專利名稱：可利用木糖發(fā)酵乳酸且耐高溫的融合乳酸菌及其育種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乳酸菌的育種方法，特別是涉及一種能夠利用木糖發(fā)酵且耐高溫的融合乳酸菌的育種方法。
背景技術(shù)：
乳酸在醫(yī)藥、食品、日用化工等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，它是一種重要的平臺化合物，可轉(zhuǎn)化為多種化合物如丙烯酸、丙二醇、乙醛和乙酰丙酮。近幾年來，隨著乳酸及其衍生物在生物可降解塑料及綠色環(huán)保溶劑中的應(yīng)用，工業(yè)上對乳酸的需求也逐漸增加。目前，全世界的乳酸年產(chǎn)量約為20-25萬噸，其中90%均選育特定的微生物用發(fā)酵法生產(chǎn)。乳酸發(fā)酵多采用大米、玉米等淀粉質(zhì)原料發(fā)酵，但發(fā)酵生產(chǎn)成本較高。以谷物或玉米為原料大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)乳酸作為聚乳酸合成前體會大量消耗糧食，加劇糧食與飼料資源的緊張狀況。采用廉價易得，來源廣泛的木質(zhì)纖維素為原料來發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，不僅能夠降低乳酸發(fā)酵的原料成本，而且具有深遠的環(huán)境與社會意義。木質(zhì)纖維素物質(zhì)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，決定了木質(zhì)纖維素乳酸工藝的復(fù)雜性。因此需要篩選和構(gòu)建具有一定特性的菌種，以滿足木質(zhì)纖維素乳酸工藝的特殊條件如能夠同時利用葡萄糖和木糖，能夠耐受木質(zhì)纖維素稀酸水解液中的抑制物，能夠耐高溫等。一些研究報道了部分可利用木糖的乳酸菌如戊糖乳桿菌(LactcAacillus pentosus)、干酪乳桿菌 (Lactobacillus casei ssp. Rhamnous)、冷凝芽抱桿菌(Bacillus coagulancs)禾口基因工程大腸桿菌(E.coli)利用木質(zhì)纖維素水解液發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的研究。但是這些菌株或者存在葡萄糖阻遏(carbon catabolic repression, CCR)效應(yīng)，如干酪乳桿菌優(yōu)先利用木質(zhì)纖維素水解液中的葡萄糖，待葡萄糖消耗殆盡才開始緩慢利用木糖；或者存在水解液抑制物不耐受的問題。據(jù)報道，稀酸水解液中已確認的抑制物多達35種，抑制物的濃度隨著預(yù)處理的水解程度的增加而增加。如當水解液中的木糖含量達到5g/l時，干酪乳桿菌的生長就因水解液中的抑制物受到抑制。冷凝芽孢桿菌雖然能夠同時利用水解液中的葡萄糖和木糖，但是當水解液中的木糖含量達到35g/l時，其生長就因水解液中的抑制物而受到阻遏。 盡管一些脫毒處理的方法如生物法，化學(xué)法被提出來，但是勢必增加乳酸發(fā)酵的成本。而通過誘變或基因修飾的手段，雖能夠改善部分木糖利用菌株如E. coli的葡萄糖阻遏效應(yīng)，但其同時代謝葡萄糖與木糖的能力與不存在葡萄糖阻遏的野生型菌株相比，還是相去甚遠。 短乳桿菌是一種不存在碳代謝阻遏(carbon catabolic repression, CCR)效應(yīng)，可同時代謝葡萄糖與木糖，而且能夠耐受木質(zhì)纖維素水解液抑制物的一種天然的乳酸菌，在木質(zhì)纖維素的生物煉制方面具有極大應(yīng)用潛力。同步糖化發(fā)酵(SSF)是實現(xiàn)木質(zhì)纖維素生物煉制最理想的一種發(fā)酵工藝。該工藝需要菌株具備耐受45 50°C高溫的特性，以配合纖維素酶的水解，使同步糖化發(fā)酵工藝的效率達到最高，從而降低纖維素酶的使用量，進而降低成本。而大部分可利用木糖的乳酸菌如短乳桿菌為嗜溫菌，不耐受45 50°C高溫。因此需要對短乳桿菌進行改造，提高其溫度耐受性，使其更適于木質(zhì)纖維素發(fā)酵的工藝條件。但是微生物的耐高溫機制復(fù)雜，往往涉及多個基因，單個或少量基因的表達或缺失，不能達到提高菌株的溫度耐受性。同時，目前關(guān)于短乳桿菌的遺傳背景，代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究尚處于起步階段，沒有建立成熟的基因改造技術(shù)，僅有少量的文章報道了關(guān)于短乳桿菌的代謝工程改造的報道，效果亦不理想。