專利名稱：培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)用試劑盒及細(xì)胞培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)用試劑盒及細(xì)胞培養(yǎng)方法，特別是用于上皮細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)用試劑盒及細(xì)胞培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
人體重要器官如肺、腎、肝、胰腺和皮膚都由器官特異性分化的上皮細(xì)胞為其組成成分。這些特異性分化的上皮細(xì)胞與不同器官的特異性功能直接相關(guān)，如肺的氣體交換功能、腎的過(guò)濾功能、肝的解毒及中和功能、胰腺細(xì)胞產(chǎn)生胰島素、皮膚具有保護(hù)機(jī)體免受外界環(huán)境的傷害。而這些重要器官一旦發(fā)生病變或退化就會(huì)威脅人類的健康，因?yàn)檫@些重要器官是很難被替換的，不同器官的特異性細(xì)胞也不能相互取代其它器官的細(xì)胞。 特異性分化的細(xì)胞，如腎上皮細(xì)胞、胰腺的胰島素產(chǎn)生細(xì)胞、真皮的毛囊和腺體細(xì)胞都是很難再生的，更不要說(shuō)在體外進(jìn)行培養(yǎng)增殖了。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(包括各種轉(zhuǎn)基因和克隆動(dòng)物)是用于疾病發(fā)病機(jī)理研究和新藥研發(fā)的必要工具。但是，對(duì)于分離自人和哺乳動(dòng)物的原代上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)仍然是很困難的。應(yīng)用目前的無(wú)血清培養(yǎng)基，有的只能進(jìn)行短期的原代培養(yǎng)(存活數(shù)天，如肺和胰腺等上皮細(xì)胞)，有的只能進(jìn)行有限的傳代培養(yǎng)(1-3代，如氣管/支氣管及前列腺等上皮細(xì)胞)，有的甚至根本不能體外培養(yǎng)(如肝和結(jié)腸等上皮細(xì)胞)，只有來(lái)自于人體皮膚的角化上皮細(xì)胞可以傳代培養(yǎng)10代左右。而且從每個(gè)動(dòng)物或活體組織樣品中獲得的上皮細(xì)胞產(chǎn)量仍然很低，包括細(xì)胞的數(shù)量、直接分離或短期培養(yǎng)的細(xì)胞純度都是很低的，這些原代和傳代上皮細(xì)胞的增殖速度也極為有限。為了在體外進(jìn)行上皮細(xì)胞的培養(yǎng)，目前國(guó)外嘗試通過(guò)遺傳操作，如轉(zhuǎn)入病毒(SV40T或HPV16E6E7)或細(xì)胞癌基因，可以延長(zhǎng)體外細(xì)胞存活的代數(shù)。然而遺傳操作的最大缺點(diǎn)是會(huì)改變這些細(xì)胞的遺傳背景和表型，以致讓這些正常上皮細(xì)胞丟失其正常生理功能，如p53和pRB信號(hào)通路常常被抑制。而且，這些經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞是不可能重新再移植進(jìn)機(jī)體的。但是由于目前缺乏有效的體外培養(yǎng)上皮細(xì)胞的技術(shù)，上述這些細(xì)胞在當(dāng)今世界的醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)研究中仍然備受青睞。在非癌癥研究領(lǐng)域，它們就代表著最初來(lái)源的“功能”性的組織或器官。在癌癥研究領(lǐng)域，它們還常常被用來(lái)作為“正常細(xì)胞”對(duì)照。而且它們的市場(chǎng)價(jià)格還非常昂貴?？鼓[瘤藥物研究的第一步就是藥物對(duì)癌細(xì)胞的特異性毒性實(shí)驗(yàn)，目前所用的癌細(xì)胞株(如HeLa和A539等)多在體外傳代數(shù)年甚至數(shù)十年，它們?cè)诤艽蟪潭壬弦巡荒芊磻?yīng)同類型人體惡性腫瘤的特性，一些實(shí)驗(yàn)室還存在大量癌細(xì)胞株的交叉污染。而且對(duì)于不同的個(gè)體，即使同一類型的腫瘤也可能由不同的原因或機(jī)制所導(dǎo)致，因此對(duì)于每一種腫瘤，都需要有能代表其特定發(fā)病機(jī)制的細(xì)胞株來(lái)進(jìn)行新藥研發(fā)。更為突出的例子，如前列腺癌的研究領(lǐng)域根本沒(méi)有人類原發(fā)前列腺癌的細(xì)胞系，僅有的細(xì)胞系(LnCAP，PC-3，DU-145)都是來(lái)自轉(zhuǎn)移后的腫瘤組織。盡管如此，全世界90%以上的腫瘤研究和幾乎所有抗癌新藥的研究還在繼續(xù)使用著可能根本沒(méi)有代表性的癌細(xì)胞株。因此，目前癌癥研究和新藥研發(fā)要解決的關(guān)鍵問(wèn)題是，如何能獲得反應(yīng)各種類型人體腫瘤特性、同種腫瘤代表不同個(gè)體特性或不同發(fā)病機(jī)制的癌細(xì)胞。當(dāng)然，歸根結(jié)底的真正難題是缺乏有效的上皮細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)技術(shù)。另外，抗腫瘤藥物存在的很多毒副作用，很大程度上是因?yàn)樾滤幯芯咳狈φ５募?xì)胞對(duì)照。若能得到來(lái)自于同一個(gè)體同一組織的癌細(xì)胞和正常細(xì)胞(美國(guó)Asterand公司用上述HPVE6E7轉(zhuǎn)化得到的所謂的“正?！焙桶┑那傲邢偌?xì)胞，價(jià)格雖然高達(dá)1，2000美金/對(duì)，但還是十分搶手)，新藥研發(fā)的第一步將會(huì)回歸科學(xué)，抗癌新藥研究的歷史必將重寫。再生醫(yī)學(xué)是現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)的一種嶄新的治療模式，即以再生、再造、代替和新生為基本治療原理的現(xiàn)代干細(xì)胞移植治療術(shù)，利用干細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞)具有向各種細(xì)胞分化轉(zhuǎn)變能力，治療臨床上眾多的、目前尚無(wú)治療辦法的變性、壞死性和損傷性疾病，具有顯著和獨(dú)特的醫(yī)療效果。然而目前面臨的困境是，雖然胚胎干細(xì)胞具有分化能力， 再生性和可塑性強(qiáng)，但可能致瘤和面臨倫理爭(zhēng)議，如何誘導(dǎo)其定向分化和增加移植的成活率仍然是未解的難題；而成體干細(xì)胞來(lái)源稀少，難以識(shí)別、分離及純化，因此阻礙了其臨床應(yīng)用；目前新興的研究熱點(diǎn)——誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，由于其涉及遺傳操作導(dǎo)致細(xì)胞遺傳背景的改變，且導(dǎo)入的外源基因和病毒基因有致癌或致畸的潛能而不能用于臨床治療。個(gè)體化醫(yī)學(xué)是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)今后的發(fā)展方向。根據(jù)臨床病人的疾病發(fā)生/發(fā)展有關(guān)的遺傳背景及相關(guān)因素，在最短時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確地對(duì)疾病進(jìn)行診斷、監(jiān)測(cè)，制定真正的個(gè)體化治療方案是解決問(wèn)題的關(guān)鍵。例如，世界衛(wèi)生組織調(diào)查發(fā)現(xiàn)藥物安全性問(wèn)題是住院病人致死最重要的原因之一。藥物反應(yīng)個(gè)體差異所致不良反應(yīng)已成為危害人類健康的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題。而遺傳因素是造成藥物反應(yīng)個(gè)體差異的主要原因。在美國(guó)，已經(jīng)有70余種藥物經(jīng)FDA批準(zhǔn)貼上了遺傳標(biāo)簽，用于指示不同基因型的臨床患者在應(yīng)用藥物時(shí)對(duì)療效和毒性的預(yù)測(cè)作用，而遺傳背景清晰的新藥研發(fā)必將成為未來(lái)發(fā)展的趨勢(shì)。如何利用極其微量的活檢組織(如針吸細(xì)胞等)對(duì)惡性腫瘤等疾病進(jìn)行早期快速診斷、體外藥敏實(shí)驗(yàn)、療效監(jiān)測(cè)是對(duì)腫瘤患者個(gè)體化治療的關(guān)鍵。所有這些都將依賴于快速、有效的原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)才能真正實(shí)現(xiàn)。生物銀行(時(shí)代周刊稱之為改變世界的十大觀念之一)正在全世界范圍興起。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的研究人員正努力創(chuàng)建全美首個(gè)保存人類生物組織樣本、腫瘤細(xì)胞、DNA，以及血液的全國(guó)性生物銀行。英、加、挪威和瑞典已設(shè)立了這類全國(guó)性的機(jī)構(gòu)。搜集和儲(chǔ)藏足夠多的，從癌癥、大腦紊亂到新陳代謝疾病的生物組織樣本，為建立個(gè)體化醫(yī)學(xué)和新藥研發(fā)奠定基礎(chǔ)，讓篩選和治療患者更有針對(duì)性。但是目前生物銀行所儲(chǔ)存的只是包括冰凍組織、固定的組織、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、血液、血漿、血清和尿液等，這些極其寶貴的資源用之即去，無(wú)法再生。有效的原代和傳代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)必將為生物銀行注入真正的“活”力。這種具有“再生”能力的生物銀行的出現(xiàn)將對(duì)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究、個(gè)體化診斷和治療、新藥研發(fā)具有里程碑意義。綜上所述，目前急需解決的問(wèn)題是，如何快速、有效地進(jìn)行組織器官來(lái)源的原代上皮細(xì)胞的增殖以及這些上皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)，并且能有效地延長(zhǎng)上皮細(xì)胞的培養(yǎng)代數(shù)，同時(shí)又不能改變細(xì)胞的遺傳背景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人針對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行了深入研究，提出了新的培養(yǎng)基和試劑盒，通過(guò)使用該培養(yǎng)基或試劑盒體外增殖原代上皮細(xì)胞和傳代培養(yǎng)上皮細(xì)胞，能夠在不改變細(xì)胞遺傳背景的情況下，有效地延長(zhǎng)上皮細(xì)胞的培養(yǎng)代數(shù)。S卩，本發(fā)明提供下述培養(yǎng)基(也稱作本發(fā)明的培養(yǎng)基)I. 一種培養(yǎng)基,其包含血清，鈣成分，和ROCK 抑制劑。 2.根據(jù)項(xiàng)I所述的培養(yǎng)基，其中，所述血清的含量是I. 0 35v/v%。3.根據(jù)項(xiàng)I所述的培養(yǎng)基，其中，所述ROCK抑制劑是選自法舒地爾、H-1152、Y-27632、HA1100、HA1077 和 GSK429286 中的一種或兩種以上。