǎng)時間為 8-30 h，培養(yǎng)溫度為20-40°C。一級罐與二級罐之間為串聯(lián)，二級罐之間為并聯(lián)。(a)在一級罐中培養(yǎng)獲得菌體培養(yǎng)基即為一級補料培養(yǎng)基SSMlJf 20_40°C培養(yǎng)5-20 h的種子液按1%_20%的接種量接種于一級發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度為20-40°C，當菌體濃度達5. 0-10.0 (OD660)時，將10%-90%體積的發(fā)酵液轉移至其中一個二級發(fā)酵罐中，立即向這個二級發(fā)酵罐補加同等體積的二級補料培養(yǎng)基(SSiC)，同時在一級發(fā)酵罐中補加一級補料培養(yǎng)基(SSMl)使液體體積達未轉移前相同，開始發(fā)酵，一級和二級發(fā)酵溫度均為 20-40 "C。當一級發(fā)酵罐中菌體濃度再次達5. 0-10.0 (OD660)時，將10%_90%體積的發(fā)酵液轉移至另一個二級發(fā)酵罐中，立即向這個二級發(fā)酵罐補加同等體積的二級補料培養(yǎng)基 (SSiC)，同時在一級發(fā)酵罐中補加一級補料培養(yǎng)基(SSMl)使液體體積達未轉移前相同，在相同發(fā)酵條件下進行新一輪的發(fā)酵。(b)將一級罐中10%_90%的菌液轉移至二級罐中；向二級發(fā)酵罐補加同等體積的二級補料培養(yǎng)基SSM2，一級和二級發(fā)酵溫度均為20-40°C。(c)在一級罐和二級罐中分別補入與轉移菌液等體積的新鮮一級補料培養(yǎng)基 SSM1、二級補料培養(yǎng)基SSM2，繼續(xù)培養(yǎng)。(d)當二級發(fā)酵罐中總溶劑(丙酮、乙醇、丁醇)為14. 00-19. 20 g/L時，放出二級發(fā)酵罐中的全部發(fā)酵液。(e)待一級罐中菌體再次達到所需濃度，以上述(b) - (d)操作步驟重復進行， 半連續(xù)發(fā)酵穩(wěn)定循環(huán)達26次。發(fā)酵所用糖為甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜或木質纖維素水解糖漿等作為半連續(xù)發(fā)酵生產生物丁醇的主要碳源。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明所使用的半連續(xù)發(fā)酵裝置結構示意圖如下詳見圖1， 該發(fā)酵裝置包括1 (或2)個一級罐、3 (或1-5)個二級罐、1個一級補料罐和1個二級補料罐。一級罐與二級罐之間串聯(lián)，3個二級罐之間為并聯(lián)。與分批發(fā)酵相比，本發(fā)明的明顯優(yōu)勢在于可獲得較高的溶劑產量和溶劑生產強度；只需一次滅菌和接種，節(jié)約了反復洗罐、 滅菌等非發(fā)酵時間，縮短了生產周期，大大的提高了設備的利用率；且發(fā)酵設備簡單，易于自動化控制，適用于工業(yè)化。以糖丁酸梭菌CZo1SiriiZi腫saccharobutylicum DSM 13864半連續(xù)發(fā)酵生產生物丁醇，發(fā)酵原料為甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜及木質纖維素水解糖漿等糖質糖蜜原料。半連續(xù)發(fā)酵可穩(wěn)定進行26個循環(huán)，一級罐發(fā)酵時間為7 h，細胞濃度(OD66tl)維持在7. M至8. 18。二級罐分批發(fā)酵時間為14-18 h，發(fā)酵可穩(wěn)定持續(xù)205 h，平均總溶劑為15. 27 g/L，14 h時的平均生產強度為1. 05 g/L/h，糖平均消耗率達99. 22%。在15和17個循環(huán)時，總溶劑最高分別達到 18. 50g/L 和 19. 11 g/L。


圖1半連續(xù)發(fā)酵裝置結構示意圖。1、一級補料罐；2、二級補料罐；3、泵；4、止水夾；5、取樣口 ；6、一級罐；7、二級罐。