原生質(zhì)體融合雜交育種被證明是一種可以應(yīng)用于乳酸菌的良好的育種技術(shù)。但是該方法一般首先需要對融合的兩親本進行誘變，以獲得合適的遺傳標記。但是在誘變過程中往往可能將親本的優(yōu)良性狀相關(guān)的基因破壞或丟失，從而影響融合子優(yōu)良基因的獲得。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明設(shè)計了一種針對可利用木糖的乳酸菌，主要是短乳桿菌的一種育種方法。本發(fā)明提供的關(guān)于可利用木糖的乳酸菌，如短乳桿菌的育種方法，主要包括以下步驟1)選擇一種能夠耐受45 55°C高溫，不具備木糖利用能力的乳酸桿菌，制備原生質(zhì)體。2)培養(yǎng)可利用木糖的乳酸菌制備原生質(zhì)體。3)將上述獲得的兩種原生質(zhì)體進行融合。4)選擇合適的原生質(zhì)體再生條件，獲得融合子。上述方法中，所述可利用木糖的乳酸桿菌可為短乳桿菌，植物乳桿菌，具體可為短乳桿菌。上述方法中所述短乳桿菌已申請專利，專利號200910136559. 6。并于2009. 5. 4 保存于中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院 3號)，保藏號為CGMCC3051，公眾可據(jù)此到中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心任意購買。上述方法中，所述能夠耐受45 55°C高溫，不具備木糖利用能力的乳酸桿菌可為德氏乳桿菌，保加利亞乳桿菌，鼠李糖乳桿菌，具體可為鼠李糖乳桿菌CGMCC 1. 2134。上述方法中，所述原生質(zhì)體再生條件為，原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基木糖20g/l、蔗糖 171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、檸檬酸銨2g/l、磷酸氫二鉀2g/l、無水乙酸鈉3g/l、硫酸鎂0. 5g/l、硫酸錳0. 02g/l, BAS 5%、明膠25%、氯化鎂25mM、氯化鈣 25mM,其余為水，45 °C靜置培養(yǎng)。本發(fā)明分別制備短乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的原生質(zhì)體，并融合。利用短乳桿菌可利用木糖，但不能耐受45°C高溫的特性，及鼠李糖乳桿菌不能利用木糖，但是能夠耐受 45 55°C高溫的特點。以木糖和45 55°C高溫做為融合子再生的選擇壓力，獲得能夠在45°C利用木糖產(chǎn)乳酸的融合子。搖瓶發(fā)酵表明，采用該法獲得的融合子，可在45°C發(fā)酵 40g/l的木糖，生成20. 96g/l的乳酸，副產(chǎn)物乙酸的量為7. 26g/l.具體而言，本發(fā)明提供了一種可利用木糖發(fā)酵乳酸且耐高溫的融合乳酸菌的育種方法，其中，包括以下步驟步驟一、將可利用木糖發(fā)酵生成乳酸的乳酸菌進行原生質(zhì)體的制備，以及將可以耐受高溫的乳酸菌進行原生質(zhì)體的制備；步驟二、將上述步驟一中獲得的可利用木糖發(fā)酵生成乳酸的乳酸菌的原生質(zhì)體和可以耐受高溫的乳酸菌的原生質(zhì)體進行融合；步驟三、將上述步驟二中獲得的原生質(zhì)體融合液混入再生培養(yǎng)基，進行再生，最終獲得可利用木糖發(fā)酵乳酸且耐高溫的融合乳酸菌。優(yōu)選的是，所述的可利用木糖發(fā)酵乳酸且耐高溫的融合乳酸菌的育種方法中，所述可利用木糖發(fā)酵生成乳酸的乳酸菌為植物乳桿菌，戊糖乳桿菌，和/或短乳桿菌。優(yōu)選的是，所述的可利用木糖發(fā)酵乳酸且耐高溫的融合乳酸菌的育種方法中，所述耐受高溫的乳酸菌為德氏乳桿菌、保加利亞乳桿菌和/或鼠李糖乳桿菌。優(yōu)選的是，所述的可利用木糖發(fā)酵乳酸且耐高溫的融合乳酸菌的育種方法中，利用木糖發(fā)酵生成乳酸的乳酸菌可利用木糖，但不耐受高溫的特性，作為其遺傳標記，利用可以耐受高溫的乳酸菌可耐受高溫，但不能利用木糖的特性，作為其遺傳標記，以木糖的可利用性與耐受高溫性作為融合乳酸菌的篩選壓力，篩選融合乳酸菌。優(yōu)選的是，所述的可利用木糖發(fā)酵乳酸且耐高溫的融合乳酸菌的育種方法中，可以耐受高溫的乳酸菌能夠耐受45 55°C的高溫。