4.根據(jù)項(xiàng)I所述的培養(yǎng)基，其用于培養(yǎng)上皮細(xì)胞。5.根據(jù)項(xiàng)4所述的培養(yǎng)基，其中，所述上皮細(xì)胞是非角質(zhì)上皮細(xì)胞。6.根據(jù)項(xiàng)4所述的培養(yǎng)基，其中，所述上皮細(xì)胞是原代細(xì)胞。7.根據(jù)項(xiàng)4所述的培養(yǎng)基，其中，所述上皮細(xì)胞是傳代細(xì)胞。8.根據(jù)項(xiàng)4所述的培養(yǎng)基，其中，所述上皮細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。9.根據(jù)項(xiàng)5所述的培養(yǎng)基，其中，所述非角質(zhì)上皮細(xì)胞是鱗狀上皮細(xì)胞、柱狀上皮細(xì)胞、腺體上皮細(xì)胞或過(guò)渡類型上皮細(xì)胞。10.根據(jù)項(xiàng)5所述的培養(yǎng)基，其中，所述非角質(zhì)上皮細(xì)胞是口腔的、鼻粘膜的，氣管的、支氣管的、肺上皮的、食管上皮的，胃粘膜上皮的、大腸上皮的、小腸上皮的、肝細(xì)胞的、膽管上皮的，膽囊的，胰腺的、胰島P細(xì)胞，腎的、膀胱的、尿道上皮的、睪丸上皮的、卵巢上皮的、甲狀腺的、甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞、腎上腺的、胸腺的、前列腺的、乳腺的、扁桃腺的，垂體的細(xì)胞，角膜上皮細(xì)胞，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。11.根據(jù)項(xiàng)I所述的培養(yǎng)基，其中，所述鈣成分的含量以鈣離子計(jì)為0. I y M 30mMo12.根據(jù)項(xiàng)I所述的培養(yǎng)基，其中，該培養(yǎng)基還包含飼養(yǎng)細(xì)胞。13.根據(jù)項(xiàng)I所述的培養(yǎng)基，其中，該培養(yǎng)基中包含條件培養(yǎng)基。此外，本發(fā)明還提供下述試劑盒(也稱作本發(fā)明的試劑盒)14. 一種試劑盒，其包含培養(yǎng)基、血清和ROCK抑制劑。15.根據(jù)項(xiàng)14所述的試劑盒，該試劑盒用于培養(yǎng)上皮細(xì)胞。16.根據(jù)項(xiàng)15所述的試劑盒，其中，所述上皮細(xì)胞是非角質(zhì)上皮細(xì)胞。17.根據(jù)項(xiàng)15所述的試劑盒，其中，所述上皮細(xì)胞是原代細(xì)胞。18.根據(jù)項(xiàng)15所述的試劑盒，其中，所述上皮細(xì)胞是傳代細(xì)胞。19.根據(jù)項(xiàng)15所述的試劑盒,其中,所述上皮細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。20.根據(jù)項(xiàng)16所述的試劑盒，其中，所述非角質(zhì)上皮細(xì)胞是鱗狀上皮細(xì)胞、柱狀上皮細(xì)胞、腺體上皮細(xì)胞或過(guò)渡類型上皮細(xì)胞。21.根據(jù)項(xiàng)16所述的試劑盒，其中，所述非角質(zhì)上皮細(xì)胞是口腔的、鼻粘膜的，氣管的、支氣管的、肺上皮的、食管上皮的，胃粘膜上皮的、大腸上皮的、小腸上皮的、肝細(xì)胞的、膽管上皮的，膽囊的，胰腺的、胰島0細(xì)胞，腎的、膀胱的、尿道上皮的、睪丸上皮的、卵巢上皮的、甲狀腺的、甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞、腎上腺的、胸腺的、前列腺的、乳腺的、扁桃腺的，垂體的細(xì)胞，角膜上皮細(xì)胞，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。22.根據(jù)項(xiàng)14所述的試劑盒，其還包含鈣成分。23.根據(jù)項(xiàng)14所述的試劑盒，其還包含飼養(yǎng)細(xì)胞。24.根據(jù)項(xiàng)23所述的試劑盒，其中，所述飼養(yǎng)細(xì)胞是低溫凍存的。25.根據(jù)項(xiàng)23所述的試劑盒，其中，所述飼養(yǎng)細(xì)胞是低溫儲(chǔ)存的。26.根據(jù)項(xiàng)14所述的試劑盒，其中，其還包含用于在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)單獨(dú)盛放所述飼養(yǎng)細(xì)胞的容器，該容器具有可通透性膜結(jié)構(gòu)。
27.根據(jù)項(xiàng)23所述的試劑盒，其中，所述飼養(yǎng)細(xì)胞是小鼠或人的成纖維細(xì)胞。28.根據(jù)項(xiàng)14所述的試劑盒，其中，所述培養(yǎng)基包含條件培養(yǎng)基。29.根據(jù)項(xiàng)14所述的試劑盒，其中，所述ROCK抑制劑是選自法舒地爾、H-1152、Y-27632、HA1100、HA1077 和 GSK429286 中的一種或兩種以上。30. 一種試劑盒，其包含項(xiàng)I 13中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基和飼養(yǎng)細(xì)胞。
31.根據(jù)項(xiàng)30所述的試劑盒，其中，所述飼養(yǎng)細(xì)胞是低溫凍存的。32.根據(jù)項(xiàng)30所述的試劑盒，其中，所述飼養(yǎng)細(xì)胞是低溫儲(chǔ)存的。33.根據(jù)項(xiàng)30所述的試劑盒，其中，其還包含用于在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)單獨(dú)盛放所述飼養(yǎng)細(xì)胞的容器，該容器具有可通透性膜結(jié)構(gòu)。此外，本發(fā)明還提供下述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法(也稱作本發(fā)明的培養(yǎng)方法)34. 一種培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，該方法包括步驟A :使用項(xiàng)I 13中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基將上皮細(xì)胞與飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)。35.根據(jù)項(xiàng)34所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，所述上皮細(xì)胞是原代細(xì)胞。36.根據(jù)項(xiàng)34所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，所述上皮細(xì)胞是傳代細(xì)胞。37.根據(jù)項(xiàng)34所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，所述上皮細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。38.根據(jù)項(xiàng)34所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，所述上皮細(xì)胞是非角質(zhì)上皮細(xì)胞。39.根據(jù)項(xiàng)38所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，所述非角質(zhì)上皮細(xì)胞是鱗狀上皮細(xì)胞、柱狀上皮細(xì)胞、腺體上皮細(xì)胞或過(guò)渡類型上皮細(xì)胞。40.根據(jù)項(xiàng)38所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，所述非角質(zhì)上皮細(xì)胞是口腔的、鼻粘膜的，氣管的、支氣管的、肺上皮的、食管上皮的，胃粘膜上皮的、大腸上皮的、小腸上皮的、肝細(xì)胞的、膽管上皮的，膽囊的，胰腺的、胰島P細(xì)胞，腎的、膀胱的、尿道上皮的、睪丸上皮的、卵巢上皮的、甲狀腺的、甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞、腎上腺的、胸腺的、前列腺的、乳腺的、扁桃腺的，垂體的細(xì)胞，角膜上皮細(xì)胞，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。41.根據(jù)項(xiàng)34所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，該培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法是上皮細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法。42.根據(jù)項(xiàng)34所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，該培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法是原代上皮細(xì)胞增殖培養(yǎng)方法。43.根據(jù)項(xiàng)34所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，將上皮細(xì)胞與飼養(yǎng)細(xì)胞置于同
一培養(yǎng)器皿中。
44.根據(jù)項(xiàng)34所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，將飼養(yǎng)細(xì)胞單獨(dú)置于具有可通透性膜結(jié)構(gòu)的容器中。45.根據(jù)項(xiàng)34所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，所述飼養(yǎng)細(xì)胞是小鼠或人的成纖維細(xì)胞。46. 一種培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，該方法包括步驟B :使用項(xiàng)12或13所述的培養(yǎng)基培養(yǎng)上皮細(xì)胞。47.根據(jù)項(xiàng)46所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，所述上皮細(xì)胞是原代細(xì)胞。48.根據(jù)項(xiàng)46所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，所述上皮細(xì)胞是傳代細(xì)胞。 49.根據(jù)項(xiàng)46所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，所述上皮細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。50.根據(jù)項(xiàng)46所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，所述上皮細(xì)胞是非角質(zhì)上皮細(xì)胞。51.根據(jù)項(xiàng)50所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，所述非角質(zhì)上皮細(xì)胞是鱗狀上皮細(xì)胞、柱狀上皮細(xì)胞、腺體上皮細(xì)胞或過(guò)渡類型上皮細(xì)胞。52.根據(jù)項(xiàng)50所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，所述非角質(zhì)上皮細(xì)胞是口腔的、鼻粘膜的，氣管的、支氣管的、肺上皮的、食管上皮的，胃粘膜上皮的、大腸上皮的、小腸上皮的、肝細(xì)胞的、膽管上皮的，膽囊的，胰腺的、胰島P細(xì)胞，腎的、膀胱的、尿道上皮的、睪丸上皮的、卵巢上皮的、甲狀腺的、甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞、腎上腺的、胸腺的、前列腺的、乳腺的、扁桃腺的，垂體的細(xì)胞，角膜上皮細(xì)胞，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。53.根據(jù)項(xiàng)46所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，該培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法是上皮細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法。54.根據(jù)項(xiàng)46所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，該培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法是原代上皮細(xì)胞增殖培養(yǎng)方法。通過(guò)使用本發(fā)明的培養(yǎng)基或試劑盒培養(yǎng)上皮細(xì)胞，能夠在不改變細(xì)胞遺傳背景的情況下，有效增殖培養(yǎng)原代上皮細(xì)胞，并有效地延長(zhǎng)上皮細(xì)胞的培養(yǎng)代數(shù)。


