專利名稱：一種獲得耐受多種抑制劑酵母菌株的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種得到耐受多種抑制劑酵母菌株的方法。
背景技術：
能源一直是困擾世界各國經(jīng)濟和社會發(fā)展的重大問題，隨著石油的貧乏，開發(fā)新的可代替能源成為各國學者關注的熱點，生物能源更是受到廣泛的關注和研究。生物乙醇作為可再生能源，具有污染性小，容易運輸和貯藏的特點，在價格上也可與汽油相競爭，它是最有可能取代石油的新能源，同時在一定程度上可緩解能源危機，具有巨大的發(fā)展前景。 以淀粉類和糖類作為發(fā)酵材料，采用微生物法發(fā)酵生產(chǎn)乙醇是一項成熟的技術，但高昂的原料成本使其工業(yè)應用受到限制。以農(nóng)作物桔稈為代表的木質纖維素類生物質具有廉價， 來源豐富，對環(huán)境污染小的特點，是未來燃料乙醇產(chǎn)業(yè)規(guī)?；l(fā)展公認的原料來源。但是在纖維素乙醇生產(chǎn)工藝中，只有有效的破壞木質纖維素的致密結構才能使纖維素原料高效的轉化為可發(fā)酵糖類，因此纖維素原料在水解前一般需要進行預處理。但是廣泛應用的一些化學預處理方法通常在高溫高壓的條件下進行，會伴隨著產(chǎn)生一些抑制劑，如呋喃類、弱酸類、酚類等。這些抑制劑嚴重影響菌體的生長、乙醇的產(chǎn)率、生物量和細胞內(nèi)正常的分子機能。作為乙醇生產(chǎn)的傳統(tǒng)菌株——釀酒酵母，具有底物利用高效性，產(chǎn)物專一性和穩(wěn)健性等優(yōu)點，但是它對抑制劑環(huán)境敏感，被抑制作用明顯。傳統(tǒng)的脫毒步驟會增加生產(chǎn)的成本，所以獲得天然的耐受性酵母菌株從而實現(xiàn)原位脫毒和乙醇高效發(fā)酵在纖維素乙醇研究領域具有重要的意義。目前獲得耐受菌株的方法多是通過進化工程和基因工程。微生物的一個重要特性就是在壓力環(huán)境下改變細胞內(nèi)部的物理條件來適應抗性環(huán)境。已有文獻報道釀酒酵母在遇到生長環(huán)境劇烈變化時，可以通過引發(fā)自身的應激響應機制，同時細胞內(nèi)多種分子機制作出響應，如信號傳導，基因表達調控和代謝調節(jié)等，從而使細胞對壓力環(huán)境產(chǎn)生適應。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種獲得耐受多種抑制劑的釀酒酵母菌株的方法。本發(fā)明的技術方案概述如下—種獲得耐受多種抑制劑酵母菌株的方法，其特征是包括如下步驟將活化后的釀酒酵母菌株接種于含有纖維素水解液抑制劑的傳代培養(yǎng)基中培養(yǎng)；將生長到穩(wěn)定期的細胞分離后，再接種到相同的含有纖維素水解液抑制劑的新鮮傳代培養(yǎng)基中培養(yǎng)；獲得的穩(wěn)定期的菌株，即為耐受多種抑制劑酵母菌株。所述的纖維素水解液抑制劑為糠醛、苯酚和乙酸。所述糠醛在傳代培養(yǎng)基中的含量為1. 04g/L-l. 3g/L，所述乙酸在傳代培養(yǎng)基中的含量為4. 24g/L-5. 3g/L，所述苯酚在傳代培養(yǎng)基中的含量為0. 4g/L_0. 5g/L。所述釀酒酵母菌為安琪酵母，BY4741或BY4743。
利用本發(fā)明的方法獲得耐受多種抑制劑酵母菌株，對纖維素水解液抑制劑的耐受性提高，生長性狀穩(wěn)定，從而實現(xiàn)水解液的原位脫毒。為推進纖維素乙醇的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的意義。