優(yōu)選的是，所述的可利用木糖發(fā)酵乳酸且耐高溫的融合乳酸菌的育種方法中，在所述步驟一中，將可利用木糖發(fā)酵生成乳酸的乳酸菌進行原生質(zhì)體的制備的方法包括將可利用木糖發(fā)酵生成乳酸的乳酸菌通過培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，在光密度OD達到0. 6時，收集培養(yǎng)物，再用Tris-LBP緩沖液重懸，使菌體量達到109，加入3 8mg/ml溶菌酶，15 25U/ml 變?nèi)芫兀?5 39°C的條件下，酶解30 60分鐘，直到原生質(zhì)體形成率達到90%時，收集菌體，其中，Tris-LBP緩沖液包括Tris 10mM、CaC1220mM和蔗糖0. 5M，其中pH 6. 3。優(yōu)選的是，所述的可利用木糖發(fā)酵乳酸且耐高溫的融合乳酸菌的育種方法中，在所述步驟一中，將可以耐受高溫的乳酸菌進行原生質(zhì)體的制備的方法包括將可以耐受高溫的乳酸菌通過培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，在光密度OD達到0. 6時，收集培養(yǎng)物，使菌體量達到109， 再用HEPE-LBP緩沖液重懸，加入15 25mg/ml溶菌酶，180 220U/ml變?nèi)芫?，?5 390C的條件下，酶解60 120分鐘，直到原生質(zhì)體形成率達到90 %時，收集菌體，其中， HEPE-LBP 緩沖液包括HEPE10mM、MgC1220mM 和蔗糖 0. 5M，其中 pH 7. 3。優(yōu)選的是，所述的可利用木糖發(fā)酵乳酸且耐高溫的融合乳酸菌的育種方法中，在所述步驟二中，將可利用木糖發(fā)酵生成乳酸的乳酸菌的原生質(zhì)體和可以耐受高溫的乳酸菌的原生質(zhì)體進行融合的方法包括將兩種原生質(zhì)體混勻，加入900 μ 1的促融劑振蕩混勻， 所述促融劑為50%的PEG緩沖溶液。優(yōu)選的是，所述的可利用木糖發(fā)酵乳酸且耐高溫的融合乳酸菌的育種方法中，可利用木糖發(fā)酵生成乳酸的乳酸菌的培養(yǎng)基為木糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、檸檬酸銨2g/l、磷酸氫二鉀2g/l、無水乙酸鈉3g/l、硫酸鎂 0. 5g/l、硫酸錳0. 02g/ ；和/或可以耐受高溫的乳酸菌的培養(yǎng)基為葡萄糖20g/l、蔗糖 171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、檸檬酸銨2g/l、磷酸氫二鉀2g/l、無水乙酸鈉3g/l、硫酸鎂0. 5g/l、硫酸錳0. 02g八本發(fā)明還提供了一種根據(jù)權(quán)利要求1 9中任一項方法育種的融合乳酸菌，其中， 所述融合乳酸菌可利用木糖發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，同時可耐受42 50°C的高溫。本發(fā)明利用融合雙親的特性作為篩選標記，不需要通過誘變的方式對雙親進行遺傳標記，避免誘變過程中對雙親有利基因的破壞，保留了對產(chǎn)物有利的基因，并使之提高，是一種簡便而高效的乳酸菌育種方式。


圖1示出了短乳桿菌的原生質(zhì)體形態(tài)；圖2示出了鼠李糖乳桿菌的原生質(zhì)體形態(tài)；圖3示出了鼠李糖乳桿菌與短乳桿菌原生質(zhì)體融合的鏡檢圖片； 圖4示出了鼠李糖乳桿菌與短乳桿菌原生質(zhì)體融合的又一鏡檢圖片；
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明作進一步描述。如無特殊說明均為常規(guī)方法。所述材料和試劑如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。實例一，短乳桿菌原生質(zhì)體的制備，具體請見圖1。1.挑取短乳桿菌(保存于中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心，保藏號為 CGMCC3051，公眾可據(jù)此到中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心任意購買)。單菌落至修飾的MRSX培養(yǎng)基，37 °C靜置過夜培養(yǎng)。2.吸取適量的過夜培養(yǎng)物至新鮮的培養(yǎng)液PMRSX，使其OD達到0.2，37°C靜置培養(yǎng) 3 4h，至OD達到0. 6。3.收集培養(yǎng)物，Tris-LBP緩沖液洗滌3次。4. Tris-LBP緩沖液緩沖液重懸，使菌體量達到109，加入5mg/ml溶菌酶，20U/ml變?nèi)芫兀?7°C，酶解30 60min。鏡檢反應(yīng)體系，待原生質(zhì)體形成率達到90%時(見圖1)， 3500rpm, 15min，收集菌體，HEPE-LBP緩沖液洗滌一次，終止酶反應(yīng)。50uL HEPE-LBP緩沖液
