專利名稱：一種從乳汁中純化溶菌酶的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體地，本發(fā)明涉及一種快速、高效的從乳汁中純化溶菌酶的方法。本發(fā)明方法可用于對乳汁中的溶菌酶進行大規(guī)模純化，且純化效率高、成本低、純化產(chǎn)品純度高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
背景技術：
天然溶菌酶(lysozyme)是一種在動物界和植物界中廣泛存在的糖苷酶。1922年 Alexander Flemin發(fā)現(xiàn)了多種粘液組織和分泌物中存在能夠溶解多種革蘭氏陽性菌的物質，他將這種溶解因子稱為溶菌酶。后來Flemin還發(fā)現(xiàn)，溶菌酶在軟骨組織和胃的勻漿液、 淚液、唾液、痰、鼻腔分泌物、病理性的尿液、血清和淋巴細胞中都存在，但是在健康的尿液、 腦脊髓或汗液中沒有溶菌酶。溶菌酶又稱胞壁質酶或N-乙酰胞壁質聚糖水解酶，是一種堿性酶，能水解致病菌細胞壁中的黏多糖，它主要通過破壞細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的 β-1，4糖苷鍵，使細胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導致細胞壁破裂，內(nèi)容物逸出而使細菌溶解。溶菌酶還可以與帶負電荷的病毒蛋白直接結合，與DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復鹽，使病毒失活。人溶菌酶的分子量為14600kDa，對人的溶菌酶研究發(fā)現(xiàn)，它由130個氨基酸殘基組成，有4個S-S鍵，其一級結構氨基酸序列與雞蛋清溶菌酶相比有極大的差異，但三級結構有相似性，其溶菌活性比雞蛋清溶菌酶高2倍。溶菌酶作為一種存在于生物體正常體液及組織中的非特異性免疫因素，具有多種藥理作用，目前已知的主要作用有(1)抗菌消炎作用溶菌酶的溶菌活性使其在預防和治療多種細菌性疾病中均有重要作用，如由鏈球菌家族微生物引起的耳炎、竇炎、腺炎等。它還可以結合并失活何種誘發(fā)癥的酸性物質，能增強抗生素和其他藥物的療效等。(2)抗病毒作用溶菌酶的正離子特性使其可以結合帶負電的病毒蛋白使其失活。(3)增強免疫力溶菌酶作為一種存在于人體正常體液及組織中的非特異性免疫因素，可以改善和增強巨噬細胞的吞噬和消化能力，激活白細胞的吞噬功能，并改善細胞抑制劑所導致的白細胞減少等。 (4)止血、鎮(zhèn)痛等作用。另外，溶菌酶作為一種無毒、無副作用的具有抗菌功能的蛋白質，可用作天然的食品防腐劑，現(xiàn)已廣泛應用于水產(chǎn)品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及飲料中的防腐；還可以添入乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制腸道中腐敗微生物的生存，同時直接或間接地促進腸道中雙歧桿菌的增殖。目前溶菌酶的純化方法多采用結晶法。在結晶法中，對預處理的含溶菌酶的溶液， 通過改變?nèi)芤簵l件，使溶菌酶以結晶態(tài)析出。這種方法操作簡單，但其生產(chǎn)周期較長，產(chǎn)率相對偏低，高純度產(chǎn)品獲取過程復雜，并且此方法不能用以分離微量的溶菌酶。此外還有高效液相色譜法溶菌酶，其分離過程雖然快速簡便，但是由于其儀器設備價格昂貴，所以其應用范圍受到很大限制。綜上所述，目前還沒有一種快速、高效的大規(guī)模純化溶菌酶的方法，因此本領域迫切需要開發(fā)一種快速、高效的大規(guī)?；a(chǎn)溶菌酶的方法