圖I是本發(fā)明培養(yǎng)方法示意圖，其中，方案①、②、③是本發(fā)明的培養(yǎng)基與飼養(yǎng)細(xì)胞組合的三種培養(yǎng)系統(tǒng)。圖2是采用本發(fā)明的條件培養(yǎng)基進(jìn)行上皮細(xì)胞培養(yǎng)的工作流程圖。圖3是采用本發(fā)明的飼養(yǎng)細(xì)胞間接(Transwell)共培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行上皮細(xì)胞培養(yǎng)的工作流程圖。圖4是采用本發(fā)明的飼養(yǎng)細(xì)胞與上皮細(xì)胞直接共培養(yǎng)系統(tǒng)的工作流程圖。圖5是正常人的支氣管原代上皮細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基(左)和含血清培養(yǎng)基(右)中培養(yǎng)的生長(zhǎng)狀態(tài)比較。圖中顯示，支氣管上皮細(xì)胞在含血清的培養(yǎng)基中不能增殖。按實(shí)施例5的方法分離制備原代支氣管上皮細(xì)胞，最后將獲得的細(xì)胞沉淀重新懸浮于完全的DMEM培養(yǎng)基[成分為DMEM，加入10%胎牛血清(FBS)，100U/ml青霉素(penicillin)和100 y g/ml鏈霉素(Sti^ptomycin)]中，或者是無(wú)血清的上皮細(xì)胞培養(yǎng)基SFM(GIBC0#10744_019)(見實(shí)施例10)。一周后，在常規(guī)倒置顯微鏡下觀察并照相。雖然培養(yǎng)效果不佳，但無(wú)血清培養(yǎng)基仍然廣泛用于常規(guī)的上皮細(xì)胞原代與傳代培養(yǎng)。
圖6是培養(yǎng)的正常人支氣管原代上皮細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)比較。圖中顯示，對(duì)于支氣管上皮細(xì)胞，采用本發(fā)明的三種培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖明顯優(yōu)于使用常規(guī)的無(wú)血清培養(yǎng)基。按實(shí)施例5的方法分離制備原代支氣管上皮細(xì)胞，將獲得的細(xì)胞沉淀重新懸浮于實(shí)施例8的條件培養(yǎng)基中(方法見圖2)，或者重懸細(xì)胞于本發(fā)明的HL培養(yǎng)基(見實(shí)施例2，HL培養(yǎng)基6)中，按圖3的方法和實(shí)施例9所說(shuō)明的飼養(yǎng)細(xì)胞間接共培養(yǎng)，或按圖4和實(shí)施例6進(jìn)行原代培養(yǎng)。一周后，在常規(guī)倒置顯微鏡下觀察并照相。本圖示的研究中所需要的飼養(yǎng)細(xì)胞按照實(shí)施例I進(jìn)行傳代和保種。本圖示的研究中所需要的HL培養(yǎng)基按實(shí)施例2制備。本圖示的研究中所需要的飼養(yǎng)細(xì)胞按實(shí)施例3和4獲得。圖7是正常人支氣管上皮細(xì)胞體外傳代培養(yǎng)的比較。橫坐標(biāo)表示培養(yǎng)天數(shù)，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞增殖的倍數(shù)。圖中顯示，對(duì)于支氣管上皮細(xì)胞，采用本 發(fā)明的三種培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞可以在體外傳代至少10代左右，明顯優(yōu)于采用無(wú)血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)。按實(shí)施例5的方法分離制備原代支氣管上皮細(xì)胞，將獲得的細(xì)胞沉淀重新懸浮于實(shí)施例8的條件培養(yǎng)基中(方法見圖2)，或者重懸細(xì)胞于本發(fā)明的HL培養(yǎng)基(見實(shí)施例2，HL培養(yǎng)基6)中，按圖3的方法和實(shí)施例9所說(shuō)明的飼養(yǎng)細(xì)胞間接共培養(yǎng)，或按圖4和實(shí)施例6和7的說(shuō)明進(jìn)行傳代培養(yǎng)。本圖示的研究中所需要的飼養(yǎng)細(xì)胞按照實(shí)施例I進(jìn)行傳代和保種。本圖示的研究中所需要的HL培養(yǎng)基按實(shí)施例2制備。本圖示的研究中所需要的飼養(yǎng)細(xì)胞按實(shí)施例3和4獲得。圖8總結(jié)了本發(fā)明方法已經(jīng)成功培養(yǎng)的上皮細(xì)胞的種系和類型。這些細(xì)胞分別來(lái)自于人、小鼠和大鼠。這些細(xì)胞的組織類型有，但不限定于口腔、氣管、支氣管、肺上皮、胃、結(jié)腸、前列腺、乳腺、肝、胰腺、膀胱、卵巢和扁桃腺。具體實(shí)施步驟按實(shí)施例5的方法分離制備原代上皮細(xì)胞，將獲得的細(xì)胞沉淀重新懸浮于實(shí)施例8的條件培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)(方法見圖2)，或者重懸細(xì)胞于本發(fā)明的HL培養(yǎng)基(見實(shí)施例2，其中HL培養(yǎng)基I用于乳腺、前列腺、胃、膀胱來(lái)源的上皮細(xì)胞培養(yǎng)；HL培養(yǎng)基2用于肝來(lái)源的上皮細(xì)胞培養(yǎng)；HL培養(yǎng)基3用于結(jié)腸、扁桃腺、乳腺、胃來(lái)源的上皮細(xì)胞培養(yǎng)；HL培養(yǎng)基4用于卵巢、扁桃腺來(lái)源的上皮細(xì)胞培養(yǎng)；HL培養(yǎng)基5用于胰腺、扁桃腺來(lái)源的上皮細(xì)胞培養(yǎng)；HL培養(yǎng)基6用于口腔、氣管、支氣管、肺來(lái)源的上皮細(xì)胞培養(yǎng))，按圖3和實(shí)施例9所說(shuō)明的飼養(yǎng)細(xì)胞間接共培養(yǎng)，或按圖4和實(shí)施例6和7的說(shuō)明進(jìn)行培養(yǎng)傳代。本圖示的研究中所需要的飼養(yǎng)細(xì)胞按照實(shí)施例I進(jìn)行傳代和保種。本圖示的研究中所需要的HL培養(yǎng)基按實(shí)施例2制備。本圖示的研究中所需要的飼養(yǎng)細(xì)胞按實(shí)施例3和4獲得。圖9所示為來(lái)源于人、大鼠和小鼠上皮細(xì)胞的培養(yǎng)實(shí)例。左圖是來(lái)源于人的前列腺上皮細(xì)胞，按實(shí)施例5的方法分離制備原代上皮細(xì)胞，將獲得的細(xì)胞沉淀重懸于實(shí)施例8的HL條件培養(yǎng)基(即由HL培養(yǎng)基I與飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)，按圖示2方法得到)中培養(yǎng)。中圖和右圖分別是來(lái)源于大鼠的乳腺上皮細(xì)胞和小鼠的肺上皮細(xì)胞，按實(shí)施例5的方法分離制備原代上皮細(xì)胞，將獲得的細(xì)胞沉淀重懸于實(shí)施例2中的HL培養(yǎng)基I或HL培養(yǎng)基6，按圖4和實(shí)施例6和7的方法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。本圖示的研究中所需要的飼養(yǎng)細(xì)胞按照實(shí)施例I進(jìn)行傳代和保種。本圖示的研究中所需要的HL培養(yǎng)基按實(shí)施例2制備。本圖示的研究中所需要的飼養(yǎng)細(xì)胞按實(shí)施例3和4制備。圖10比較不同胎牛血清濃度對(duì)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。按實(shí)施例2配制HL培養(yǎng)基，加入胎牛血清使其終濃度分別為1%，2%，5%，10%。15%，20%。將5000個(gè)第二代的正常人支氣管上皮細(xì)胞(來(lái)自圖7研究中，實(shí)施例9的方法)分別懸浮于3毫升上述的含不同胎牛血清濃度的HL培養(yǎng)基中，然后置于6孔的細(xì)胞培養(yǎng)板中，再將500000個(gè)飼養(yǎng)細(xì)胞(按實(shí)施例3制備)置于transwell筐(Corning公司產(chǎn)品)中，按照?qǐng)D3的方法,在5% C02,37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天。棄去transwell筐以及其中盛裝的飼養(yǎng)細(xì)胞，棄去培養(yǎng)板中剩余的培養(yǎng)基，以無(wú)鈣鎂的磷酸緩沖液洗一次，加入ImlO. 05% EDTA/胰酶消化液，37°C孵育約2-3分鐘，待細(xì)胞完全脫壁后，加入2ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，充分混勻細(xì)胞，取出50ul細(xì)胞懸液混合于50ul的4%的臺(tái)盼藍(lán)(trypan blue)中染色,按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。圖11本發(fā)明的培養(yǎng)基所添加的ROCK抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖12顯示ROCK抑制劑的濃度對(duì)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。按實(shí)施例2配制HL培養(yǎng)基6，加入不同的ROCK抑制劑使其終濃度分別為luM，5uM，IOuM, 20uM, 50uM。將5000個(gè)第二代的正常支氣管上皮細(xì)胞(從圖7研究中，實(shí)施例9的方法)分別懸浮于3毫升上述的含不同濃度ROCK抑制劑的HL培養(yǎng)基6中，然后置于6孔的細(xì)胞培養(yǎng)板中，再將500000個(gè)飼 養(yǎng)細(xì)胞(按實(shí)施例3制備)置于transwell筐(Corning公司產(chǎn)品)中，按照?qǐng)D3的方法，在5% C02，37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8天。棄去transwell筐以及其中盛裝的飼養(yǎng)細(xì)胞，棄去培養(yǎng)孔中剩余的培養(yǎng)基，以無(wú)鈣鎂的磷酸緩沖液洗一次，加入Iml 0. 05% EDTA/胰酶消化液，37°C孵育約2-3分鐘，待細(xì)胞完全脫壁后，加入2ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，充分混勻細(xì)胞，取出50ul細(xì)胞懸液混合于50ul的4%的臺(tái)盼藍(lán)(trypan blue)中染色,按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。發(fā)明的
