專利名稱：生物恐怖因子的檢測芯片、檢測試劑盒及檢測方法
生物恐怖因子的檢測芯片、檢測試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物分子檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種生物恐怖因子的檢測芯片、檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的對重要生物恐怖因子(如炭疽桿菌、拉薩病毒、肉毒梭菌毒素、布魯氏菌等)的檢測還停留在常規(guī)的生化培養(yǎng)階段，這種檢測手段在面對大面積的生物恐怖因子篩查時(shí)會(huì)顯得束手無策；同樣實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)通常只能針對一種或最多幾種生物恐怖因子同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，而面對一個(gè)樣品中含有多個(gè)甚至幾十個(gè)待測生物恐怖因子時(shí)，就必須進(jìn)行多次PCR反應(yīng)才能對樣品中所有的生物恐怖因子進(jìn)行擴(kuò)增而達(dá)到檢測目的，這就使得實(shí)驗(yàn)操作不僅繁瑣費(fèi)時(shí)，對實(shí)驗(yàn)耗材造成極大地浪費(fèi)，而且不能快速地對生物恐怖因子做出篩查并及時(shí)地做出判斷，易失去對樣品中生物恐怖因子做出準(zhǔn)確結(jié)果分析的最佳時(shí)機(jī)。

發(fā)明內(nèi)容基于此，有必要提供一種用于快速檢測多個(gè)生物恐怖因子的檢測芯片；同時(shí)，還有必要提供一種用于快速檢測多個(gè)生物恐怖因子的檢測試劑盒；再次，還有必要提供一種用于快速檢測多個(gè)生物恐怖因子的檢測方法。一種生物恐怖因子的檢測芯片，其上至少固定有根據(jù)多種生物恐怖因子中的一種的基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)的探針分子；所述多種生物恐怖因子對應(yīng)設(shè)計(jì)的探針分子序列如下 志賀氏菌屬SEQ ID NO :1 ；大腸桿菌0157 :SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3 ；霍亂弧菌SEQ IDNO 4 ；耶爾森氏桿菌:SEQ ID NO 5 ；梭狀芽孢桿菌屬:SEQ ID NO 6 ；沙門氏菌屬:SEQ ID NO :7;鼻疽伯克霍爾德氏桿菌SEQ ID NO :8 ；類鼻疽伯克霍爾德氏桿菌SEQ IDNO :9 ；鸚鵡衣原體SEQ ID NO 10 ；伯內(nèi)特考克氏體SEQ ID NO :11 ；土拉熱弗朗西斯菌SEQ IDNO 12 ；普氏立克次體:SEQ IDNO :13 ；傷寒沙門氏菌:SEQ IDNO :14 ；炭疽桿菌:SEQ ID NO :15 ； 布魯氏桿菌SEQ ID NO 16 ；埃波拉病毒SEQ ID NO :17 ；拉薩病毒SEQ ID NO :18 ；馬爾堡病毒SEQ ID NO 19 ；尼帕病毒SEQ ID NO :20 ；漢坦病毒SEQ ID NO :21 ；天花病毒SEQ ID NO 22 ；馬秋博病毒:SEQ ID NO :23 ；委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒:SEQ ID NO :24 ；東方馬腦炎病毒=SEQ ID NO 25 ；西方馬腦炎病毒:SEQ ID NO :26。優(yōu)選的，所述檢測芯片上還固定有核苷酸序列為SEQ ID NO 81的陽性質(zhì)控探針。一種生物恐怖因子的檢測試劑盒，包括核酸提取液、雜交反應(yīng)液、PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液至少包括下列多對引物對中的一對SEQ ID NO :27與SEQ ID NO 28、SEQ ID N0:29 與 SEQ ID NO 30、SEQ ID N0:31 與 SEQ ID NO 32、SEQ ID N0:33 與 SEQ ID NO :34、 SEQ ID N0:35 與 SEQ ID NO 36、SEQ ID NO 37 與 SEQ ID NO 38、SEQ ID N0:39 與 SEQ ID NO 40,SEQ ID