圖1是安琪酵母在糠醛的含量為1. 3g/L，乙酸的含量為5. 3g/L，苯酚的含量為 0. 5g/L低糖培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)的前三代生長曲線；圖2是安琪酵母在糠醛的含量為1. 04g/L,乙酸的含量為4. Mg/L，苯酚的含量為 0. 4g/L高糖培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)的前三代生長曲線；圖3是安琪酵母在糠醛的含量為1. 3g/L，乙酸的含量為5. 3g/L，苯酚的含量為 0. 5g/L高糖培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)的前三代生長曲線；圖4是BY4741在糠醛的含量為1. 04g/L,乙酸的含量為 0. 4g/L低糖培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)的前三代生長曲線；圖5是BY4741在糠醛的含量為1. 04g/L,乙酸的含量為 0. 4g/L高糖培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)的前三代生長曲線；圖6是BY4741在糠醛的含量為1. 17g/L，乙酸的含量為 0. 45g/L高糖培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)的前三代生長曲線；圖7是BY4743在糠醛的含量為1. 04g/L,乙酸的含量為 0. 4g/L低糖培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)的前三代生長曲線；圖8是BY4743在糠醛的含量為1. 04g/L,乙酸的含量為 0. 4g/L高糖培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)的前三代生長曲線；圖9是BY4743在糠醛的含量為1. 17g/L，乙酸的含量為 0. 45g/L高糖培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)的前三代生長曲線；
具體實施例方式下面的實施例是為了使本領域的技術人員更好地理解本發(fā)明，并不對本發(fā)明作任何限制。下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例1一種獲得耐受多種抑制劑酵母菌株的方法(以安琪酵母(SC)為出發(fā)菌在含有纖維素水解液抑制劑的低糖培養(yǎng)基中利用傳代培養(yǎng)獲得耐受菌)，包括如下步驟1.種子培養(yǎng)基和傳代培養(yǎng)基的配制種子培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，121°C滅菌20min。傳代培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，121°C滅菌20min，在接種前加入纖維素水解液抑制劑糠醛、苯酚和乙酸，使得糠醛的含量為1. 3g/L，乙酸的含量為 5. 3g/L，苯酚的含量為0. 5g/L。2.傳代培養(yǎng)將安琪酵母經(jīng)接種于IOOmL種子培養(yǎng)基中，在30°C、150rpm培養(yǎng)10h。然后以OD6tltl =0. 1的初始菌體濃度接種于含有3L傳代培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，于30°C、150rpm條件下培