重懸，備用。試驗中所涉及的培養(yǎng)基和試劑組成如下。MRSX 木糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、檸檬酸銨2g/l、磷酸氫二鉀2g/l、無水乙酸鈉3g/l、硫酸鎂0. 5g/l、硫酸錳0. 02g八PMRSX 木糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、 檸檬酸銨2g/l、磷酸氫二鉀2g/l、無水乙酸鈉3g/l、硫酸鎂0. 5g/l、硫酸錳0. 02g/、甘氨酸
1· 2 % οTris-LBP =Tris IOmM, CaCl220mM、蔗糖 0. 5M, pH 6. 3HEPE-LBP HEPE 10mM、MgCl220mM、蔗糖 0. 5M，pH 7. 3實例二，植物乳桿菌原生質(zhì)體的制備1.挑取植物乳桿菌(保存于中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC 1.556，公眾可據(jù)此到中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心任意購買)落至修飾的MRSX培養(yǎng)基，37 °C靜置過夜培養(yǎng)。2.吸取適量的過夜培養(yǎng)物至新鮮的培養(yǎng)液PMRSX，使其OD達到0.2，37°C靜置培養(yǎng) 3 4h，至OD達到0. 6。3.收集培養(yǎng)物，Tris-LBP緩沖液洗滌3次。4. Tris-LBP緩沖液緩沖液重懸，使菌體量達到109，加入8mg/ml溶菌酶，25U/ml變?nèi)芫兀?9°C，酶解30 60min。鏡檢反應(yīng)體系，待原生質(zhì)體形成率達到90%時(見圖1)， 3500rpm, 15min，收集菌體，HEPE-LBP緩沖液洗滌一次，終止酶反應(yīng)。50uL HEPE-LBP緩沖液重懸，備用。試驗中所涉及的培養(yǎng)基和試劑組成如下。MRSX 木糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、檸檬酸銨2g/l、磷酸氫二鉀2g/l、無水乙酸鈉3g/l、硫酸鎂0. 5g/l、硫酸錳0. 02g八PMRSX 木糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、 檸檬酸銨2g/l、磷酸氫二鉀2g/l、無水乙酸鈉3g/l、硫酸鎂0. 5g/l、硫酸錳0. 02g/、甘氨酸
1· 2 % οTris-LBP =Tris IOmM, CaCl220mM、蔗糖 0. 5M, pH 6. 3HEPE-LBP HEPE 10mM、MgC1220mM、蔗糖 0. 5M，pH 7. 3實例三，戊糖乳桿菌原生質(zhì)體的制備1.挑取植物乳桿菌落至修飾的MRSX培養(yǎng)基，37 °C靜置過夜培養(yǎng)。2.吸取適量的過夜培養(yǎng)物至新鮮的培養(yǎng)液PMRSX，使其OD達到0.2，37°C靜置培養(yǎng) 3 4h，至OD達到0. 6。3.收集培養(yǎng)物，Tris-LBP緩沖液洗滌3次。4. Tris-LBP緩沖液緩沖液重懸，使菌體量達到109，加入;3mg/ml溶菌酶，15U/ml變?nèi)芫兀?5°C，酶解30 60min。鏡檢反應(yīng)體系，待原生質(zhì)體形成率達到90%時(見圖1)， 3500rpm, 15min，收集菌體，HEPE-LBP緩沖液洗滌一次，終止酶反應(yīng)。50uL HEPE-LBP緩沖液
重懸，備用。試驗中所涉及的培養(yǎng)基和試劑組成如下。MRSX:木糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、檸檬酸銨2g/l、磷酸氫二鉀2g/l、無水乙酸鈉3g/l、硫酸鎂0. 5g/l、硫酸錳0. 02g八PMRSX 木糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、 檸檬酸銨2g/l、磷酸氫二鉀2g/l、無水乙酸鈉3g/l、硫酸鎂0. 5g/l、硫酸錳0. 02g/、甘氨酸