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的培養(yǎng)基本發(fā)明的第一方面涉及一種培養(yǎng)基(也稱作本發(fā)明的培養(yǎng)基，即HL培養(yǎng)基)，其包含血清、鈣成分和ROCK抑制劑。本說(shuō)明書中，培養(yǎng)基是指用于培養(yǎng)生物材料的基質(zhì)。對(duì)于生物材料沒(méi)有特殊限制，可以是病毒、細(xì)胞(例如微生物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞)、組織(例如動(dòng)物組織、植物組織)等。本發(fā)明的培養(yǎng)基優(yōu)選是用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，即細(xì)胞培養(yǎng)基。本發(fā)明的培養(yǎng)基更優(yōu)選是用于上皮細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基。本說(shuō)明書中的上皮細(xì)胞可以為例如非角質(zhì)上皮細(xì)胞，例如來(lái)源于腺體，包括乳腺、前列腺、肝和腸道上皮的非角質(zhì)上皮細(xì)胞。非角質(zhì)上皮細(xì)胞分化為具有吸收或分泌功能的活性細(xì)胞，非角質(zhì)上皮細(xì)胞并不是高度角質(zhì)化結(jié)構(gòu)的鱗狀上皮細(xì)胞?？捎帽景l(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)的非角質(zhì)上皮細(xì)胞可以來(lái)源于任何種類的組織器官?？梢耘囵B(yǎng)的非角質(zhì)上皮細(xì)胞包括但不限定為如下類型口腔的、鼻粘膜的，氣管的、支氣管的、肺上皮的、食管上皮的、胃粘膜上皮的、大腸上皮的、小腸上皮的、肝細(xì)胞的、膽管上皮的、膽囊的、胰腺(包括胰島P細(xì)胞)、腎的、膀胱的、尿道上皮的、睪丸上皮的、卵巢上皮的、甲狀腺的、甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞、腎上腺的、胸腺的、前列腺的、乳腺的、扁桃腺的，垂體的細(xì)胞、角膜上皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。此外，本發(fā)明的培養(yǎng)基可以是固體粉末狀培養(yǎng)基，也可以是液體培養(yǎng)基，優(yōu)選是液體培養(yǎng)基。當(dāng)本發(fā)明的培養(yǎng)基是固體粉末狀培養(yǎng)基時(shí)，優(yōu)選在使用時(shí)將其調(diào)制成液體培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，在調(diào)制過(guò)程中可以添加血清、鈣成分和ROCK抑制劑等各種成分，使其滿足本發(fā)明的要件。本說(shuō)明書中，當(dāng)對(duì)象為細(xì)胞時(shí)，“培養(yǎng)”或“細(xì)胞培養(yǎng)”是指在體外進(jìn)行人工維系，使細(xì)胞得以增殖。細(xì)胞培養(yǎng)通常在無(wú)菌條件下進(jìn)行，可以是培養(yǎng)單個(gè)細(xì)胞或組織。本發(fā)明的培養(yǎng)基中應(yīng)該含有血清。作為血清，可以使用細(xì)胞培養(yǎng)中常用的血清，例如小牛血清或胎牛血清，優(yōu)選胎牛血清。作為血清,還包括各種血清替代物,血清替代物包括但不限定于商品化購(gòu)買的產(chǎn)品(例如Invitrogen公司的Knockout 血清替代物，PallCorporation公司的Ultroser ),還包括牛奶及牛奶成分(例如過(guò)濾的脫脂牛奶干粉)。對(duì)于培養(yǎng)基中的血清的量沒(méi)有特殊限制，可以與常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)中添加至培養(yǎng)基中的血清的量相同，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。優(yōu)選地，以體積比計(jì)(V/V%)，培養(yǎng)基中血清含量的下限可以是I. 0%、更優(yōu)選2. 0%、更優(yōu)選3. 0%、更優(yōu)選4. 0%、更優(yōu)選
4.5%,更優(yōu)選5.0%;培養(yǎng)基中血清含量的上限可以是35%、更優(yōu)選30%、更優(yōu)選25%、更優(yōu)選20%、更優(yōu)選17%、更優(yōu)選15%、更優(yōu)選13%、更優(yōu)選11 %、更優(yōu)選10%。本說(shuō)明書中，ROCK是指Rho激酶I (R0CK I)和/或Rho激酶2 (R0CK 2)。抑制ROCK是指降低R0CK1或R0CK2中的至少一種酶的活性、表達(dá)或功能。與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，ROCK活性、表達(dá)或功能可以被完全抑制即達(dá)到無(wú)活性、無(wú)表達(dá)或無(wú)功能,也可以是活性、表 達(dá)或功能水平降低。本說(shuō)明書中，ROCK抑制劑是指具有抑制ROCK的作用的物質(zhì)。對(duì)于ROCK抑制劑，沒(méi)有特殊限制，可以使用本領(lǐng)域公知的ROCK抑制劑，例如法舒地爾(Fasudil)，H-1152，Y-27632，HA1100，HA1077和GSK429286等，這些都是商品化的常用試劑。此外，ROCK抑制劑還包括在 PCT 申請(qǐng)(W0 03/059913, WO 03/064397，WO 05/003101，WO 04/112719，WO 03/062225和W003/062227)中公開的、或者在美國(guó)授權(quán)專利(7，217，722和7，199，147)和美國(guó)申請(qǐng)專利(2003/0220357，2006/0241127, 2005/0182040 和 2005/0197328)中公開的小分子ROCK抑制劑。對(duì)于本發(fā)明的培養(yǎng)基中ROCK抑制劑的含量沒(méi)有特殊限制，只要是有效量即可。所述有效量是指能夠抑制ROCK的量，確定有效量的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)所培養(yǎng)的細(xì)胞的種類、所使用的ROCK抑制劑的種類等條件適宜地確定有效量。例如，雖然可能因細(xì)胞的種類、ROCK抑制劑的種類、細(xì)胞培養(yǎng)條件等而異，但一般而言，ROCK抑制劑含量可以在0. I ii M ImM之間。本發(fā)明的培養(yǎng)基中還可以包含飼養(yǎng)細(xì)胞。本說(shuō)明書中，飼養(yǎng)細(xì)胞是指與希望培養(yǎng)的細(xì)胞共同培養(yǎng)的細(xì)胞，其中，所述希望培養(yǎng)的細(xì)胞優(yōu)選是非角質(zhì)上皮細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞一般是經(jīng)過(guò)gamma射線照射和/或絲裂霉素處理的，其有絲分裂受到抑制，但仍可維持代謝活性。因此，飼養(yǎng)細(xì)胞是具有代謝能力但不能分裂的非增殖細(xì)胞。處理和阻斷細(xì)胞有絲分裂并維持細(xì)胞代謝活性的方法可以是細(xì)胞生物學(xué)的常規(guī)方法。飼養(yǎng)細(xì)胞可以來(lái)源于任何哺乳動(dòng)物，但其來(lái)源要與希望培養(yǎng)的細(xì)胞(優(yōu)選非角質(zhì)上皮細(xì)胞)來(lái)源的種屬不同。飼養(yǎng)細(xì)胞可以是但不限定于以下來(lái)源，如小鼠、大鼠、狗、貓、牛、馬、豬、靈長(zhǎng)類以及人類的飼養(yǎng)細(xì)胞。典型的飼養(yǎng)細(xì)胞類型包括脾細(xì)胞、巨噬胸腺細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞，它們經(jīng)處理后成為非增殖細(xì)胞。另外，本發(fā)明中也可以利用J2作為飼養(yǎng)細(xì)胞，J2細(xì)胞是建系的鼠成纖維細(xì)胞Swiss 3T3細(xì)胞系的亞克隆，經(jīng)gamma射線照射和/或絲裂霉素處理。對(duì)于本發(fā)明的培養(yǎng)基中所包含的飼養(yǎng)細(xì)胞的量沒(méi)有特殊限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要適宜確定，通常飼養(yǎng)細(xì)胞與希望培養(yǎng)的上皮細(xì)胞的比例可以是I : 9 9 : 1，優(yōu)選2 8 8 2。此外，本發(fā)明的培養(yǎng)基中可以包含條件培養(yǎng)基。本說(shuō)明書中，條件培養(yǎng)基是指包含飼養(yǎng)細(xì)胞分泌物和/或提取物的培養(yǎng)基。典型的條件培養(yǎng)基是用培養(yǎng)基培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞一段時(shí)間后，再除去飼養(yǎng)細(xì)胞而得到的培養(yǎng)基。此處，用于培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基優(yōu)選是包含血清、鈣成分和ROCK抑制劑的培養(yǎng)基，例如本發(fā)明的培養(yǎng)基。對(duì)于培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)間，沒(méi)有特殊限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要適宜確定，通?？梢允荌 300小時(shí)，優(yōu)選5 200小時(shí)，更優(yōu)選10 150小時(shí)，更優(yōu)選10 150小時(shí)，更優(yōu)選20 100小時(shí)，更優(yōu)選24 72小時(shí)，更優(yōu)選35 60小時(shí)，更優(yōu)選40 50小時(shí)。一般而言，制備條件培養(yǎng)基例如包括將細(xì)胞培養(yǎng)于一種培養(yǎng)基中(如F培養(yǎng)基)，幾天后收集這些培養(yǎng)基。條件培養(yǎng)基可以是，用新鮮培養(yǎng)基按一定比例稀釋后的條件培養(yǎng)基，也可以是不經(jīng)稀釋的收集后的條件培養(yǎng)基。新鮮培養(yǎng)基條件培養(yǎng)基的稀釋比例可以是I : 99 99 1，依具體實(shí)驗(yàn)條件而定。本發(fā)明中所述的“條件培養(yǎng)基”包括經(jīng)任何比例稀釋或不稀釋的條件培養(yǎng)基。