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種快速、高效、大規(guī)模分離純化溶菌酶的方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種適用于本發(fā)明方法的溶菌酶分離純化裝置。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種分離純化溶菌酶的方法，包括步驟(a)將含有溶菌酶的脫脂乳清與陽離子樹脂混合，從而使所述樹脂吸附溶菌酶；(b)對吸附了溶菌酶的樹脂進行洗滌，從而洗去未吸附的雜蛋白；(c)對經(jīng)洗滌的所述樹脂進行洗脫，從而獲得含溶菌酶的洗脫液；(d)對所述含溶菌酶的洗脫液進行超濾處理，從而獲得分子量大于20kDa蛋白的組分(i)、含溶菌酶的組分(ii)和分子量小于SkDa蛋白的組分(iii)。在另一優(yōu)選例中，步驟(a)所述的含有溶菌酶的脫脂乳清是將含溶菌酶的乳汁經(jīng)離心獲得的。在另一優(yōu)選例中，步驟(a)所述樹脂與含溶菌酶的溶液的比例為2 8-4 6(按體積計)，較佳地3 7(按體積計)。在另一優(yōu)選例中，步驟(a)所述的混合為攪拌吸附。在另一優(yōu)選例中，步驟(a)所述的混合溫度為低溫，較佳地0_4°C。在另一優(yōu)選例中，步驟(a)所述的混合時間沒有特別限制，較佳地2_12h，更佳地 4-8h。在另一優(yōu)選例中，步驟(b)所述的洗滌為先用純水洗滌，再用磷酸緩沖液洗滌，較佳地磷酸緩沖液中包含0. lmol/L NaCl,40mmol/L磷酸鹽，pH為6. 5。在另一優(yōu)選例中，步驟(C)所述的洗脫液為硫酸銨溶液，硫酸銨濃度為 0. 5-10wt %，較佳地 2-8wt %。在另一優(yōu)選例中，步驟(C)所述的洗脫液的體積與步驟(b)獲得的吸附了溶菌酶的樹脂體積之比為1.2 0.8-0.8 1.2，更佳地為1 1。在另一優(yōu)選例中，步驟(d)所述的超濾處理為將含溶菌酶的洗脫液進行第一次超濾，獲得分子量大于20kDa蛋白的超濾液，即組分(i)和含溶菌酶的透過液，對所述透過液進行第二次超濾，獲得分子量小于SkDa蛋白的透過液，即組分(iii)和含溶菌酶的超濾液，即組分(ii)。在另一優(yōu)選例中，步驟(d)所述的超濾處理為將含溶菌酶的洗脫液進行第一次超濾，獲得分子量小于SkDa蛋白的透過液，即組分(iii)和含溶菌酶的超濾液，對所述超濾液進行第二次超濾，獲得分子量大于20kDa蛋白的超濾液，即組分(i)和含溶菌酶的透過液，即組分(ii)。在另一優(yōu)選例中，所述分離純化溶菌酶的方法，還包括對含溶菌酶的溶液進行后處理，包括步驟
對所述含溶菌酶的組分(ii)進行冷凍干燥處理，或對所述含溶菌酶的組分(ii)進行結晶處理，獲得溶菌酶固態(tài)產(chǎn)品。在另一優(yōu)選例中，所述分離純化溶菌酶的方法，還包括樹脂前處理步驟

(i)洗滌樹脂，得到無雜質的樹脂；(ii)對步驟(i)處理后的樹脂，用NaOH溶液進行攪拌浸泡；(iii)對步驟(ii)的經(jīng)NaOH溶液攪拌浸泡的樹脂，用純水進行洗滌；(iv)對步驟(iii)獲得的樹脂，用HCl溶液進行攪拌浸泡；(ν)純水洗滌步驟(iv)得到的樹脂；(vi)對步驟(ν)獲得的樹脂，用NaOH溶液進行攪拌浸泡；(vii)純水沖洗步驟(vi)獲得的樹脂；(viii)用緩沖液處理步驟(vii)得到的樹脂，獲得待用的樹脂。在另一優(yōu)選例中，步驟(ii)所述NaOH溶液的濃度為l_5wt%，較佳地3wt%。在另一優(yōu)選例中，步驟(ii)所述的NaOH溶液浸泡時間沒有特別限制，較佳地 4h-6h。在另一優(yōu)選例中，步驟(iii)中，純水洗滌多次，至流出液PH值為7. 5。在另一優(yōu)選例中，步驟(vi)所述HCl溶液中HCl的含量為3_10wt%，較佳地 4wt%。在另一優(yōu)選例中，步驟(ν)中，純水洗滌多次，至流出液pH值為5. 5。在另一優(yōu)選例中，步驟(vi)所述的NaOH濃度為3_6wt%，較佳地4wt%。