NO :41 與 SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 43 與 SEQ ID NO 44、SEQ ID NO :45 與 SEQ ID NO :46、SEQ ID NO 47 與 SEQ ID NO :48、SEQ ID NO 49 與 SEQ ID NO :50、SEQ ID N0:51 與 SEQ ID NO 52、SEQ ID N0:53 與 SEQ ID NO 54、SEQ ID N0:55 與 SEQ ID NO :56、SEQ ID N0:57與 SEQ ID NO 58、SEQ ID NO 59 與SEQ ID NO 60、SEQ ID N0:61 與SEQ ID NO 62,SEQ ID NO :63 與 SEQ ID NO 64、SEQ ID NO 65 與 SEQ ID NO 66、SEQ ID NO :67 與 SEQ ID NO :68、SEQ ID NO 69 與 SEQ ID NO :70、SEQ ID NO 71 與 SEQ ID NO :72、SEQ ID N0:73 與 SEQ ID NO 74、SEQ ID N0:75 與 SEQ ID NO 76、SEQ ID N0:77 與 SEQ ID NO :78、 SEQ ID NO 79 與 SEQ ID NO :80。優(yōu)選的，所述PCR反應(yīng)液中還包括陽性質(zhì)控引物對，所述陽性質(zhì)控引物對的正向引物為SEQ ID NO :82，反向引物為SEQ ID NO :83。一種生物恐怖因子的檢測方法，包括下述步驟A、提取待測樣品的核酸；B、多重 PCR擴(kuò)增待測樣品的核酸，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；C、將多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與檢測芯片上的探針分子雜交、并顯色檢測。優(yōu)選的，所述待測樣品為志賀氏菌屬、大腸桿菌0157、霍亂弧菌、耶爾森氏桿菌、梭狀芽孢桿菌屬、沙門氏菌屬、鼻疽伯克霍爾德氏桿菌、類鼻疽伯克霍爾德氏桿菌、鸚鵡衣原體、伯內(nèi)特考克氏體、土拉熱弗朗西斯菌、普氏立克次體、傷寒沙門氏菌、炭疽桿菌、布魯氏桿菌、埃波拉病毒、拉薩病毒、馬爾堡病毒、尼帕病毒、漢坦病毒、天花病毒、馬秋博病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒、東方馬腦炎病毒、西方馬腦炎病毒中的一種或多種的組合。優(yōu)選的，所述步驟A具體是將細(xì)菌、立克次氏體、衣原體及病毒分成兩組進(jìn)行核酸提取，一組為細(xì)菌、立克次氏體和衣原體，另一組為病毒。優(yōu)選的，所述步驟B多重PCR具體是對多種生物恐怖因子進(jìn)行分類分別進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；所述分類具體是將多種生物恐怖因子分成四組，第一組包括志賀氏菌屬、大腸桿菌0157、霍亂弧菌、耶爾森氏桿菌、梭狀芽孢桿菌屬、沙門氏菌屬；第二組包括鼻疽伯克霍爾德氏桿菌、類鼻疽伯克霍爾德氏桿菌、鸚鵡衣原體、伯內(nèi)特考克氏體、土拉熱弗朗西斯菌、 普氏立克次體、傷寒沙門氏菌、炭疽桿菌、布魯氏桿菌；第三組包括埃波拉病毒、拉薩病毒、 馬爾堡病毒、尼帕病毒、漢坦病毒；第四組包括天花病毒、馬秋博病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒、東方馬腦炎病毒、西方馬腦炎病毒。根據(jù)多種生物恐怖因子的基因保守區(qū)設(shè)計(jì)探針分子和PCR擴(kuò)增引物，并將多個(gè)探針分子集成到一個(gè)檢測芯片上，檢測通量高，同時(shí)由于應(yīng)用基因芯片檢測，檢測靈敏度高、 速度快；根據(jù)設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增引物序列的分析，采用多重PCR技術(shù)，可以一次對多種生物恐怖因子的核酸物質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增，從而進(jìn)一步加快了檢測的速度。同時(shí)，通過設(shè)計(jì)陽性質(zhì)控對照組對PCR過程進(jìn)行判讀，避免由于PCR過程錯(cuò)誤對檢測結(jié)果的干擾，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。