4. Mg/L，苯酚的含量為 4. Mg/L，苯酚的含量為 4. 77g/L，苯酚的含量為 4. Mg/L，苯酚的含量為 4. Mg/L，苯酚的含量為 4. 77g/L，苯酚的含量為養(yǎng)，使用75-6型紫外分光光度計測定培養(yǎng)過程中菌體的生長曲線。當菌體生長到穩(wěn)定期時，將細胞分離然后以OD6tltl = 0. 1的初始菌體濃度接種到相同的新鮮傳代培養(yǎng)基中，細胞進入穩(wěn)定期后再將細胞離心然后以0D_ = 0. 1的初始菌體濃度接種到相同的新鮮傳代培養(yǎng)基中，之后將穩(wěn)定期細胞保存，即為耐受菌。3.實驗結果如圖1所示，安琪酵母經(jīng)活化后接種到傳代培養(yǎng)基(含有纖維素水解液抑制劑的低糖培養(yǎng)基)中，細胞的生長受到十分顯著的抑制，第一輪的細胞經(jīng)過約IOOh的延滯期后開始進入指數(shù)生長期，直到141h左右，細胞才逐漸進入穩(wěn)定期。而將進入穩(wěn)定期的菌株傳代到新鮮的傳代培養(yǎng)基時，菌株的延滯期大大縮短，僅他左右，同時生長速率明顯加快，第二輪和第三輪的細胞都在Mh以內(nèi)完成發(fā)酵左右進入穩(wěn)定期。4.結論從上述實驗結果可知，安琪酵母接種到傳代培養(yǎng)基(含有纖維素水解液抑制劑的低糖培養(yǎng)基)中，生長受到明顯的抑制，經(jīng)過第一輪長時間的培養(yǎng)后，菌株對纖維素水解液抑制劑產(chǎn)生了一定的適應性和耐受性，在接下來的傳代培養(yǎng)中，菌株對纖維素水解液抑制劑的抵抗能力明顯增強，發(fā)酵時間明顯縮短，并且從兩種條件下第二輪和第三輪的發(fā)酵曲線可知，所獲得菌株的對纖維素水解液抑制劑的耐受性較為穩(wěn)定。所以以安琪酵母為出發(fā)菌株，可以利用該傳代培養(yǎng)的方法能夠獲得耐受1. 3g/L糠醛，5. 3g/L乙酸和0. 5g/L苯酚的耐受菌。實施例2一種獲得耐受多種抑制劑酵母菌株的方法(以安琪酵母為出發(fā)菌在含有纖維素水解液抑制劑的高糖培養(yǎng)基中利用傳代培養(yǎng)獲得耐受菌)，包括如下步驟1.種子培養(yǎng)基和傳代培養(yǎng)基的配制種子培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，121°C滅菌20min。傳代培養(yǎng)基1 葡萄糖100g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，121°C滅菌20min，在接種前加入纖維素水解液抑制劑糠醛、苯酚和乙酸，使得糠醛的含量為1. 04g/L,乙酸的含量為4. Mg/L，苯酚的含量為0. 4g/L。傳代培養(yǎng)基2 葡萄糖100g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，121°C滅菌20min，在接種前加入抑制劑纖維素水解液抑制劑糠醛、苯酚和乙酸，使得糠醛的含量為1. 3g/L，乙酸的含量為5. 3g/L，苯酚的含量為0. 5g/L。2.傳代培養(yǎng)將安琪酵母接種于IOOmL種子培養(yǎng)基中，在30°C、150rpm培養(yǎng)10h。然后以OD6tltl = 0. 5的初始菌體濃度接種于含有IOOmL傳代培養(yǎng)基1的250mL的錐形瓶中，于30°C、150rpm 條件下培養(yǎng)，使用75-6型紫外分光光度計測定培養(yǎng)過程中菌體的生長曲線。當菌體生長到穩(wěn)定期時，將細胞離心然后以0D_ = 0. 5的初始菌體濃度接種到相同的新鮮傳代培養(yǎng)基1 中細胞進入穩(wěn)定期后再將細胞離心然后以0D_ = 0. 5的初始菌體濃度接種到相同的新鮮傳代培養(yǎng)基1中，之后將穩(wěn)定期細胞保存，即為耐受菌。將安琪酵母經(jīng)活化接種于IOOmL種子培養(yǎng)基中，在30°C、150rpm培養(yǎng)10h。