優(yōu)選地，本發(fā)明的培養(yǎng)基可以是含有血清、鈣成分和ROCK抑制劑的未經(jīng)稀釋的條件培養(yǎng)基。本發(fā)明的培養(yǎng)基可以使用用于細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)培養(yǎng)基來(lái)制備。常規(guī)培養(yǎng)基是指本技術(shù)領(lǐng)域公知的用于細(xì)胞培養(yǎng)(優(yōu)選用于上皮細(xì)胞培養(yǎng))的培養(yǎng) 基，包括但不限于DMEM(Dulbecco’ s Modified Essential Medium), Ham’ s F12 培養(yǎng)基，Ham’ s F-10 培養(yǎng)基，RPMI 1640, Eagle，s Basal Medium(EBM), Eagle’ sMinimum Essential Medium(MEM),HEPES,Medium 199以及相關(guān)類型培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)基也可以是兩種以上培養(yǎng)基的組合，例如DMEM和F12的混合培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)基的配方中一般不包含血清，因此，當(dāng)使用常規(guī)培養(yǎng)基來(lái)制備本發(fā)明的培養(yǎng)基時(shí)，可以另行添加一定量的血清，使得培養(yǎng)基中的血清含量在上述限定的范圍內(nèi)。增加或減少培養(yǎng)基中的血清的操作是本技術(shù)領(lǐng)域的常規(guī)操作。本發(fā)明的培養(yǎng)基中應(yīng)該含有鈣成分。此處所稱的“鈣成分”是指能夠?yàn)楸景l(fā)明的培養(yǎng)基提供鈣離子(Ca2+)的成分，包括但不限于含鈣的化合物。通常，鈣成分來(lái)源于血清或血清替代物，或者來(lái)源于培養(yǎng)基中添加的含鈣的鹽類。所述鈣成分例如可以以鈣鹽(例如氯化鈣、硫酸鈣)的形式添加至培養(yǎng)基中。鈣成分的含量范圍(以鈣離子計(jì))可以與用于細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)培養(yǎng)基中的鈣成分含量相同，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。例如，以Ca2+計(jì)，鈣成分含量的下限可以是0. I u M、優(yōu)選10 u M、更優(yōu)選100 y M、更優(yōu)選200 u M、更優(yōu)選400 u M、更優(yōu)選500 u M、更優(yōu)選800 u M、更優(yōu)選ImM、更優(yōu)選I. 2mM、更優(yōu)選I. 3mM、更優(yōu)選I. 5mM ;鈣成分含量的上限可以是30mM、更優(yōu)選25mM、更優(yōu)選20mM、更優(yōu)選15mM、更優(yōu)選12mM、更優(yōu)選10mM、更優(yōu)選8mM、更優(yōu)選7mM、更優(yōu)選6mM、更優(yōu)選5mM、更優(yōu)選4mM、更優(yōu)選3mM、更優(yōu)選2. 8mM、更優(yōu)選2. 5mM。當(dāng)使用常規(guī)培養(yǎng)基來(lái)制備本發(fā)明的培養(yǎng)基時(shí)，優(yōu)選進(jìn)行調(diào)整使得鈣成分含量在上述限定的范圍內(nèi)。如果常規(guī)培養(yǎng)基的經(jīng)典配方中包含鈣且鈣成分含量在上述限定的范圍內(nèi)，則就鈣成分含量而言，該常規(guī)培養(yǎng)基無(wú)需進(jìn)行調(diào)整；如果常規(guī)培養(yǎng)基的經(jīng)典配方中包含鈣但鈣成分含量不在上述限定的范圍內(nèi)，則應(yīng)該相應(yīng)地增加或減少配方中的鈣，使得培養(yǎng)基的鈣成分含量在上述限定的范圍內(nèi)；如果常規(guī)培養(yǎng)基的經(jīng)典配方中不包含鈣，則應(yīng)該在配方中增加鈣，使得培養(yǎng)基的鈣成分含量在上述限定的范圍內(nèi)。增加或減少培養(yǎng)基中的鈣成分含量的操作是本技術(shù)領(lǐng)域的常規(guī)操作。本發(fā)明的培養(yǎng)基中可以添加其它常規(guī)成分，包括但不限定于氨基酸類、維生素類、無(wú)機(jī)鹽類、腺嘌呤、乙醇胺(ethanolamine)、D-葡萄糖、肝素(heparin)、N-[2-輕乙基(hydroxyethylpiperazine) -N 1 ~[2~ 乙石黃酸(ethanesulfonic acid)](HEPES)、皮質(zhì)醇(hydrocortisone)、insulin(胰島素)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、腎上腺素(epinephrine)、硫辛酸(lipoic acid)、酹紅、磷酸乙醇胺(phosphoethanolamine)、腐胺(putrescine)、霍亂毒素(cholera toxin)、丙酮酸鈉(sodium pyruvate)、三碘甲腺原氨酸(triiodothyronine, T3)、胸腺卩密唳和運(yùn)鐵蛋白(transferrin)。其中，肝素和運(yùn)鐵蛋白可以用朽1檬酸鐵(ferric citrate)或螯合硫酸鐵(ferrous sulfate chelates)替代。上述添加成分均可以商品化購(gòu)買。本發(fā)明的培養(yǎng)基中的氨基酸類包括但不限定于L_丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺(L-asparagine)、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-纈氨酸。本發(fā)明的培養(yǎng)基中的維生素類包括但不限定于生物素、氯化膽堿(cholinechloride)、D_Ca+2-泛酸(pantothenate)、葉酸(folic acid)、i_ 肌酉享(i-inositol)、煙酸胺(niacinamide)、多醇(pyridoxine)、核黃素(riboflavin)、維生素 BI (thiamine)和維生素 B12。
無(wú)機(jī)鹽類成分包括但不限定于鈣鹽(如CaCl2)、CuS04、FeSO4' KC1、鎂鹽(如 MgCl2)、錳鹽(如MnCl2)、醋酸鈉、NaCl, NaHC03> Na2HPO4, Na2SO4,以及痕量的其它元素如硒(selenium)、娃、鑰(molybdenum)、鑰；(vanadium)、鎳、錫、鋅,這些痕量元素可以以多種形式出現(xiàn)，但最好是鹽類的形式，如 Na2SeO3, Na2SiO3, (NH4) 6Mo7024, NH4VO3, NiSO4, SnCl 和 ZnSO4本發(fā)明的培養(yǎng)基的其它添加成分包括但不限定于肝素、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)、至少一種可以增加細(xì)胞內(nèi)環(huán)腺苷一憐酸(cyclicadenosine monophosphate, cAMP)水平的因子、至少一種成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblastgrowth factor, FGF)。上述添加成分可以直接加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，也可以用DPBS(Dulbecco; s Phosphate Buffered Saline)緩沖液配制成混合液,冷凍保存直至配制培養(yǎng)基時(shí)再行添加。本發(fā)明的培養(yǎng)基中的肝素可以商業(yè)化購(gòu)買。肝素的主要作用是穩(wěn)定生長(zhǎng)因子的活性，如FGF。肝素在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加濃度為1-500U. S. P. units/L。EGF也可以商業(yè)化購(gòu)買，EGF在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加濃度為0. 00001-10mg/Lo本發(fā)明的培養(yǎng)基中可以包含多種種類的能增加細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的因子，可以是直接增加cAMP水平的[如二丁酰(dibutyry I) cAMP]，也可以是通過(guò)與細(xì)胞G蛋白相互作用導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高[如霍亂毒素和毛喉素(forskolin)],或者作為3 -腎上腺素受體(0-adrenergic receptors)的拮抗劑(如異丙腎上腺素)增加細(xì)胞內(nèi)cAMP水平、或者通過(guò)抑制cAMP磷酸二酯酶的活性而使細(xì)胞內(nèi)cAMP水平增加[如isobutylmethylxanthine (IBMX)和茶喊(theophylline)]。上述這些化合物都可以商業(yè)化購(gòu)買。本發(fā)明的試劑倉(cāng)本發(fā)明的第二方面涉及一種試劑盒(本發(fā)明的試劑盒)，其包含培養(yǎng)基、血清、鈣成分和ROCK抑制劑。本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選用于培養(yǎng)細(xì)胞。所述細(xì)胞優(yōu)選是上皮細(xì)胞，更優(yōu)選是非角質(zhì)上皮細(xì)胞。所述培養(yǎng)基可以是任何用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基，例如上述的常規(guī)培養(yǎng)基，優(yōu)選可以是上述的條件培養(yǎng)基。所述血清、鈣成分和ROCK抑制劑同上述。本發(fā)明的試劑盒可以用于配制上述本發(fā)明的培養(yǎng)基。本發(fā)明的試劑盒中，培養(yǎng)基、血清和ROCK抑制劑三者的比例優(yōu)選滿足將三者混合后能夠形成上述本發(fā)明的培養(yǎng)基。優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒還包含鈣成分，此時(shí)，培養(yǎng)基、血清、鈣成分和ROCK抑制劑四者的比例優(yōu)選滿足將四者混合后能夠形成上述本發(fā)明的培養(yǎng)基。優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒還包含飼養(yǎng)細(xì)胞。所述飼養(yǎng)細(xì)胞同上述。所述飼養(yǎng)細(xì)胞可以是常規(guī)貼壁的，常溫下可存活3-5天；所述飼養(yǎng)細(xì)胞也可以是低溫凍存的，低溫凍存是指在_80°C以下長(zhǎng)期儲(chǔ)存，一般可以儲(chǔ)存幾天至幾年。所述飼養(yǎng)細(xì)胞還可以是低溫儲(chǔ)存的，低溫儲(chǔ)存是指在4°C下儲(chǔ)存，一般可以儲(chǔ)存I 7天。優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒還包含用于在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)單獨(dú)盛放所述飼養(yǎng)細(xì)胞的容器，該容器具有可通透性膜結(jié)構(gòu)。特別是，在本發(fā)明的試劑盒包含飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下，優(yōu)選其還包含所述容器。