具體實施例方式實施例1
以糖丁酸梭菌^Zo1Sirii//腫saccharobutylicum DSM 13864為發(fā)酵生產生物丁醇菌種，以甘蔗糖蜜為發(fā)酵原料。種子培養(yǎng)基為RCM培養(yǎng)基(/L)酵母膏3g，牛肉膏10g，蛋白胨10g，可溶性淀粉 lg，葡萄糖5g，半胱氨酸鹽酸鹽0. 5g，NaCl 3g，NaAC 3g，刃天青;3mg，pH 6.5。10 mL試管種子培養(yǎng)基中轉接1 mL菌種孢子液，置于真空干燥器中抽真空至壓力為0.065 MPa，37°C培養(yǎng) 12-18 h。一級補料培養(yǎng)基(SSMl) (/L)總糖覬，CaCO3 3. 2 g, (NH4)2SO4 2 g, K2HPO4 0. 5 g, 玉米漿干粉 20g, MnSO4 · H2O 0. Olg, pH 6. 7。二級補料培養(yǎng)基(SSM2) (/L)總糖 8%，CaCO3 3.2 g, (NH4)2SO4 2 g, K2HPO4 0.5 g，玉米漿干粉 10g, MnSO4 · H2O 0. Olg, pH 6. 4，121 "C 20 min 滅菌。一級罐250 mL,裝液量為200 mL ；二級罐500 mL,裝液量為300 mL ；補料瓶均為4
L0一級罐為1個，二級罐為3個，3個二級罐之間為并聯(lián)。以8%的接種量將培養(yǎng)好的種子液轉移至一級罐中，立即補加新鮮一級補料培養(yǎng)基(SSMl)使發(fā)酵液體積為200 mL，于37°C培養(yǎng)12 h (菌濃為7. 75 OD66tl)后，將150 mL —級發(fā)酵液泵至其中一個二級罐中，立即向這個二級罐中補加150 mL新鮮二級補料培養(yǎng)基 (SSM2)，同時向一級罐中補加150 mL新鮮一級補料培養(yǎng)基(SSMl)，開始培養(yǎng)，一級和二級的發(fā)酵溫度都為37°C。一級罐培養(yǎng)7 h (菌濃為7. 59 OD66tl)后，再次將150 mL 一級發(fā)酵液泵至二級罐中 (另一個)，立即向這個二級罐中補加150 mL新鮮二級補料培養(yǎng)基(SSM2)，同時向一級罐中補加150 mL新鮮一級補料培養(yǎng)基(SSMl)，開始新一輪的發(fā)酵，發(fā)酵條件同上。二級罐培養(yǎng)18 h后，抽出罐中全部發(fā)酵液，氣相檢測發(fā)酵液中的溶劑(丙酮、乙醇、 丁醇)含量。由表1看出，以上操作重復進行，可穩(wěn)定循環(huán)26次。一級罐發(fā)酵時間為7 h，細胞濃度(OD66tl)維持在7. M至8. 18。二級罐分批發(fā)酵時間為14-18 h，發(fā)酵可穩(wěn)定持續(xù)205 h， 平均總溶劑為15. 27 g/L, 14 h時的平均生產強度為1.05 g/L/h，糖平均消耗率達99. 2洲。 在15和17個循環(huán)時，總溶劑最高分別達到18. 50g/L和19. 11 g/L。表1.半連續(xù)發(fā)酵生產生物丁醇
權利要求
1. 一種半連續(xù)發(fā)酵生產生物丁醇的方法，其特征在于先經種子培養(yǎng)，然后整個發(fā)酵過程為二級半連續(xù)發(fā)酵一級罐提供菌體，二級罐發(fā)酵生產生物丁醇溶劑；步驟為(1)種子培養(yǎng)以糖丁酸梭菌(C/osirii/i腫saccharobutylicum) DSM 13864為發(fā)酵生產生物丁醇的菌種；種子培養(yǎng)基RCM，每L中含酵母膏0. 5-5g，牛肉膏5-30g，蛋白胨2_20g，可溶性淀粉 0_5g，葡萄糖 2-10g，半胱氨酸鹽酸鹽 0-5g，NaCl 2-10g, NaAc 2_10g，刃天青 0. 5_5mg，pH 5. 5-7. 5 ；將菌種孢子液轉接于種子培養(yǎng)基中，置于真空干燥器中抽真空0. 065MPa，種子培養(yǎng)條件為20-40°C，培養(yǎng)時間5-20 h ； (2)半連續(xù)發(fā)酵半連續(xù)發(fā)酵過程分為二級一級罐1-2個提供菌體，二級罐1-5個發(fā)酵生產生物丁醇溶劑；一級補料培養(yǎng)基 SSM1，每 L 中含總糖 0. 