然后以 OD600 = 1.0的初始菌體濃度接種于含有IOOmL傳代培養(yǎng)基2的250mL的錐形瓶中，于30°C、 150rpm條件下培養(yǎng)，使用75_6型紫外分光光度計測定培養(yǎng)過程中菌體的生長曲線。當菌體生長到穩(wěn)定期時，將細胞離心然后以0D_ = 1. 0的初始菌體濃度接種到相同的新鮮傳代培養(yǎng)基2中，細胞進入穩(wěn)定期后再將細胞離心然后以OD6tltl = 1. 0的初始菌體濃度接種到相同的新鮮傳代培養(yǎng)基2中，之后將穩(wěn)定期細胞保存，即為耐受菌。3.實驗結果如圖2所示，安琪酵母中經(jīng)活化后接種到傳代培養(yǎng)基1 (含有纖維素水解液抑制劑的高糖培養(yǎng)基)中，細胞的生長受到十分顯著的抑制，第一輪的細胞經(jīng)過約24h的延滯期后開始進入指數(shù)生長期，直到3 左右，細胞才逐漸進入穩(wěn)定期。而將進入穩(wěn)定期的菌株傳代到含有相同抑制劑濃度的培養(yǎng)基時，菌株的延滯期大大縮短，僅池左右，同時生長速率明顯加快，第二輪和第三輪的細胞都在1 左右進入穩(wěn)定期。如圖3所示，安琪酵母經(jīng)活化后接種到傳代培養(yǎng)基2 (含有纖維素水解液抑制劑的高糖培養(yǎng)基)中，細胞的生長受到十分顯著的抑制，第一輪的細胞經(jīng)過長達約IOOh的延滯期后開始進入指數(shù)生長期，直到11 左右，細胞才逐漸進入穩(wěn)定期。而將進入穩(wěn)定期的菌株傳代到含有相同抑制劑濃度的培養(yǎng)基時，菌株的延滯期大大縮短，生長速率明顯加快，第二輪和第三輪的細胞都在M左右進入穩(wěn)定期。4.結論從上述實驗結果可知，安琪酵母接種到含有纖維素水解液抑制劑的高糖培養(yǎng)基中，生長受到明顯的抑制，經(jīng)過第一輪長時間的培養(yǎng)后，菌株對纖維素水解液抑制劑產(chǎn)生了一定的適應性和耐受性，在接下來的傳代培養(yǎng)中，菌株對抑制劑的抵抗能力明顯增強，發(fā)酵時間明顯縮短，并且從兩種條件下第二輪和第三輪的發(fā)酵曲線可知，所獲得菌株的對纖維素水解液抑制劑的耐受性較為穩(wěn)定。所以以安琪酵母為出發(fā)菌株，可以利用該傳代培養(yǎng)的方法獲得耐受1. 04g/L-l. 3g/L糠醛，4. 24g/L-5. 3g/L乙酸和0. 4g/L_0. 5g/L苯酚的耐受菌。實施例3一種獲得耐受多種抑制劑酵母菌株的方法(以釀酒酵母BY4741為出發(fā)菌在含有纖維素水解液抑制劑的低糖培養(yǎng)基中利用傳代培養(yǎng)獲得耐受菌)，包括如下步驟1.種子培養(yǎng)基和傳代培養(yǎng)基的配制種子培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，121°C滅菌20min。傳代培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，121 °C滅菌20min，在接種前加入纖維素水解液抑制劑糠醛、苯酚和乙酸，使得糠醛的含量為1.04g/L，乙酸的含量為4. 24g/L和苯酚的含量為0. 4g/L。2.傳代培養(yǎng)將釀酒酵母BY4741 IOOmL種子培養(yǎng)基的250mL中，在30°C、150rpm培養(yǎng)10h。然后以0D_ = 0. 1的初始菌體濃度接種于含有IOOmL傳代培養(yǎng)基的250mL的錐形瓶中，于 30°C、150rpm條件下培養(yǎng)，使用75_6型紫外分光光度計測定培養(yǎng)過程中菌體的生長曲線。 當菌體生長到穩(wěn)定期時，將細胞離心然后以0D_ = 0. 1的初始菌體濃度接種到相同的新鮮傳代培養(yǎng)基中，細胞進入穩(wěn)定期后再將細胞離心然后以0D_ = 0. 