所述容器的作用是，在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，將飼養(yǎng)細(xì)胞與需要培養(yǎng)的細(xì)胞隔離開來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)，并使得飼養(yǎng)細(xì)胞的分泌物通過(guò)上述可通透性膜結(jié)構(gòu)進(jìn)入到培養(yǎng)需要培養(yǎng)的細(xì)胞的培養(yǎng)基中。對(duì)于所述容器的形狀、材質(zhì)、規(guī)格等均無(wú)特殊限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要適宜選擇。例如，可以使用Transwell筐(Corning公司產(chǎn)品)。·優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒包含本發(fā)明的培養(yǎng)基和飼養(yǎng)細(xì)胞，更優(yōu)選還包含所述容器。本發(fā)明的試劑盒中還可以包含用于添加到培養(yǎng)基中的其它成分，包括但不限于在前述的“本發(fā)明的培養(yǎng)基”一節(jié)中描述的添加成分。本發(fā)明的試劑盒中還可以包含用于細(xì)胞培養(yǎng)的其它成分或組件，例如指示劑、胰酶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、使用說(shuō)明書等。本發(fā)明的試劑盒中，優(yōu)選所述各成分分開放置，更優(yōu)選分別置于獨(dú)立的容器中。本發(fā)明的培養(yǎng)方法本發(fā)明的第三方面涉及一種培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法(也稱本發(fā)明的培養(yǎng)方法)，該方法包括步驟A :使用上述本發(fā)明的培養(yǎng)基將上皮細(xì)胞與飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)；或步驟B :使用上述的包含飼養(yǎng)細(xì)胞或條件培養(yǎng)基的本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)上皮細(xì)胞(見圖2)。本發(fā)明的培養(yǎng)方法可以是上皮細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法，也可以是原代上皮細(xì)胞增殖培養(yǎng)方法。這里，所述上皮細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞均同前述。步驟A中可以將上皮細(xì)胞與飼養(yǎng)細(xì)胞直接共培養(yǎng)，也可以將上皮細(xì)胞與飼養(yǎng)細(xì)胞間接共培養(yǎng)。所述直接共培養(yǎng)是指將上皮細(xì)胞與飼養(yǎng)細(xì)胞置于同一培養(yǎng)器皿中，進(jìn)行培養(yǎng)(見圖4);所述間接共培養(yǎng)是指將飼養(yǎng)細(xì)胞單獨(dú)置于上述的具有可通透性膜結(jié)構(gòu)的容器(例如Transwell筐)中，然后，可以例如再將該裝有飼養(yǎng)細(xì)胞的容器置于培養(yǎng)上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基中，進(jìn)行培養(yǎng)(見圖3)。本發(fā)明的培養(yǎng)方法中的其它步驟可以按照本技術(shù)領(lǐng)域的常規(guī)方法進(jìn)行。細(xì)胞的接種密度可以根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。常規(guī)的一次性塑料培養(yǎng)器皿中，一般接種細(xì)胞數(shù)為I X IO4 10 X IO5細(xì)胞/cm2，即75cm2培養(yǎng)瓶接種細(xì)胞數(shù)例如為I X IO60每一次傳代都要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)要求對(duì)細(xì)胞密度進(jìn)行調(diào)整。哺乳動(dòng)物細(xì)胞通常培養(yǎng)于37°C、適當(dāng)CO2濃度(3 10% )、一定濕度的培養(yǎng)箱中，溫度、CO2濃度和濕度可以根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行調(diào)整。培養(yǎng)基的PH的范圍可以根據(jù)需要調(diào)整，通常為pH7. I 7. 6，優(yōu)選為pH7. I 7. 3細(xì)胞培養(yǎng)基通常1-2天更換一次，也可根據(jù)具體培養(yǎng)的細(xì)胞類型進(jìn)行調(diào)整。只要細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長(zhǎng)至滿豐度，就可以進(jìn)行傳代了。本說(shuō)明書中，細(xì)胞傳代是指將細(xì)胞分種一部分至新的培養(yǎng)器皿中。
實(shí)施例以下，通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的說(shuō)明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制。此外，實(shí)施例中未經(jīng)特別標(biāo)注的試劑，均購(gòu)自GIBCO公司。實(shí)施例ISwiss 3T3細(xì)胞的培養(yǎng)傳代Swiss 3T3 細(xì)胞從 Harvard University 的 Howard Green 教授實(shí)驗(yàn)室獲得。所需試劑完全的DMEM培養(yǎng)基DMEM(GIBC0#11965-092)，10%胎牛血清(FBS)，100U/ml 青霉素(penicillin)和 100 u g/ml 鏈霉素(streptomycin)胰酶消化液0.05% 胰酶 /EDTA(GIBC0#25300-062)無(wú)鈣鎂磷酸緩沖液Ca2+，Mg2+free PBS傳代培養(yǎng)操作步驟接種I X IO5Swiss 3T3細(xì)胞于T75細(xì)胞培養(yǎng)皿，加入IOml上述的完全DMEM培養(yǎng)基，置于CO2培養(yǎng)箱在5% CO2, 37°C培養(yǎng)2-5天。當(dāng)細(xì)胞單層豐度為80-90%時(shí)，移去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，以IOml無(wú)鈣鎂磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞單層2次，加入2ml胰酶消化液，在37°C孵育I分鐘。輕拍培養(yǎng)皿以充分釋放貼壁的細(xì)胞，以IOml完全的DMEM培養(yǎng)基中和消化反應(yīng)。4°C離心5分鐘(1000轉(zhuǎn)/分鐘)沉淀細(xì)胞，移去上清，重懸細(xì)胞沉淀于IOml完全的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。根據(jù)需要可以I : 10，1 20或I : 50比例傳代于新的T75(10-15ml完全的DMEM培養(yǎng)基)或T175(25-30ml完全的DMEM培養(yǎng)基)的培養(yǎng)皿中，根據(jù)需要每周更換新鮮完全的DMEM培養(yǎng)基2-3次。必要時(shí)可將I X IO6細(xì)胞重懸于l_2ml的細(xì)胞凍存液(60%DMEM，30%胎牛血清和10% DMS0)中，儲(chǔ)存于液氮中備用。實(shí)施例2HL培養(yǎng)基HL 培養(yǎng) 基 I 為 DMEM(GIBC0#11965-092)與 Ham’ sF-12NUTRIENTMIX(GIBC0#11765-054)的混合培養(yǎng)基，體積配比為3 1，同時(shí)添加5%的胎牛血清，以及 0. 4 u g/ml 皮質(zhì)醇(hydrocortisone)，5 u g/ml 膜島素(insulin)，8. 4ng/ml霍亂毒素(cholera toxin), 10ng/ml 表皮生長(zhǎng)因子(epithelial growth factor (EGF)),24 u g/ml 腺嘌呤(adenine), lOOU/ml 青霉素(penicillin)和 100 u g/ml 鏈霉素(streptomycin), 0. 25 u g/ml 兩性霉素 B (Fungizone, ) 30 u M 法舒地爾(Fasudil)(或0. 5uM H-1152 或 5iiM Y-27632，30 y M HA1100, IOuM GSK429286)，上述培養(yǎng)基需經(jīng) 0. 22 u孔徑濾膜過(guò)濾。HL 培養(yǎng)基 2 為在 DMEM(Low Glucose, No Glutamine，GIBCOftllO54-O2O)中添加10 % 的胎牛血清，以及 0. 4 u g/ml 皮質(zhì)醇(hydrocortisone)，5 u g/ml 胰島素(insulin)，8. 4ng/ml 霍亂毒素(cholera toxin)，10ng/ml 表皮生長(zhǎng)因子(epithelial growthfactor (EGF)), 24 u g/ml 腺嘌呤(adenine), lOOU/ml 青霉素(penicillin)和 100 u g/ml鏈霉素(streptomycin), 0. 25 ii g/ml 兩性霉素 B (Fungizone, ) 30 u M 法舒地爾(Fasudil)(或 0.5iiM H-1152 或 5 ii M Y-27632，30 y M HA1100,10uM GSK429286)，上述培養(yǎng)基需經(jīng)0. 22 u孔徑濾膜過(guò)濾。HL 培養(yǎng)基 3 為 RPMI 培養(yǎng)基 1640 (GIBC0#22400_121)含 5mMHEPES，添加 8% 的胎牛血清，以及 0. 4 u g/ml 皮質(zhì)醇(hydrocortisone)，5 u g/ml 膜島素(insulin)，8. 4ng/ml霍亂毒素(cholera toxin), 10ng/ml 表皮生長(zhǎng)因子(epithelial growth factor (EGF)),24 u g/ml 腺嘌呤(adenine), lOOU/ml 青霉素(penicillin)和 IOOii g/ml 鏈霉素(streptomycin), 0. 25 u g/ml 兩性霉素 B (Fungizone, ) 30 u M 法舒地爾(Fasudil)(或0. 5uM H-1152*5iiMY-27632，30iiM HA1100,10uM GSK429286)，上述培養(yǎng)基需經(jīng) 0. 22 u孔徑濾膜過(guò)濾。HL 培養(yǎng)基 4 為在 L-15 (Leibovitz)培養(yǎng)基(L-glutamine，No HEPES,GIBC0#11415064)中添加 5% 的胎牛血清，以及 0. 4 u g/ml 皮質(zhì)醇(hydrocortisone), 5 ii g/ml 胰島素(insulin) ,8. 4ng/ml 霍亂毒素(cholera toxin), 10ng/ml 表皮生長(zhǎng)因子(epithelial growth factor (EGF)),24 u g/ml 腺嘌呤(adenine),100U/ml 青霉素(penicillin)和 IOOy g/ml 鏈霉素(streptomycin), 0. 