5%-5 %，CaCO3 2-10 g, (NH4)2SO4 0.5-5 g, K2HPO4 0. 2-2 g,玉米漿干粉 5-30g, MnSO4 · H2O 0-0. 5g, pH 5. 5-7. 5 ；二級補料培養(yǎng)基 SSM2，每 L 中含總糖 4%-20 %，CaCO3 2-10 g, (NH4)2SO4 0.5-5 g, K2HPO4 0. 2-2 g,玉米漿干粉 5-30g, MnSO4 · H2O 0-0. 5g, pH 5. 5-7. 5 ；一級罐為1-2個，二級罐為1-5個，一級罐培養(yǎng)時間為5-15 h，二級罐培養(yǎng)時間為8-30 h，培養(yǎng)溫度為20-40°C ；一級罐與二級罐之間為串聯(lián)，二級罐之間為并聯(lián)；(a)在一級罐中培養(yǎng)獲得菌體培養(yǎng)基即為一級補料培養(yǎng)基SSM1，將種子液按1%-20% 的接種量接種于一級發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度為20-40°C，當菌體濃度達OD66tl為5. 0-10. 0時，將 10%-90%體積的發(fā)酵液轉移至其中一個二級發(fā)酵罐中，立即向這個二級發(fā)酵罐補加同等體積的二級補料培養(yǎng)基SSM2 ；同時在一級發(fā)酵罐中補加SSM1，使液體體積達未轉移前相同； 繼續(xù)重復發(fā)酵；當一級發(fā)酵罐中菌體濃度再次達OD66tl為5. 0-10. 0時，將10%-90%體積的發(fā)酵液轉移至另一個二級發(fā)酵罐中，立即向這第二個二級發(fā)酵罐補加同等體積的二級補料培養(yǎng)基SSM2; 同時在一級發(fā)酵罐中補加一級補料培養(yǎng)基SSM1，使液體體積達未轉移前相同，在相同發(fā)酵條件下進行新一輪的發(fā)酵；(b)將一級罐中10%-90%的菌液轉移至二級罐中；向二級發(fā)酵罐補加同等體積的二級補料培養(yǎng)基SSM2，一級和二級發(fā)酵溫度均為20-40°C ；(c)在一級罐和二級罐中分別補入與轉移菌液等體積的新鮮一級補料培養(yǎng)基SSM1、二級補料培養(yǎng)基SSM2，繼續(xù)培養(yǎng)；(d)當二級發(fā)酵罐中總溶劑丙酮、乙醇和丁醇為14.00-19. 20 g/L時，放出二級發(fā)酵罐中的全部發(fā)酵液；(e)待一級罐中菌體再次達到所需濃度，以上述(b)- (d)操作步驟重復進行，半連續(xù)發(fā)酵穩(wěn)定循環(huán)達26次；半連續(xù)發(fā)酵中所用糖為甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜或木質纖維素水解糖漿，作為半連續(xù)發(fā)酵生產生物丁醇的主要碳源。
全文摘要
一種半連續(xù)發(fā)酵生產生物丁醇的方法，屬于生物工程技術領域。本發(fā)明涉及半連續(xù)發(fā)酵方法，以糖丁酸梭菌(Clostridiumsaccharobutylicum)DSM13864發(fā)酵甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜及木質纖維素水解糖漿等糖質原料制備生物丁醇過程中的應用。本發(fā)明方法可獲得較高的溶劑產量和溶劑生產強度；只需一次滅菌和接種，節(jié)約了反復洗罐、滅菌等非發(fā)酵時間，縮短了生產周期，大大提高了設備的利用率；且發(fā)酵設備簡單，易于自動化控制，適用于工業(yè)化。
文檔編號C12P7/16GK102286547SQ20111023685
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月18日 優(yōu)先權日2011年8月18日
發(fā)明者倪曄, 孫志浩, 王云 申請人:江南大學