1的初始菌體濃度接種到相同的新鮮傳代培養(yǎng)基中，之后將穩(wěn)定期細胞保存，即為耐受菌。3.實驗結果如圖4所示，酵母菌株BY4741經(jīng)活化后接種傳代培養(yǎng)基(含有纖維素水解液抑制劑的低糖培養(yǎng)基)中，細胞的生長受到顯著抑制，第一輪的細胞經(jīng)過長達3 的延滯期后開始進入指數(shù)生長期，直到61h左右細胞生長進入穩(wěn)定期。而將進入穩(wěn)定期的菌株傳代到含有相同抑制劑濃度的培養(yǎng)基時，菌株的生長速率明顯加快，第二輪和第三輪的細胞都在29h 就可進入穩(wěn)定期。4.結論從上述實驗結果可知，酵母菌株BY4741接種到含有纖維素水解液抑制劑的低糖培養(yǎng)基中，生長受到明顯的抑制，經(jīng)過第一輪長時間的培養(yǎng)后，菌株對纖維素水解液抑制劑產(chǎn)生了一定的適應性和耐受性，在接下來的傳代培養(yǎng)中，菌株對纖維素水解液抑制劑的抵抗能力明顯增強，發(fā)酵時間明顯縮短，并且從兩種條件下第二輪和第三輪的發(fā)酵曲線可知， 所獲得菌株的對纖維素水解液抑制劑的耐受性較為穩(wěn)定。所以以釀酒酵母BY4741為出發(fā)菌株，可以利用該傳代培養(yǎng)的方法獲得耐受1. 04g/L糠醛，4. 24g/L乙酸和0. 4g/L苯酚的耐受菌。實施例4一種獲得耐受多種抑制劑酵母菌株的方法(以釀酒酵母BY4741為出發(fā)菌在高糖培養(yǎng)基中利用傳代培養(yǎng)獲得耐受菌)，包括如下步驟1.種子培養(yǎng)基和傳代培養(yǎng)基的配制種子培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，121°C滅菌20min。傳代培養(yǎng)基1 葡萄糖100g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，121 °C滅菌20min， 在接種前加入抑制劑使得糠醛的含量為1. 04g/L，乙酸的含量為4. 24g/L和苯酚的含量為 0.4g/L0傳代培養(yǎng)基2 葡萄糖100g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，121 °C滅菌20min， 在接種前加入抑制劑，使得糠醛的含量為1. 17g/L，乙酸的含量為4. 77g/L，苯酚的含量為 0. 45g/L。2.傳代培養(yǎng)將釀酒酵母BY4741接種于IOOmL種子培養(yǎng)基中，在30°C、150rpm培養(yǎng)10h。然后以0D_ = 1. 0的初始菌體濃度接種于含有IOOmL傳代培養(yǎng)基1的250mL的錐形瓶中，于 30°CU50rpm條件下培養(yǎng)，使用75_6型紫外分光光度計測定培養(yǎng)過程中菌體的生長曲線。 當菌體生長到穩(wěn)定期時，將細胞離心然后以0D_ = 1. 0的初始菌體濃度接種到相同的新鮮傳代培養(yǎng)基1中，細胞進入穩(wěn)定期后再將細胞離心然后以OD6tltl = 1. 0的初始菌體濃度接種到相同的新鮮傳代培養(yǎng)基1中，之后將穩(wěn)定期細胞保存，即為耐受菌。將釀酒酵母BY4741接種于IOOmL種子培養(yǎng)基中，在30°C、150rpm培養(yǎng)10h。然后以0D_ = 1. 0的初始菌體濃度接種于含有IOOmL傳代培養(yǎng)基2的250mL的錐形瓶中，于 30°CU50rpm條件下培養(yǎng)，使用75_6型紫外分光光度計測定培養(yǎng)過程中菌體的生長曲線。 當菌體生長到穩(wěn)定期時，將細胞離心然后以0D_ = 1. 0的初始菌體濃度接種到相同的新鮮傳代培養(yǎng)基2中，細胞進入穩(wěn)定期后再將細胞離心然后以OD6tltl = 1. 