25 u g/ml 兩性霉素B (Fungizone, ) 30 u M 法舒地爾(Fasudil)(或 0. 5 y M H-1152 或 5yM Y-27632，30 y MHAl 100，10 u MGSK429286)，上述培養(yǎng)基需經(jīng)0. 22 U孔徑濾膜過(guò)濾。HL 培養(yǎng)基 5 為在培養(yǎng)基 199 (with Earle 1 s salts but no L-glutamine, nosodium bicarbonate, GIBC0#11825015)中添加 10% 的胎牛血清，以及 0. 4 u g/ml 皮質(zhì)酉享(hydrocortisone), 5 u g/ml 膜島素(insulin), 8. 4ng/ml 霍亂毒素(cholera toxin),lOng/ml 表皮生長(zhǎng)因子(epithelial growth factor (EGF)), 24 u g/ml 腺嘌呤(adenine),lOOU/ml 青霉素(penicillin)和 100 u g/ml 鏈霉素(streptomycin), 0. 25 u g/ml 兩性霉素 B (Fungizone，)30 ii M 法舒地爾(Fasudil)(或 0. 5 y M H-1152 或 5yM Y-27632，30 y MHAl 100，10 u MGSK429286)，上述培養(yǎng)基需經(jīng)0. 22 U孔徑濾膜過(guò)濾。HL 培養(yǎng)基 6 為 DMEM(GIBC0#11965-092)與無(wú)血清培養(yǎng)基 SFM(GIBC0#10744_019的混合培養(yǎng)基，體積配比為I : 3，同時(shí)添加5%的胎牛血清，以及0.4ii g/ml皮質(zhì)醇(hydrocortisone)，5 u g/ml 膜島素(insulin), 8. 4ng/ml 霍亂毒素(cholera toxin),lOng/ml 表皮生長(zhǎng)因子(epithelial growth factor (EGF)), 24 u g/ml 腺嘌呤(adenine),lOOU/ml 青霉素(penicillin)和 100 u g/ml 鏈霉素(streptomycin), 0. 25 u g/ml 兩性霉素 B (Fungizone，)30 ii M 法舒地爾(Fasudil)(或 0. 5 y M H-1152 或 5yM Y-27632，30 y MHAl 100，IOuM GSK429286)，上述培養(yǎng)基需經(jīng)0. 22 U孔徑濾膜過(guò)濾。實(shí)施例3飼養(yǎng)細(xì)胞(失去分裂能力的Swiss 3T3細(xì)胞)的制備(絲裂酶素C處理swiss 3T3 細(xì)胞)I)作為飼養(yǎng)細(xì)胞的swiss 3T3細(xì)胞，宜采用傳代培養(yǎng)早期的細(xì)胞。當(dāng)swiss 3T3細(xì)胞生長(zhǎng)至滿豐度時(shí)，培養(yǎng)基中加入終濃度為IOii g/mL的絲裂酶素C (溶于水，儲(chǔ)存液濃度為 0. 5mg/mL)，37°C處理 2 小時(shí);2)再加入溫浴的IxPBS或無(wú)血清的培養(yǎng)基(DMEM)洗3次，棄洗液；3)加入0.05%胰酶/EDTA預(yù)消化細(xì)胞30-40秒后棄去，再次加入0.05%胰酶/EDTA消化30秒，輕拍培養(yǎng)皿使細(xì)胞分散，然后加入完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的DMEM)中和反應(yīng)；4)低速離心(IOOOrpm)去上清，獲得細(xì)胞沉淀；5)沉淀下來(lái)的細(xì)胞可以直接用作飼養(yǎng)細(xì)胞，或者貯存?zhèn)溆?；a)直接用作飼養(yǎng)細(xì)胞的情況，操作步驟如下-加入溫浴的IxPBS洗細(xì)胞沉淀I次，再次離心-將細(xì)胞懸于HL培養(yǎng)基中-以適當(dāng)?shù)谋壤?如I: 3)將飼養(yǎng)細(xì)胞與一定數(shù)量的上皮細(xì)胞混懸于HL 培養(yǎng)基中，上皮細(xì)胞最適接種濃度為2. 5 X IO5個(gè)/IOOmm的培養(yǎng)皿；b)飼養(yǎng)細(xì)胞是第二天備用的情況，操作步驟如下-加入溫浴的IxPBS洗細(xì)胞沉淀I次，再次離心-將細(xì)胞懸于完全DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的DMEM)-以I: 3的比例接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)過(guò)夜-第二天用溫浴的IxPBS洗細(xì)胞2次，換成HL培養(yǎng)基-再將上皮細(xì)胞接種于含飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，上皮細(xì)胞最適接種濃度為
2.5 X IO5個(gè)/IOOmm的培養(yǎng)皿；c)飼養(yǎng)細(xì)胞是貯存?zhèn)溆玫那闆r，操作步驟如下-加入溫浴的IxPBS洗細(xì)胞沉淀I次-將飼養(yǎng)細(xì)胞重懸于6ml的凍存液(90%胎牛血清和10%DMS0)中，分于3支凍存
管中-凍存于液氮或_150°C條件下-臨用時(shí)取I支復(fù)蘇，加入完全DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的DMEM)接種于10Omm培養(yǎng)皿備注被用作飼養(yǎng)細(xì)胞的3T3細(xì)胞經(jīng)絲裂酶素C處理后，需在3-5天內(nèi)使用或者低溫凍存?zhèn)溆?。?shí)施例4.飼養(yǎng)細(xì)胞(失去分裂能力的Swiss 3T3細(xì)胞)的制備(放射線處理swiss 3T3 細(xì)胞)作為飼養(yǎng)細(xì)胞的swiss 3T3細(xì)胞，宜采用傳代培養(yǎng)早期的細(xì)胞，這些細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)至近滿豐度，用不含Ca2+/Mg2+的IxPBS洗細(xì)胞I次，加入Iml 0. 05%胰酶消化細(xì)胞20-40秒，然后加入9ml完全DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的DMEM)中和消化反應(yīng)，于4°C低速離心IOOOrmp收集細(xì)胞沉淀，加入IOml DMEM重懸細(xì)胞，放射線照射細(xì)胞懸液，即Cesium-137射線儀(JL Shepherd Mark)處理3000Rad (30Grey)。這些經(jīng)放射線處理的swiss 3T3細(xì)胞，接種于HL培養(yǎng)基中直接用作飼養(yǎng)細(xì)胞；或者培養(yǎng)于完全DMEM培養(yǎng)基或置于4°C儲(chǔ)存并于1-7天之內(nèi)使用；或者長(zhǎng)期凍存于_80°C或液氮中備用。實(shí)施例5.新鮮組織中分離培養(yǎng)原代上皮細(xì)胞在病人或病人監(jiān)護(hù)人知情同意的情況下，收集人的正?；蚰[瘤組織樣品。具體操作步驟如下I.消化液的配制含膠原酶/透明質(zhì)酸酶(終濃度為Ix的混合液)的HL培養(yǎng)基(即DMEM F12體積比3 I的混合培養(yǎng)基)，添加5% FBS。根據(jù)新鮮組織的大小決定消化液的用量，通常需要10倍于樣品體積的消化液的用量，例如2-3個(gè)小鼠前列腺需2-5ml消化液；2.用95-100%的乙醇洗分離的新鮮組織I次，再用PBS洗2次，然后將組織放入含預(yù)冷PBS的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，在解剖顯微鏡下，用解剖鑷子和剪刀去除組織中殘留的脂肪。3.將組織樣品放入含上述消化液的14ml或50ml離心管中，37°C消化1_3小時(shí)。4.將消化后的組織低速離心(IOOOrpm) 5分鐘，去除上清。5.將細(xì)胞沉淀重懸于2-5mL的0. 25%胰酶/EDTA中，置于冰上I小時(shí)或室溫10分鐘。6.然后加入IOml含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，低速IOOOrmp離心5分鐘。7.盡量將上清去除干凈。
8.加入2ml溫浴的5mg/mL分散酶和200 ii L的lmg/mL DNase I,用無(wú)菌的P1000一次性塑料槍頭反復(fù)吹打樣品I分鐘。9.加入IOml含10% FBS的DMEM，用40-70 u m孔徑的過(guò)濾器過(guò)濾細(xì)胞懸液，收集過(guò)濾后的細(xì)胞懸液，低速IOOOrmp離心5分鐘，去除上清。10.重懸細(xì)胞沉淀于HL培養(yǎng)基中，接種于T25或175的培養(yǎng)瓶中按本發(fā)明的任一方案(見圖1-4)培養(yǎng)。實(shí)施例6.飼養(yǎng)細(xì)胞/上皮細(xì)胞的直接共培養(yǎng)(見圖4和圖6) 上述絲裂酶素C處理或放射線照射的飼養(yǎng)細(xì)胞(失去分裂能力的Swiss3T3細(xì)胞)作為飼養(yǎng)層與上皮細(xì)胞的共培養(yǎng)按以下三種方式進(jìn)行I.直接飼養(yǎng)細(xì)胞/上皮細(xì)胞共培養(yǎng)。加入溫浴的IxPBS洗飼養(yǎng)細(xì)胞沉淀I次，再次離心，將細(xì)胞懸于HL培養(yǎng)基中，以I : 3比例將飼養(yǎng)細(xì)胞與一定數(shù)量的上皮細(xì)胞混懸于HL培養(yǎng)基中，上皮細(xì)胞最適接種濃度為2. 5 X IO5個(gè)/IOOmm的培養(yǎng)皿，將培養(yǎng)瓶置于37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)。2.飼養(yǎng)細(xì)胞先行貼壁，再加入上皮細(xì)胞共培養(yǎng)。將上述絲裂酶素C處理或放射線照射的飼養(yǎng)細(xì)胞懸于完全DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的DMEM)，以I : 3的比例接種于培養(yǎng)皿中，37°C培養(yǎng)2-3小時(shí)或過(guò)夜，用溫浴的IxPBS洗細(xì)胞2次，換成HL培養(yǎng)基，再將上皮細(xì)胞接種于含飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，上皮細(xì)胞最適接種濃度為2. 5 X IO5個(gè)/IOOmm的培養(yǎng)皿，貼壁的飼養(yǎng)細(xì)胞可于3-5天任何時(shí)間內(nèi)使用。將培養(yǎng)瓶置于37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)。3.飼養(yǎng)細(xì)胞在4°C或液氮貯存?zhèn)溆?。將上述絲裂酶素C處理或放射線照射的飼養(yǎng)細(xì)胞懸于完全DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的DMEM)存于4°C (1-7天)或長(zhǎng)期儲(chǔ)存于液氮，復(fù)蘇后按上述方法2進(jìn)行與上皮細(xì)胞的共培養(yǎng)(HL培養(yǎng)基中)。上皮細(xì)胞最適接種濃度為2. 5X IO5個(gè)/IOOmm的培養(yǎng)皿。將培養(yǎng)瓶置于37°C，5% C02條件下培養(yǎng)。不論以上述哪種方式的共培養(yǎng)，第二天應(yīng)更換新鮮的HL培養(yǎng)基。