圖1為生物恐怖因子檢測方法流程圖。圖2為生物恐怖因子檢測的檢測結(jié)果圖。
具體實(shí)施方式下面主要結(jié)合具體實(shí)施例說明快速檢測生物恐怖因子的檢測芯片、檢測試劑盒及檢測方法。
通過對常見25種生物恐怖因子基因序列的分析，選擇相對保守的區(qū)域?yàn)榘邢驍U(kuò)增區(qū)域，并根據(jù)該區(qū)域序列設(shè)計(jì)探針分子和PCR擴(kuò)增用引物。檢測芯片上至少固定有一種探針分子，擴(kuò)增產(chǎn)物可以與檢測芯片上固定的探針分子雜交，再通過顯色反應(yīng)在檢測芯片的相應(yīng)位置呈現(xiàn)顏色。下表1為針對常見的25種生物恐怖因子基因保守區(qū)設(shè)計(jì)的探針分子表1
權(quán)利要求
1.一種生物恐怖因子的檢測芯片，其特征在于，所述檢測芯片上至少固定有根據(jù)多種生物恐怖因子中的一種的基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)的探針分子；所述多種生物恐怖因子對應(yīng)設(shè)計(jì)的探針分子序列如下志賀氏菌屬SEQ ID NO 1 ；大腸桿菌0157 =SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3 ；霍亂弧菌 SEQ ID NO 4 ；耶爾森氏桿菌SEQ ID NO 5 ；梭狀芽孢桿菌屬SEQ ID NO 6 ；沙門氏菌屬 SEQ ID NO :7 ；鼻疽伯克霍爾德氏桿菌SEQ ID NO :8 ；類鼻疽伯克霍爾德氏桿菌SEQ ID NO :9 ；鸚鵡衣原體SEQ ID NO :1Q ；伯內(nèi)特考克氏體SEQ ID NO :11 ；土拉熱弗朗西斯菌 SEQ ID NO 12 ；普氏立克次體:SEQ ID NO :13 ；傷寒沙門氏菌SEQID NO 14 ；炭疽桿菌:SEQ ID NO 15 ；布魯氏桿菌=SEQ ID NO 16 ；埃波拉病毒:SEQID NO :17 ；拉薩病毒=SEQ ID NO 18;馬爾堡病毒SEQ ID NO :19 ；尼帕病毒SEQ IDNO :2Q ；漢坦病毒SEQ ID NO :21 ；天花病毒SEQ ID NO 22 ；馬秋博病毒SEQ ID NO :23 ；委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒SEQ ID NO :24 ；東方馬腦炎病毒SEQ ID NO 25 ；西方馬腦炎病毒SEQ ID NO :26。
2.如權(quán)利要求1所述的生物恐怖因子的檢測芯片，其特征在于，所述檢測芯片上還固定有核苷酸序列為SEQ ID NO 81的陽性質(zhì)控探針。
3.—種生物恐怖因子的檢測試劑盒，包括核酸提取液、雜交反應(yīng)液、PCR反應(yīng)液，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液至少包括下列多對引物對中的一對SEQ ID NO :27與SEQ ID NO 28,SEQ ID N0:29 與 SEQ ID NO 30、SEQ ID N0:31 與 SEQ ID NO 32、SEQ ID N0:33 與 SEQ ID NO :34、SEQ ID NO 35 與 SEQ ID NO :36、SEQ ID NO 37 與 SEQ ID NO :38、SEQ ID NO 39 與 SEQ ID NO 40,SEQ ID NO :41 與 SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 43 與 SEQ ID NO 44、SEQ ID N0:45 與 SEQ ID NO 46、SEQ ID NO 47 與 SEQ ID NO 48、SEQ ID NO 49 與 SEQ ID NO: 50,SEQ ID NO :51 與 SEQ ID NO 52、SEQ ID N0:53 與 SEQ ID NO 54、SEQ ID N0:55 與 SEQ ID NO :56、SEQ ID NO 57 與 SEQ ID NO :58、SEQ ID NO 59 與 SEQ ID NO :60、SEQ ID NO 61 與 SEQ ID NO 62,SEQ ID NO 63 與 SEQ ID NO 64、SEQ ID NO :65 與 SEQ ID NO 66、SEQ ID N0:67 與 SEQ ID NO 68、SEQ ID NO 69 與 SEQ ID NO 70、SEQ ID N0:71 與 SEQ ID NO: 72,SEQ ID NO :73 與 SEQ ID NO 74、SEQ ID NO 75 與 SEQ ID NO 76、SEQ ID N0:77 與 SEQ ID NO :78、SEQ ID NO 79 與 SEQ ID NO :8Q。