在另一優(yōu)選例中，步驟(vi)所述NaOH的浸泡時間沒有特別限制，較佳地4h_6h。在另一優(yōu)選例中，步驟(vii)中，純水沖洗多次，至洗出液pH為7. 5。在另一優(yōu)選例中，步驟(vii)所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液。在另一優(yōu)選例中，所述分離純化溶菌酶的方法，還包括樹脂再生步驟(a)HCl溶液攪拌浸泡用過的樹脂；(b)對步驟(a)得到的樹脂，用純水進行清洗；(c)對步驟(b)得到的樹脂，用NaOH溶液進行浸泡處理；(d)對步驟(C)得到的樹脂，用純水進行清洗，獲得再生樹脂。在另一優(yōu)選例中，步驟(a)所述HCl溶液含量為2_6wt%，較佳地4wt%。在另一優(yōu)選例中，步驟(a)所述HCl攪拌浸泡的時間沒有特別限制，較佳地4_6h。在另一優(yōu)選例中，步驟(c)所述NaOH溶液的濃度為2_6wt%，較佳地4wt%。在另一優(yōu)選例中，步驟(c)所述NaOH的浸泡時間沒有特別限制，較佳地4h_6h。在另一優(yōu)選例中，所述樹脂為724樹脂。在另一優(yōu)選例中，所述的脫脂乳清來自奶牛、水牛、山羊、奶山羊、綿羊和兔。在另一優(yōu)選例中，所述的脫脂乳清來自轉基因的奶牛、水牛、山羊、奶山羊、綿羊和
兔ο在另一優(yōu)選例中，所述的脫脂乳清來自轉基因山羊。在另一優(yōu)選例中，所述溶菌酶選自人、牛、羊或雞的溶菌酶，較佳地為人溶菌酶。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種適用于本發(fā)明方法的攪拌反應器，所述反應器包括制冷裝置、罐體、罐蓋和罐體內(nèi)設置攪拌器。
在另一選例中，所述攪拌反應器還設有用于實時監(jiān)測攪拌反應的pH電極。在另一選例中，所述攪拌反應器還包括兩相分離裝置。應理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。限于篇幅，在此不再--累述。


下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本發(fā)明范圍。圖1顯示了從轉基因山羊乳汁中大規(guī)模提取人溶菌酶的工藝流程。圖2顯示了不同純化程度的溶菌酶SDS-PAGE電泳鑒定結果。泳道M為標準分子量蛋白Marker，從上到下分子量分別為250kDa、130kDa、95kDa、 72kDa、55kDa、36kDa、28kDa、17kDa 禾口 IlkDa ；泳道1為脫脂乳清；泳道2為樹脂吸附后的洗脫樣品；泳道3為硫酸銨的洗脫液；泳道4和泳道5為超濾后純化的人溶菌酶(rhLYZ)樣品。
具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)，含溶菌酶的脫脂乳清用陽離子樹脂吸附并洗脫后所獲得的洗脫液，不僅洗脫液中溶菌酶的含量很高，而且雜質基本上為分子量遠大于溶菌酶的大分子蛋白(主要為分子量約80士 IOkDa的蛋白雜質)以及少量極低分子量多肽雜質(分子量小于約2kDa的蛋白雜質)，因此通過與膜超濾技術相結合，即可快速、簡便地去除雜質蛋白，從而獲得的高純度(90%以上)的溶菌酶產(chǎn)品，且回收率很高(達 70%以上)。溶菌酶及其生產(chǎn)方法溶菌酶作為一種具有多種藥理作用的蛋白質，存在于生物體正常體液及組織中， 乳汁和胎盤是獲得天然人溶菌酶的主要來源，然而由于這些材料相當有限，造成天然溶菌酶很難大量獲得，溶菌酶的價格過于昂貴，不利于大規(guī)模應用。來源于除人外的其他物種的溶菌酶會引起許多副作用，例如，蛋清來源的溶菌酶可引起過敏反應，牛源的溶菌酶具有傳染瘋牛病的威脅，其他動物來源的溶菌酶由于與人的同源性較低，不適合人用藥物。