0的初始菌體濃度接種到相同的新鮮傳代培養(yǎng)基2中，之后將穩(wěn)定期細胞保存，即為耐受菌。3.實驗結果如圖5所示，釀酒酵母BY4741經(jīng)活化后接種到傳代培養(yǎng)基1 (含有纖維素水解液抑制劑的高糖培養(yǎng)基)中，同樣細胞的生長受到顯著抑制，第一輪細胞經(jīng)過約2 的延滯期才進入對數(shù)生長期，且在50h左右進入穩(wěn)定期。而將進入穩(wěn)定期的菌株傳代到含有相同抑制劑濃度的培養(yǎng)基時，細胞的生長速率明顯加快，第二輪和第三輪細胞均在21h進入穩(wěn)定期。如圖6所示，酵母菌株BY4741經(jīng)活化后接種到傳代培養(yǎng)基2 (含有纖維素水解液抑制劑的高糖培養(yǎng)基)中，細胞的生長受到顯著抑制，第一輪的細胞經(jīng)過長達7 的延滯期后開始進入指數(shù)生長期，直到9 左右細胞生長進入穩(wěn)定期。而將進入穩(wěn)定期的菌株傳代到含有相同抑制劑濃度的培養(yǎng)基時，菌株的生長速率明顯加快，第二輪和第三輪的細胞都在2 就可進入穩(wěn)定期。4.結論從上述實驗結果可知，酵母菌株BY4741接種到含有纖維素水解液抑制劑的高糖培養(yǎng)基中，生長受到明顯的抑制，經(jīng)過第一輪長時間的培養(yǎng)后，菌株對纖維素水解液抑制劑產(chǎn)生了一定的適應性和耐受性，在接下來的傳代培養(yǎng)中，菌株對纖維素水解液抑制劑的抵抗能力明顯增強，發(fā)酵時間明顯縮短，并且從兩種條件下第二輪和第三輪的發(fā)酵曲線可知， 所獲得菌株的對纖維素水解液抑制劑的耐受性較為穩(wěn)定。所以以釀酒酵母BY4741為出發(fā)菌株，可以利用該傳代培養(yǎng)的方法獲得耐受1. 04g/L-l. 17g/L糠醛，4. 24g/L-4. 77g/L乙酸和0. 4g/L-0. 45g/L苯酚的耐受菌。實施例5一種獲得耐受多種抑制劑酵母菌株的方法(以釀酒酵母BY4743為出發(fā)菌在低糖培養(yǎng)基中利用傳代培養(yǎng)獲得耐受菌)，包括如下步驟1.種子培養(yǎng)基和傳代培養(yǎng)基的配制種子培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，121°C滅菌20min。傳代培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，121 °C滅菌20min，在接種前加入抑制劑，使得糠醛的含量為1. 04g/L，乙酸的含量為4. 24g/L和苯酚的含量為0. 4g/ L02.傳代培養(yǎng)將釀酒酵母BY4743接種于IOOmL種子培養(yǎng)基的250mL中，在30°C、150rpm培養(yǎng) 10池。然后以0D_ = 0. 1的初始菌體濃度接種于含有IOOmL傳代培養(yǎng)基的250mL的錐形瓶中，于30°C、150rpm條件下培養(yǎng)，使用75_6型紫外分光光度計測定培養(yǎng)過程中菌體的生長曲線。當菌體生長到穩(wěn)定期時，將細胞離心然后以0D_ = 0. 1的初始菌體濃度接種到相同的新鮮傳代培養(yǎng)基中，細胞進入穩(wěn)定期后再將細胞離心然后以OD6tltl = 0. 1的初始菌體濃度接種到相同的新鮮傳代培養(yǎng)基中，之后將穩(wěn)定期細胞保存，即為耐受菌。3.實驗結果如圖7所示，酵母菌株BY4743經(jīng)活化后接種到傳代培養(yǎng)基(含有纖維素水解液抑制劑的低糖培養(yǎng)基)中，細胞的生長受到顯著抑制，第一輪的細胞經(jīng)過長達3 的延滯期后開始進入指數(shù)生長期，直到61h左右細胞生長進入穩(wěn)定期。