當(dāng)多于50%的飼養(yǎng)細(xì)胞脫落時(shí)，應(yīng)補(bǔ)充新鮮的上述絲裂酶素C處理或放射線照射的飼養(yǎng)細(xì)胞，直到上皮細(xì)胞生長(zhǎng)至70-90%豐度需要傳代時(shí)。實(shí)施例7.飼養(yǎng)細(xì)胞/上皮細(xì)胞的分離傳代I.上皮細(xì)胞生長(zhǎng)至70-90%豐度，吸出培養(yǎng)基，用溫浴的PBS洗I次，2.吸出PBS，加入10-12mL溫浴的含0. 02% EDTA (0. 68mM)的PBS洗滌細(xì)胞，以去除飼養(yǎng)細(xì)胞Swiss 3T3 ;特別注意，洗滌細(xì)胞需盡量快速，先將EDTA溶液加到培養(yǎng)皿外周的細(xì)胞，旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)培養(yǎng)皿，然后再使EDTA溶液回旋至培養(yǎng)皿內(nèi)周的細(xì)胞，重復(fù)回旋洗滌細(xì)胞10次。3.吸出EDTA洗液，再次加入0.02% EDTA至培養(yǎng)皿內(nèi)側(cè)的細(xì)胞，旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)培養(yǎng)皿，然后使EDTA溶液回旋至培養(yǎng)皿外側(cè)的細(xì)胞，重復(fù)回旋洗滌細(xì)胞30次。通常人的角質(zhì)上皮細(xì)胞需要40次EDTA洗滌，其它細(xì)胞根據(jù)貼壁緊密程度不同，可適當(dāng)調(diào)整洗滌次數(shù)。4.吸出EDTA洗液，加入溫浴的PBS洗3次，始終保持培養(yǎng)皿傾斜。最后一次洗滌液吸出之前，在顯微鏡下觀察，確認(rèn)所有飼養(yǎng)細(xì)胞Swiss 3T3已經(jīng)被完全洗掉，否則，需再次增加H)TA洗滌次數(shù)。5.采用常規(guī)胰酶方法消化上皮細(xì)胞，對(duì)于角質(zhì)上皮細(xì)胞而言，胰酶常溫消化2分鐘，吸出消化液，再次于37°C胰酶消化5分鐘，輕拍培養(yǎng)皿使細(xì)胞分散，重懸細(xì)胞于HL培養(yǎng)基中。然后接種上皮細(xì)胞于絲裂霉素C或放射線處理過(guò)的飼養(yǎng)細(xì)胞上，最適細(xì)胞接種密度為2. 5 X IO5個(gè)/IOOmm的培養(yǎng)皿； 7.必要時(shí)可將I X IO6上皮細(xì)胞重懸于l_2ml的細(xì)胞凍存液(90%胎牛血清和10%DMS0)中，儲(chǔ)存于液氮中備用。實(shí)施例8.飼養(yǎng)細(xì)胞條件培養(yǎng)基的制備和上皮細(xì)胞的培養(yǎng)傳代(見圖2和圖6)按照?qǐng)D2，將上述絲裂酶素C處理或放射線照射的飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)于HL培養(yǎng)基中(T75 培養(yǎng)瓶2X IO6 細(xì)胞，15ml HL培養(yǎng)基；T175 :5X IO6 細(xì)胞，35mlHL培養(yǎng)基)在 37°C、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。收集培養(yǎng)基，2000rpm離心15分鐘，經(jīng)0. 22 U濾膜過(guò)濾，按I 5比例(可按I : 99-99 I優(yōu)化)與新鮮配制的HL培養(yǎng)基混合即得到HL條件培養(yǎng)基。將分離制備的原代細(xì)胞懸液或者傳代細(xì)胞直接于HL條件培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是37°C、5% C02。當(dāng)細(xì)胞增殖至70-90%豐度時(shí)，IxPBS洗滌細(xì)胞兩次，0. 05%胰酶/EDTA消化單層細(xì)胞2-5分鐘，IOml完全的DMEM中和消化反應(yīng)，IOOOrmp離心5分鐘，去上清，以一定比例(I 2,1 3,1 4,1 5均可，只要可以維持細(xì)胞貼壁和正常生長(zhǎng))重懸細(xì)胞沉淀于IOml HL條件培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)。必要時(shí)可將I X IO6上皮細(xì)胞重懸于l-2ml的細(xì)胞凍存液(90%胎牛血清和10% DMS0)中，儲(chǔ)存于液氮中備用。實(shí)施例9.上皮細(xì)胞/飼養(yǎng)細(xì)胞間接共培養(yǎng)(Transwell培養(yǎng)系統(tǒng))及傳代(見圖3和圖6)按照?qǐng)D3，將上述絲裂酶素C處理或放射線照射的飼養(yǎng)細(xì)胞置于Transwell筐(Transwell insert, Corning公司)中，分離制備的原代細(xì)胞懸液或者傳代細(xì)胞可直接于HL培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是37°C、5% CO20當(dāng)細(xì)胞增殖至70-90%豐度時(shí)，先移去Transwell筐，IxPBS洗滌上皮細(xì)胞兩次，0. 05%胰酶/EDTA消化單層細(xì)胞2_5分鐘，IOml完全的DMEM中和消化反應(yīng)，IOOOrpm離心5分鐘，去上清，以一定比例(I : 2，I : 3，I : 4，I 5均可，只要可以維持細(xì)胞貼壁和正常生長(zhǎng))重懸細(xì)胞沉淀于IOml HL培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)。必要時(shí)可將I X IO6上皮細(xì)胞重懸于l-2ml的細(xì)胞凍存液(90%胎牛血清和10% DMS0)中，儲(chǔ)存于液氣中備用。實(shí)施例10.含血清培養(yǎng)基和無(wú)血清培養(yǎng)基用于上皮細(xì)胞的培養(yǎng)(見圖5)完全的DMEM培養(yǎng)基DMEM，10%胎牛血清(FBS)，100U/ml 青霉素(penicillin)和100 u g/ml 鏈霉素(streptomycin)無(wú)血清培養(yǎng)基無(wú)血清的上皮細(xì)胞培養(yǎng)基SFM(GIBC0#10744_019)，慶大霉素(10 v- g/ml)胰酶消化液0. 05%胰酶/EDTA無(wú)鈣鎂磷酸緩沖液Ca2+，Mg2+free PBS分離制備的原代細(xì)胞懸液或者傳代細(xì)胞直接于上述完全DMEM培養(yǎng)基或無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是37°C、5% C02。當(dāng)細(xì)胞增殖至70-90%豐度時(shí)，IxPBS洗滌細(xì)胞兩次，0. 05%胰酶/EDTA消化單層細(xì)胞2-5分鐘，IOml完全的DMEM培養(yǎng)基中和消化反應(yīng)，IOOOrmp離心5分鐘，去上清，以一定比例(通常是I : 2或I : 3)重懸細(xì)胞沉淀于IOml完全DMEM或無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。必要時(shí)可將I X IO6細(xì)胞重懸于l-2ml的細(xì)胞凍存液(90%胎牛血清和10% DMS0)中，儲(chǔ)存于液氮中備用。還需要說(shuō)明的是，在可實(shí)施且不明顯違背本發(fā)明的主旨的前提下，在本說(shuō)明書中 作為某一技術(shù)方案的構(gòu)成部分所描述的任一技術(shù)特征或技術(shù)特征的組合同樣也可以適用于其它技術(shù)方案；并且，在可實(shí)施且不明顯違背本發(fā)明的主旨的前提下，作為不同技術(shù)方案的構(gòu)成部分所描述的技術(shù)特征之間也可以以任意方式進(jìn)行組合，來(lái)構(gòu)成其它技術(shù)方案。本發(fā)明也包含在上述情況下通過(guò)組合而得到的技術(shù)方案，并且這些技術(shù)方案相當(dāng)于記載在本說(shuō)明書中。以上通過(guò)具體實(shí)施方式
和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了說(shuō)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，這些并非意圖對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，本發(fā)明的范圍應(yīng)由權(quán)利要求書確定。工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)用試劑盒、上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法以及通過(guò)該方法獲得的上皮細(xì)胞可以廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)細(xì)胞生物學(xué)研究、腫瘤研究、衰老研究、新藥研發(fā)、基因治療、體外轉(zhuǎn)基因和基因敲除研究、組織再生、臨床再生醫(yī)學(xué)、臨床個(gè)性化治療、分子及遺傳流行病學(xué)研究等各個(gè)領(lǐng)域。
權(quán)利要求
1.一種培養(yǎng)基,其包含血清，鈣成分，和ROCK抑制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的培養(yǎng)基，其中，該培養(yǎng)基還包含飼養(yǎng)細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的培養(yǎng)基，其中，該培養(yǎng)基中包含條件培養(yǎng)基。
4.一種試劑盒，其包含培養(yǎng)基、血清和ROCK抑制劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其還包含飼養(yǎng)細(xì)胞。
6.一種試劑盒，其包含權(quán)利要求I 3中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基和飼養(yǎng)細(xì)胞。
7.—種培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法,該方法包括步驟A :使用權(quán)利要求I 3中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基將上皮細(xì)胞與飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)。
8.—種培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法,該方法包括步驟B :使用權(quán)利要求2或3所述的培養(yǎng)基培養(yǎng)上皮細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)用試劑盒及細(xì)胞培養(yǎng)方法，特別是用于上皮細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)用試劑盒及細(xì)胞培養(yǎng)方法。所述培養(yǎng)基包含血清、鈣成分和ROCK抑制劑。
文檔編號(hào)C12N5/07GK102787093SQ20111024365
公開日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2011年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月17日
發(fā)明者李暉 申請(qǐng)人:李暉