生物技術的發(fā)展為克服上述限制提供了有效途徑，通過基因工程的手段，構建乳腺反應器，能夠在哺乳動物的乳汁中大量獲得人溶菌酶蛋白，本領域的技術人員可以使用通用的方法在哺乳動物中生產(chǎn)溶菌酶。可用于本發(fā)明的溶菌酶沒有特別限制，可以是天然溶菌酶，也可以是重組表達的溶菌酶，可以是哺乳動物(如人、牛、羊)的溶菌酶，也可以是雞(如蛋清)等非哺乳動物的溶菌酶。對于重組生產(chǎn)溶菌酶而言，可以使用原核或真核細胞宿主細胞，也可以構建乳腺反應器生產(chǎn)重組溶菌酶。較佳地，采用乳腺反應器技術獲得含重組人溶菌酶的乳汁。例如，在申請?zhí)枮?CN200510110772. 1的中國發(fā)明專利中，提供了一種在山羊乳汁中高效表達人溶菌酶蛋白的方法首先構建人溶菌酶(rLYZ)的乳腺特異性表達構件，所述構件包括但不限于β乳球蛋白基因的5’調控序列、溶菌酶基因組DNA的全部序列。在另一優(yōu)選例中，所述特異性表達構件還可以包括polyA加尾信號、抗性標記等。用含有hLYZ的轉基因細胞作為供核，山羊的卵母細胞作為供質，進行細胞克隆。對成活的克隆羊進行PCR和Southern-Blot分析， 確認是否為轉基因溶菌酶的山羊。對獲得的轉基因山羊進行人工激素泌乳誘導，收集乳汁， 從而獲得含有溶菌酶的原料。原料及初步處理適用于本發(fā)明的含溶菌酶的原料沒有特別限制，代表性的例子包括(但并不限于)含溶菌酶的羊乳汁、含溶菌酶的牛乳汁。含溶菌酶的原料一般需要進過初步處理以便獲得含有溶菌酶的脫脂乳清。對于乳汁原料來說，一般使用離心的方法進行初處理，離心條件沒有特限制，在一個優(yōu)選例中，0-4°C低溫離心，8000-10000rpm條件下，離心15-30分鐘，下層為雜質，中層為含有溶菌酶的脫脂乳清，上層為脂肪，取中層進行下一步處理。離子交換法和陽離子樹脂離子交換法(ion exchange process)是液相中的離子和固相中離子間所進行的一種可逆性的化學反應，它是利用溶液中各種帶電粒子與離子交換劑之間結合力的差異進行物質分離的操作技術，具有簡便、高效、成本低，且可自動化連續(xù)操作的優(yōu)點。陽離子樹脂與溶菌酶的結合是一種典型的離子交換反應，陽離子樹脂的反應基團包括但不限于磺酸基(-SO3H)、羧基(-C00H)等。適用于本發(fā)明的陽離子樹脂可以是強酸性陽離子交換樹脂(如-S03H型)和弱酸性陽離子交換樹脂(如-C00H，-OH型)。一種優(yōu)選的陽離子樹脂是7M樹脂。7M樹脂是一種大孔弱酸性的陽離子交換樹脂，主要成分為聚酰胺，含有-COOH基團，具有交換容量高、洗脫速度快、機械強度高、抗有機物污染能力強、再生能力好、價格低廉的特點。7M樹脂使用前需要進行前處理，使用后可以進行再生。本發(fā)明提供了一種7M樹脂前處理方法，包括步驟(i)純水洗滌樹脂，得到無雜質的7 樹脂；(ii)對步驟(i)處理后的樹脂，用NaOH進行攪拌浸泡；(iii)純水洗滌步驟(ii)得到的樹脂；(iv)對步驟(iii)獲得的樹脂，用HCl進行攪拌浸泡；(ν)純水洗滌步驟(iv)得到的樹脂；(vi)對步驟(ν)獲得的樹脂，用NaOH進行攪拌浸泡；(vii)純水沖洗步驟(vi)獲得的樹脂；(viii)用緩沖液處理步驟(vii)得到的樹脂，獲得待用的724樹脂。此外，本發(fā)明還提供了一種7M樹脂再生的方法，HCl溶液攪拌浸泡用過的7M 樹脂，然后用純水進行清洗，對得到的清洗后的樹脂，用NaOH溶液進行浸泡處理，用純水對 NaOH處理后的樹脂進行清洗，獲得再生樹脂。
膜超濾技術超濾技術通過膜表面的微孔結構對大小不同的物質進行選擇性分離。當液體混合物在一定壓力下流經(jīng)膜表面時，小分子溶質透過膜(稱為超濾液)，而大分子物質則被截留，使原液中大分子濃度逐漸提高(稱為濃縮液)，從而實現(xiàn)大、小分子的分離、濃縮、凈化的目的。與傳統(tǒng)分離方法相比，超濾技術具有以下特點1.分離過程是在常溫下進行，過濾條件溫和，不會破壞超濾液和透過液的成分，特別適宜對熱敏感的物質，如藥物、酶等的分離、分級、濃縮與富集。2.分離過程不發(fā)生相的變化，無需加熱，能耗低，無需添加化學試劑，無污染。3.超濾技術分離效率高，對稀溶液中的微量成分的回收、低濃度溶液的濃縮均非