1· 2 % οTris-LBP =Tris IOmM, CaC1220mM、蔗糖 0. 5M, pH 6. 3HEPE-LBP HEPE 10mM、MgC1220mM、蔗糖 0. 5M，pH 7. 3實例四，鼠李糖乳桿菌原生質(zhì)體的制備，具體請見圖2。1.挑取鼠李糖乳桿菌(保存于中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC1. 2134，公眾可據(jù)此到中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心任意購買) 單菌落至MRSG培養(yǎng)基，45度靜置過夜培養(yǎng)。2.吸取適量的過夜培養(yǎng)物至新鮮的PMRSG培養(yǎng)液，使其OD達到0. 2，45度靜置培養(yǎng)3 4h，使其OD達到0.6。3.收集培養(yǎng)物，使其菌體量達到109，HEPE-LBP緩沖液洗滌3次。4. HEPE-LBP緩沖液緩沖液重懸，加入20mg/ml溶菌酶，200U/ml變?nèi)芫兀?7°C，酶解60 120min。鏡檢反應(yīng)體系，待原生質(zhì)體形成率達到90%時(見圖2)，3500rpm，15min， 收集菌體，HEPE-LBP緩沖液洗滌一次，終止酶反應(yīng)。50uL HEPE-LBP緩沖液重懸，備用。MRSX 葡萄糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、 檸檬酸銨2g/l、磷酸氫二鉀2g/l、無水乙酸鈉3g/l、硫酸鎂0. 5g/l、硫酸錳0. 02g八PMRSX :葡萄糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、檸檬酸銨2g/l、磷酸氫二鉀2g/l、無水乙酸鈉3g/l、硫酸鎂0. 5g/l、硫酸錳0. 02g/、甘氨酸
1· 2 % ο實例五，德氏乳桿菌原生質(zhì)體的制備1.挑取德氏乳桿菌(保存于中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC1.沈?qū)?，公眾可?jù)此到中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心任意購買)單菌落至MRSG培養(yǎng)基，45度靜置過夜培養(yǎng)。2.吸取適量的過夜培養(yǎng)物至新鮮的PMRSG培養(yǎng)液，使其OD達到0. 2，45度靜置培養(yǎng)3 4h，使其OD達到0.6。3.收集培養(yǎng)物，使其菌體量達到109，HEPE-LBP緩沖液洗滌3次。4. HEPE-LBP緩沖液緩沖液重懸，加入15mg/ml溶菌酶，180U/ml變?nèi)芫兀?5°C，酶解60 120min。鏡檢反應(yīng)體系，待原生質(zhì)體形成率達到90%時(見圖2)，3500rpm，15min， 收集菌體，HEPE-LBP緩沖液洗滌一次，終止酶反應(yīng)。50uL HEPE-LBP緩沖液重懸，備用。MRSX 葡萄糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、 檸檬酸銨2g/l、磷酸氫二鉀2g/l、無水乙酸鈉3g/l、硫酸鎂0. 5g/l、硫酸錳0. 02g八PMRSX :葡萄糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、 檸檬酸銨2g/l、磷酸氫二鉀2g/l、無水乙酸鈉3g/l、硫酸鎂0. 5g/l、硫酸錳0. 02g/、甘氨酸
1· 2 % ο實例六，保加利亞乳桿菌原生質(zhì)體的制備1.挑取保加利亞乳桿菌(保存于中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心， 保藏號為CGMCC1. 2161，公眾可據(jù)此到中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心任意購買)單菌落至MRSG培養(yǎng)基，45度靜置過夜培養(yǎng)。2.吸取適量的過夜培養(yǎng)物至新鮮的PMRSG培養(yǎng)液，使其OD達到0. 2，45度靜置培養(yǎng)3 4h，使其OD達到0.6。3.收集培養(yǎng)物，使其菌體量達到109，HEPE-LBP緩沖液洗滌3次。4. HEPE-LBP緩沖液緩沖液重懸，加入25mg/ml溶菌酶，220U/ml變?nèi)芫兀?9°C，酶解60 120min。