而將進入穩(wěn)定期的菌株傳代到含有相同抑制劑濃度的培養(yǎng)基時，菌株的生長速率明顯加快，第二輪和第三輪的細胞都在 3 Ih就可進入穩(wěn)定期。4.結論從上述實驗結果可知，酵母菌株BY4743接種到含有纖維素水解液抑制劑的低糖培養(yǎng)基中，生長受到明顯的抑制，經(jīng)過第一輪長時間的培養(yǎng)后，菌株對纖維素水解液抑制劑產(chǎn)生了一定的適應性和耐受性，在接下來的傳代培養(yǎng)中，菌株對纖維素水解液抑制劑的抵抗能力明顯增強，發(fā)酵時間明顯縮短，并且從兩種條件下第二輪和第三輪的發(fā)酵曲線可知， 所獲得菌株的對纖維素水解液抑制劑的耐受性較為穩(wěn)定。所以以釀酒酵母BY4743為出發(fā)菌株，可以利用該傳代培養(yǎng)的方法獲得耐受1. 04g/L糠醛，4. 24g/L乙酸和0. 4g/L苯酚的耐受菌。實施案6一種獲得耐受多種抑制劑酵母菌株的方法(以釀酒酵母BY4743為出發(fā)菌在高糖培養(yǎng)基中利用傳代培養(yǎng)獲得耐受菌)，包括如下步驟1.種子培養(yǎng)基和傳代培養(yǎng)基的配置種子培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，121°C滅菌20min。傳代培養(yǎng)基1 葡萄糖100g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，121°C滅菌20min，在接種前加入纖維素水解液抑制劑糠醛、苯酚和乙酸，使得糠醛的含量為1.04g/L，乙酸的含量為4. 24g/L和苯酚的含量為0. 4g/L。傳代培養(yǎng)基2 葡萄糖100g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，121°C滅菌20min，在接種前加入纖維素水解液抑制劑糠醛、苯酚和乙酸，使得糠醛的含量為1. 17g/L，乙酸的含量為4. 77g/L，苯酚的含量為0. 45g/L。2.傳代過程將釀酒酵母BY4743接種于IOOmL種子培養(yǎng)基中，在30°C、150rpm培養(yǎng)10h。然后以0D_ = 1. 0的初始菌體濃度接種于含有IOOmL傳代培養(yǎng)基1的250mL的錐形瓶中，于 30°CU50rpm條件下培養(yǎng)，使用75_6型紫外分光光度計測定培養(yǎng)過程中菌體的生長曲線。 當菌體生長到穩(wěn)定期時，將細胞離心然后以0D_ = 1. 0的初始菌體濃度接種到相同的新鮮傳代培養(yǎng)基1中，細胞進入穩(wěn)定期后再將細胞離心然后以OD6tltl = 1. 0的初始菌體濃度接種到相同的新鮮傳代培養(yǎng)基1中，之后將穩(wěn)定期細胞保存，即為耐受菌。將釀酒酵母BY4743接種于IOOmL種子培養(yǎng)基中，在30°C、150rpm培養(yǎng)10h。然后以0D_ = 1. 0的初始菌體濃度接種于含有IOOmL傳代培養(yǎng)基2的250mL的錐形瓶中，于 30°CU50rpm條件下培養(yǎng)，使用75_6型紫外分光光度計測定培養(yǎng)過程中菌體的生長曲線。 當菌體生長到穩(wěn)定期時，將細胞離心然后以0D_ = 1. 0的初始菌體濃度接種到相同的新鮮傳代培養(yǎng)基2中，細胞進入穩(wěn)定期后再將細胞離心然后以OD6tltl = 1. 0的初始菌體濃度接種到相同的新鮮傳代培養(yǎng)基2中，之后將穩(wěn)定期細胞保存，即為耐受菌。3.實驗結果如圖8所示，釀酒酵母BY4743經(jīng)活化后接種到傳代培養(yǎng)基1 (含有纖維素水解液抑制劑的高糖培養(yǎng)基)中，同樣細胞的生長受到顯著抑制，第一輪細胞經(jīng)過約1 的延滯期才進入對數(shù)生長期，且在31h左右進入穩(wěn)定期。