常有效。4.超濾過程僅采用壓力作為膜分離的動力，因此分離裝置簡單、流程短、操作簡便、易于控制和維護。分離純化溶菌酶的方法本發(fā)明的提供了一種分離純化溶菌酶的方法，包括(但不限于)以下步驟將含有溶菌酶的溶液(如含溶菌酶的脫脂乳清)與陽離子樹脂混合，從而使所述樹脂吸附溶菌酶；對吸附了溶菌酶的樹脂進行洗滌，從而洗去未吸附的雜蛋白；對經(jīng)洗滌的所述樹脂進行洗脫，獲得含溶菌酶的洗脫液；對所述含溶菌酶的洗脫液進行超濾處理，從而獲得三個組分組分⑴分子量大于20kDa蛋白的組分；組分(ii)含溶菌酶的組分；和組分(iii)分子量小于SkDa蛋白的組分。在另一優(yōu)選例中，超濾可以選擇兩種方法方法(1)將含溶菌酶的洗脫液進行第一次超濾，獲得分子量大于20kDa蛋白的超濾液，即組分(i)和含溶菌酶的透過液，對透過液進行第二次超濾，獲得分子量小于SkDa蛋白的透過液，即組分(iii)和含溶菌酶的超濾液，即組分(ii)。方法O)將含溶菌酶的洗脫液進行第一次超濾，獲得分子量小于SkDa蛋白的透過液，即組分(iii)和含溶菌酶的超濾液，對超濾液進行第二次超濾，獲得分子量大于 20kDa蛋白的超濾液，即組分(i)和含溶菌酶的透過液，即組分(ii)。本發(fā)明方法還可以包括后處理步驟對含溶菌酶的組分(ii)進行冷凍干燥處理， 或對所述含溶菌酶的組分(ii)進行結晶處理等，獲得溶菌酶固態(tài)產(chǎn)品。本發(fā)明一個優(yōu)選例的工藝流程見圖1 將獲得的轉基因山羊乳汁原料低溫離心， 原料分離為3層，上層為脂肪，下層沉淀為雜質，中層為脫脂乳清，將脫脂乳清與經(jīng)過前處理的7M樹脂攪拌吸附，洗脫雜蛋白，獲得較純的溶菌酶-樹脂的結合產(chǎn)物，用硫酸銨將溶菌酶洗脫下來，獲得含有高濃度溶菌酶的洗脫液，用30kDa大小的濾膜對洗脫液進行超濾， 超濾液中的蛋白質分子量大于30kDa，透過液為溶菌酶和其他分子量小于30kDa的蛋白質， 用大小為3kDa的濾膜對透過液進行超濾，獲得含高濃度溶菌酶的超濾液，對超濾液進行冷凍干燥，得到溶菌酶干粉制品。本發(fā)明純化溶菌酶的方法主要優(yōu)點包括
(1)分離過程簡單快速，只需5-8小時；(2)純化成本低、效率高；(3)獲得的溶菌酶產(chǎn)品純度和回收率很高，分別達到90%和70%以上；(4)適合大規(guī)?；墓I(yè)應用。下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室手冊(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。通用方法本領域技術人員可以使用通用的方法對溶菌酶的活性和純度進行測定。配置底物溶液稱取溶酶小球菌15 20mg，加磷酸鹽緩沖液(pH6. 2)0. 5 1ml， 在研缽內(nèi)研磨3分鐘，再加磷酸鹽緩沖液(pH6. 2)適量，使總體積約為50ml，使懸浮液在 450nm的波長處測得的吸收度為0. 70士0. 05 (臨用前配制)。測定方法精密量取底物懸浮液:3ml，置Icm比色池中，在450nm的波長處測定吸收度，作為零秒的讀數(shù)A0，然后將含有溶菌酶的水溶液加入上述比色池中，迅速混勻，用秒表計時，至60秒時再測定吸收度Al ；同時精密量取磷酸鹽緩沖液(pH6. 2)0. 15ml,同法操作，做為空白試驗，測得零秒的讀數(shù)AO’及60秒的讀數(shù)Al，。酶活單位定義在室溫、pH值6. 2時，在波長450nm處，每分鐘引起吸收度下降 0. 001為一個酶活力單位。實施例1原料初步處理原料的初步處理的目的是除去雜質和脂肪。本是實施例采用離心法進行初步處理。