鏡檢反應(yīng)體系，待原生質(zhì)體形成率達到90%時(見圖2)，3500rpm，15min， 收集菌體，HEPE-LBP緩沖液洗滌一次，終止酶反應(yīng)。50uL HEPE-LBP緩沖液重懸，備用。MRSX 葡萄糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、 檸檬酸銨2g/l、磷酸氫二鉀2g/l、無水乙酸鈉3g/l、硫酸鎂0. 5g/l、硫酸錳0. 02g八PMRSX:葡萄糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/ 1、檸檬酸銨2g/l、磷酸氫二鉀2g/l、無水乙酸鈉3g/l、硫酸鎂0. 5g/l、硫酸錳0. 02g/、甘氨酸 1. 2%。實例七，短乳桿菌與鼠李糖乳桿菌原生質(zhì)體的融合及再生，具體請見圖3、圖4。1.將上述制備的原生質(zhì)體混勻，加入900 μ 1的促融劑(50% PEG緩沖溶液)，混勻。37°C，輕輕震蕩6min，使二者融合(見圖3)。2.添加9ml的HEPE-LBP緩沖溶液至上述反應(yīng)體系，3500rpm，20min,收集菌體， HEPE-LBP緩沖液洗滌一次。適量HEPE-LBP緩沖液重懸菌體。3.將上述融合產(chǎn)物與RM培養(yǎng)基混勻，傾倒平板，45°C培養(yǎng)3 7天。4.挑取單菌落至MRSX平板，45°C傳代培養(yǎng)，獲得遺傳性狀穩(wěn)定的融合子(見圖4)。試驗中所涉及的培養(yǎng)基和試劑組成如下。促融劑50 % PEG于HEPE-LPB緩沖液a.鼠李糖乳桿菌，培養(yǎng)條件MRSG，45 ；b鼠李糖乳桿菌，培養(yǎng)條件MRSX，45 ；c.短乳桿菌，培養(yǎng)條件MRSX，37 ；d短乳桿菌，培養(yǎng)條件MRSX，45 ；e.融合子F1-2，培養(yǎng)條件MRSX實例八，融合子45°C發(fā)酵結(jié)果挑取45°C木糖平板上生長良好的融合子單菌落，接入木糖含量為40g/l的MRSX液體培養(yǎng)基，45°C/37°C，150rpm震蕩培養(yǎng)32 48h。HPLC分析發(fā)酵液成分。以上發(fā)酵試驗， 每個樣品做兩個平行。融合子在37和45°C利用木糖發(fā)酵的結(jié)果如表1所示。表1.部分融合子利用葡萄糖和木糖在37°C和45°C的發(fā)酵結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種可利用木糖發(fā)酵乳酸且耐高溫的融合乳酸菌的育種方法，其中，包括以下步驟步驟一、將可利用木糖發(fā)酵生成乳酸的乳酸菌進行原生質(zhì)體的制備，以及將可以耐受高溫的乳酸菌進行原生質(zhì)體的制備；步驟二、將上述步驟一中獲得的可利用木糖發(fā)酵生成乳酸的乳酸菌的原生質(zhì)體和可以耐受高溫的乳酸菌的原生質(zhì)體進行融合；步驟三、將上述步驟二中獲得的原生質(zhì)體融合液混入再生培養(yǎng)基，進行再生，最終獲得可利用木糖發(fā)酵乳酸且耐高溫的融合乳酸菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可利用木糖發(fā)酵乳酸且耐高溫的融合乳酸菌的育種方法，其中，所述可利用木糖發(fā)酵生成乳酸的乳酸菌為植物乳桿菌，戊糖乳桿菌，和/或短乳桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可利用木糖發(fā)酵乳酸且耐高溫的融合乳酸菌的育種方法，其中，所述耐受高溫的乳酸菌為德氏乳桿菌、保加利亞乳桿菌和/或鼠李糖乳桿菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可利用木糖發(fā)酵乳酸且耐高溫的融合乳酸菌的育種方法，其中，利用木糖發(fā)酵生成乳酸的乳酸菌可利用木糖，但不耐受高溫的特性，作為其遺傳標記， 利用可以耐受高溫的乳酸菌可耐受高溫，但不能利用木糖的特性，作為其遺傳標記，以木糖的可利用性與耐受高溫性作為融合乳酸菌的篩選壓力，篩選融合乳酸菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可利用木糖發(fā)酵乳酸且耐高溫的融合乳酸菌的育種方法，其中，可以耐受高溫的乳酸菌能夠耐受45 55°C的高溫。