而將進入穩(wěn)定期的菌株傳代到含有相同抑制劑濃度的培養(yǎng)基時，細胞的生長速率明顯加快，第二輪和第三輪細胞均在21h進入穩(wěn)定期。如圖9所示，酵母菌株BY4743經(jīng)活化后接種到傳代培養(yǎng)基2 (含有纖維素水解液抑制劑的高糖培養(yǎng)基)中，同樣細胞的生長受到顯著抑制，第一輪的細胞經(jīng)過長達約4 的延滯期后開始進入指數(shù)生長期，直到70h左右細胞生長進入穩(wěn)定期。而將進入穩(wěn)定期的菌株傳代到含有相同抑制劑濃度的培養(yǎng)基時，菌株的生長速率明顯加快，第二輪和第三輪的細胞都在2 左右就可進入穩(wěn)定期。4.結論從上述實驗結果可知，釀酒酵母BY4743接種到含有纖維素水解液抑制劑的高糖培養(yǎng)基中，生長受到明顯的抑制，經(jīng)過第一輪長時間的培養(yǎng)后，菌株對纖維素水解液抑制劑產(chǎn)生了一定的適應性和耐受性，在接下來的傳代培養(yǎng)中，菌株對纖維素水解液抑制劑的抵抗能力明顯增強，發(fā)酵時間明顯縮短，并且從兩種條件下第二輪和第三輪的發(fā)酵曲線可知， 所獲得菌株的對纖維素水解液抑制劑的耐受性較為穩(wěn)定。所以以釀酒酵母BY4741為出發(fā)菌株，可以利用該傳代培養(yǎng)的方法獲得耐受1. 04g/L-l. 17g/L糠醛，4. 24g/L-4. 77g/L乙酸和0. 4g/L-0. 45g/L苯酚的耐受菌。
權利要求
1.一種獲得耐受多種抑制劑酵母菌株的方法，其特征是包括如下步驟將活化后的釀酒酵母菌株接種于含有纖維素水解液抑制劑的傳代培養(yǎng)基中培養(yǎng)；將生長到穩(wěn)定期的細胞分離后，再接種到相同的含有纖維素水解液抑制劑的新鮮傳代培養(yǎng)基中培養(yǎng)；獲得的穩(wěn)定期的菌株，即為耐受多種抑制劑酵母菌株。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種獲得耐受多種抑制劑酵母菌株的方法，其特征在于所述的纖維素水解液抑制劑為糠醛、苯酚和乙酸。
3.根據(jù)權利要求2所述的一種釀酒酵母的耐受多種抑制劑的菌株，其特征是所述糠醛在傳代培養(yǎng)基中的含量為1. 04g/L-l. 3g/L，所述乙酸在傳代培養(yǎng)基中的含量為4. 24g/ L-5. 3g/L，所述苯酚在傳代培養(yǎng)基中的含量為0. 4g/L-0. 5g/L。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種獲得耐受多種抑制劑酵母菌株的方法，其特征在所述釀酒酵母菌為安琪酵母，BY4741或BY4743。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種獲得耐受多種抑制劑酵母菌株的方法，包括如下步驟將活化后的釀酒酵母菌株接種于含有纖維素水解液抑制劑的傳代培養(yǎng)基中培養(yǎng)；將生長到穩(wěn)定期的細胞分離后，再接種到相同的含有纖維素水解液抑制劑的新鮮傳代培養(yǎng)基中培養(yǎng)；獲得的穩(wěn)定期的菌株，即為耐受多種抑制劑酵母菌株。利用本發(fā)明的方法獲得耐受多種抑制劑酵母菌株，對纖維素水解液抑制劑的耐受性提高，生長性狀穩(wěn)定，從而實現(xiàn)水解液的原位脫毒。為推進纖維素乙醇的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的意義。
文檔編號C12R1/865GK102296034SQ201110238038
公開日2011年12月28日 申請日期2011年8月18日 優(yōu)先權日2011年8月18日
發(fā)明者丁明珠, 元英進, 李炳志, 王昕 申請人:天津大學