取轉基因山羊乳汁100L (來自上海轉基因研究中心)，測定人溶菌酶的含量，為 lg/L。將轉基因山羊分泌的乳汁分裝到離心瓶中，4°C低溫離心，8000-10000rpm，離心15-30 分鐘。離心后去除沉淀雜質和上層的脂肪，取中間層的脫脂乳，紗布過濾后即為脫脂乳清， 共85L，低溫冷藏備用。實施例2陽離子樹脂的處理和再生樹脂類型7 樹脂。7M樹脂宜經(jīng)過酸堿處理轉型再使用，并且用過的樹脂可再生后循環(huán)使用。方法如下樹脂前處理(1)純水去除雜質，再用3wt% NaOH溶液攪拌浸泡4- ，用純水洗多次直到流出液的PH值近7. 5 ；(2) 4wt% HCl溶液攪拌浸泡4_他后純水清洗多次直到流出液的pH值近5. 5 ；(3)用NaOH溶液攪拌浸泡4_6h，用純水洗多次直到流出液的pH值近7. 5 ；(4)最后用0. 2mol/L的磷酸鹽緩沖液，pH = 6. 5，處理724樹脂Ih0用過的樹脂再生
4wt% HCl溶液攪拌浸泡4_6h，純水洗后，NaOH溶液攪拌浸泡4_6h，用純水洗滌，得到再生樹脂。實施例31.脫脂乳清與7M樹脂的攪拌吸附樹脂使用量按體積計，按30%的比例稱取樹脂，即7M樹脂脫脂乳清= 30 70。將待用的7M樹脂與脫脂乳清(85L)加入到一容器或反應器中，在約0_4°C條件下攪拌吸附6小時。2.雜蛋白的洗脫攪拌吸附后，用純水洗脫多次，直到溶液澄清為止；再使用3倍樹脂體積的 0. lmol/L NaCl，40mmol/L磷酸鹽溶液，pH6. 5，洗脫3次，每次30分鐘，使得雜蛋白去除。3.終洗脫液洗脫溶菌酶使用等樹脂體積的5%硫酸銨溶液GOmmol/L磷酸鹽溶液配制，pH6. 5)洗脫被樹脂吸附的溶菌酶，洗脫4次，每次40分鐘，收集每次的洗脫液。按脫脂乳清85L計，共洗得 140L收集液。4.膜超濾技術分離雜蛋白將140L的收集液過0. 22 μ m的濾膜去除雜質與細菌。使用30kDa的膜系統(tǒng)超濾，使溶菌酶與分子量大于30kDa的大分子蛋白分離，得到超濾液和含有溶菌酶的透過液，收集透過液，共300L。將透過液用3kDa的超濾系統(tǒng)濃縮脫鹽，得到含有高濃度溶菌酶的溶液。5.將高濃度溶菌酶溶液冷凍干燥，得到溶菌酶制品76. 23g，純度為92%，溶菌酶回收率> 70%。經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)驗證純化效果，如圖2所示。泳道M為標準分子量蛋白Marker，從上到下分子量分別為250kDa、130kDa、95kDa、72kDa、55kDa、36kDa、 28kDaU7kDa和IlkDa ；泳道1為上樣脫脂脫酪乳清；泳道2是樹脂吸附后的洗脫樣品；泳道3是硫酸銨的洗脫液；泳道4和5是超濾后純化的重組人溶菌酶(rhLYZ)樣品。結果表明，所得溶菌酶組分顯示為單一條帶，相對分子質量為14kD，純化效果很好。實施例4重復實施例3的工藝方法，再次分離純化溶菌酶，不同點在于在攪拌吸附中，將待用的7M樹脂與脫脂乳清按30 70的體積比加入到一具有攪拌和制冷功能的并配有pH 電極的攪拌吸附罐中，在約0-4°C條件下攪拌吸附6小時，并在攪拌過程中通過pH電極監(jiān)測溶液的酸堿，攪拌反應器還包括兩相分離裝置。將新鮮的轉基因山羊乳汁100L(人溶菌酶含量為lg/L)，離心后得脫脂乳清 85. 5L。85. 5L脫脂乳清與7M樹脂在攪拌罐中結合他，磷酸鹽溶液洗脫雜蛋白，5%的硫酸銨溶液洗脫得145L的收集液。將145L的收集液過0. 22 μ m的濾膜過濾除雜質與細菌，使用30KDa的膜超濾系統(tǒng)超濾得透過液500L，將透過液用3kDa的超濾濃縮脫鹽，冷凍干燥得人溶菌酶制品81. 42g，純度為約91%，人溶菌酶回收率為74. 13%。實施例5-6重復實施例3，不同點在于，按表1所述的條件進行處理。
表 權利要求