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可利用木糖發(fā)酵乳酸且耐高溫的融合乳酸菌的育種方法，其中，在所述步驟一中，將可利用木糖發(fā)酵生成乳酸的乳酸菌進行原生質(zhì)體的制備的方法包括將可利用木糖發(fā)酵生成乳酸的乳酸菌通過培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，在光密度OD達到0. 6時， 收集培養(yǎng)物，再用Tris-LBP緩沖液重懸，使菌體量達到109，加入3 8mg/ml溶菌酶，15 25U/ml變?nèi)芫?，?5 39°C的條件下，酶解30 60分鐘，直到原生質(zhì)體形成率達到 90%時，收集菌體，其中，Tris-LBP緩沖液包括Tris 10mM、CaCl220mM和蔗糖0. 5M，其中pH 6. 3。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可利用木糖發(fā)酵乳酸且耐高溫的融合乳酸菌的育種方法，其中，在所述步驟一中，將可以耐受高溫的乳酸菌進行原生質(zhì)體的制備的方法包括將可以耐受高溫的乳酸菌通過培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，在光密度OD達到0. 6時，收集培養(yǎng)物，使菌體量達到 IO9,再用HEPE-LBP緩沖液重懸，加入15 25mg/ml溶菌酶，180 220U/ml變?nèi)芫兀?35 39°C的條件下，酶解60 120分鐘，直到原生質(zhì)體形成率達到90 %時，收集菌體，其中，HEPE-LBP 緩沖液包括:HEPE 10mM、MgCl220mM 和蔗糖 0. 5M，其中 pH 7. 3。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可利用木糖發(fā)酵乳酸且耐高溫的融合乳酸菌的育種方法，其中，在所述步驟二中，將可利用木糖發(fā)酵生成乳酸的乳酸菌的原生質(zhì)體和可以耐受高溫的乳酸菌的原生質(zhì)體進行融合的方法包括將兩種原生質(zhì)體混勻，加入900μ 1的促融劑振蕩混勻，所述促融劑為50%的PEG緩沖溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的可利用木糖發(fā)酵乳酸且耐高溫的融合乳酸菌的育種方法，其中，可利用木糖發(fā)酵生成乳酸的乳酸菌的培養(yǎng)基為木糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨 10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、檸檬酸銨2g/l、磷酸氫二鉀2g/l、無水乙酸鈉3g/l、 硫酸鎂0. 5g/l、硫酸錳0. 02g/l ；和/或可以耐受高溫的乳酸菌的培養(yǎng)基為葡萄糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、檸檬酸銨2g/l、磷酸氫二鉀2g/ 1、無水乙酸鈉3g/l、硫酸鎂0. 5g/l、硫酸錳0. 02g/l。
10. 一種根據(jù)權(quán)利要求1 9中任一項方法育種的融合乳酸菌，其中，所述融合乳酸菌可利用木糖發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，同時可耐受42 50°C的高溫。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種針對可利用木糖的乳酸菌的育種方法。該方法根據(jù)可代謝木糖的嗜溫乳桿菌能夠利用木糖但不耐受高溫的特性，以其利用木糖的特性作為一種遺傳標記。選用一種可耐高溫但不能利用木糖的乳桿菌，以其耐受高溫的特性，作為該菌的遺傳標記。在合適的條件下，制備兩親本的原生質(zhì)體，并進行融合。以高溫和木糖作為篩選壓力，使兩親本的融合子在合適的條件下再生，最終獲得即可利用木糖又可耐受一定高溫的融合子。利用該方法獲得的融合子，可在45℃溫度下，分別利用40g/l的葡萄糖和木糖，乳酸的產(chǎn)量達到25.14g/l和20.96g/l。
文檔編號C12R1/225GK102433321SQ201110242299
公開日2012年5月2日 申請日期2011年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月23日
發(fā)明者郭蔚, 陳樹林, 馬延和 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所, 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所