4.如權(quán)利要求3所述的生物恐怖因子的檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液中還包括陽性質(zhì)控引物對，所述陽性質(zhì)控引物對的正向引物為SEQ ID NO :82，反向引物為SEQID NO :83ο
5.一種生物恐怖因子的檢測方法，其特征在于，包括下述步驟Α、提取待測樣品的核酸；B、多重PCR擴(kuò)增待測樣品的核酸，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；C、將多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與檢測芯片上的探針分子雜交、并顯色檢測。
6.如權(quán)利要求5所述的生物恐怖因子的檢測方法，其特征在于，所述待測樣品為志賀氏菌屬、大腸桿菌0157、霍亂弧菌、耶爾森氏桿菌、梭狀芽孢桿菌屬、沙門氏菌屬、鼻疽伯克霍爾德氏桿菌、類鼻疽伯克霍爾德氏桿菌、鸚鵡衣原體、伯內(nèi)特考克氏體、土拉熱弗朗西斯菌、普氏立克次體、傷寒沙門氏菌、炭疽桿菌、布魯氏桿菌、埃波拉病毒、拉薩病毒、馬爾堡病毒、尼帕病毒、漢坦病毒、天花病毒、馬秋博病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒、東方馬腦炎病毒、西方馬腦炎病毒中的一種或多種的組合。
7.如權(quán)利要求5所述的生物恐怖因子的檢測方法，其特征在于，所述步驟A具體是將細(xì)菌、立克次氏體、衣原體及病毒分成兩組進(jìn)行核酸提取，一組為細(xì)菌、立克次氏體和衣原體， 另一組為病毒。
8.如權(quán)利要求5所述的生物恐怖因子的檢測方法，其特征在于，所述步驟B多重PCR具體是對多種生物恐怖因子進(jìn)行分類分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述分類具體是將多種生物恐怖因子分成四組，第一組包括志賀氏菌屬、大腸桿菌 0157、霍亂弧菌、耶爾森氏桿菌、梭狀芽孢桿菌屬、沙門氏菌屬；第二組包括鼻疽伯克霍爾德氏桿菌、類鼻疽伯克霍爾德氏桿菌、鸚鵡衣原體、伯內(nèi)特考克氏體、土拉熱弗朗西斯菌、普氏立克次體、傷寒沙門氏菌、炭疽桿菌、布魯氏桿菌；第三組包括埃波拉病毒、拉薩病毒、馬爾堡病毒、尼帕病毒、漢坦病毒；第四組包括天花病毒、馬秋博病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒、東方馬腦炎病毒、西方馬腦炎病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物恐怖因子的檢測芯片、檢測試劑盒和檢測方法，根據(jù)多種生物恐怖因子的基因保守區(qū)設(shè)計(jì)探針分子和PCR擴(kuò)增引物，并將多個(gè)探針分子集成到一個(gè)檢測芯片上，檢測通量高，同時(shí)由于應(yīng)用基因芯片檢測，檢測靈敏度高、速度快；根據(jù)設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增引物序列的分析，采用多重PCR技術(shù)，可以一次對多種生物恐怖因子的核酸物質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增，從而進(jìn)一步加快了檢測的速度。
文檔編號C12Q1/70GK102286641SQ20111023789
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月18日 公開號201110237897.發(fā)明者劉春曉, 史蕾, 孫秋香, 季明輝, 徐云慶, 徐華, 李永進(jìn), 楊燕秋, 歐青葉, 談書勤, 趙純中, 顧大勇 申請人:深圳博爾美生物科技有限公司, 深圳國際旅行衛(wèi)生保健中心