1.一種分離純化溶菌酶的方法，其特征在于，包括步驟(a)將含有溶菌酶的脫脂乳清與陽離子樹脂混合，從而使所述樹脂吸附溶菌酶；(b)對吸附了溶菌酶的樹脂進行洗滌，從而洗去未吸附的雜蛋白；(c)對經(jīng)洗滌的所述樹脂進行洗脫，從而獲得含溶菌酶的洗脫液；(d)對所述含溶菌酶的洗脫液進行超濾處理，從而獲得分子量大于20kDa蛋白的組分 (i)、含溶菌酶的組分(ii)和分子量小于SkDa蛋白的組分(iii)。
2.如權力要求1所述的分離純化溶菌酶的方法，其特征在于，步驟(d)所述的超濾處理包括步驟將含溶菌酶的洗脫液進行第一次超濾，獲得分子量大于20kDa蛋白的超濾液，即組分 (i)和含溶菌酶的透過液；對所述透過液進行第二次超濾，獲得分子量小于SkDa蛋白的透過液，即組分(iii)和含溶菌酶的超濾液，即組分(ii)。
3.如權力要求1所述的分離純化溶菌酶的方法，其特征在于，步驟(d)所述的超濾處理包括步驟將含溶菌酶的洗脫液進行第一次超濾，獲得分子量小于SkDa蛋白的透過液，即組分 (iii)和含溶菌酶的超濾液；對所述超濾液進行第二次超濾，獲得分子量大于20kDa蛋白的超濾液，即組分(i)和含溶菌酶的透過液，即組分(ii)。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，還包括對含溶菌酶的溶液進行后處理對所述含溶菌酶的組分(ii)進行冷凍干燥處理，或對所述含溶菌酶的組分(ii)進行結晶處理，獲得溶菌酶固態(tài)產(chǎn)品。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，還包括樹脂前處理步驟(i)洗滌樹脂，得到無雜質的樹脂；(ii)對步驟(i)處理后的樹脂，用NaOH溶液進行攪拌浸泡；(iii)對步驟(ii)的經(jīng)NaOH溶液攪拌浸泡的樹脂，用純水進行洗滌；(iv)對步驟(iii)獲得的樹脂，用HCl溶液進行攪拌浸泡；(ν)純水洗滌步驟(iv)得到的樹脂；(vi)對步驟(ν)獲得的樹脂，用NaOH溶液進行攪拌浸泡；(vii)純水沖洗步驟(vi)獲得的樹脂；(viii)用緩沖液處理步驟(vii)得到的樹脂，獲得待用的樹脂。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，還包括樹脂再生步驟，其特征在于，包括步驟(a)用HCl溶液對用過的樹脂進行攪拌浸泡；(b)對步驟(a)得到的樹脂，用純水進行清洗；(c)對步驟(b)得到的樹脂，用NaOH溶液進行浸泡處理；(d)對步驟(c)得到的樹脂，用純水進行清洗，獲得再生樹脂。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述樹脂為724樹脂。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的脫脂乳清來自奶牛、水牛、山羊、奶山羊、綿羊和兔。
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的脫脂乳清來自轉基因的奶牛、水牛、 山羊、奶山羊、綿羊和兔。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶菌酶選自人、牛、羊或雞的溶菌酶， 較佳地為人溶菌酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從乳汁中純化溶菌酶的方法，具體地，本發(fā)明結合陽離子樹脂和膜超濾技術，獲得高純度含溶菌酶的溶液。本發(fā)明方法適合規(guī)?；瘧?，具有成本低、高效率，獲得的產(chǎn)品純度和回收率高等優(yōu)點。
文檔編號C12N9/36GK102268418SQ201110238000
公開日2011年12月7日 申請日期2011年8月18日 優(yōu)先權日2011年8月18日
發(fā)明者劉思國, 成國祥, 陳建泉 申請人:上海杰隆生物工程股份有限公司, 上海轉基因研究中心