專利名稱：一種鴨瘟病毒檢測(cè)用引物組及其構(gòu)成的lamp反應(yīng)體系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鴨瘟病毒檢測(cè)用引物組及其構(gòu)成的LAMP反應(yīng)體系。
背景技術(shù)：
鴨瘟(Duck Plague，DP)，又名鴨病毒性腸炎，是由鴨腸炎病毒(Duck Enteritis virus, DEV)引起的鴨、鵝、天鵝等雁形目禽類的一種急性敗血性及高度致死性的病毒性傳染病。鴨瘟病毒屬皰疹病毒科α-皰疹病毒亞科，球形有囊膜，直徑約為160 180 nm，衣殼為二十面體對(duì)稱，是一種泛嗜性感染的病毒(Kaleta，1990)。該病毒主要由核心(core)、 衣殼(capsid)、外膜(tegument)、囊膜(envelope)四部分組成，病毒核酸為線狀、雙股DNA。 衣殼的形態(tài)結(jié)構(gòu)具有皰疹病毒的重要特征，它由162個(gè)相互連接呈放射狀排列且有中空軸孔的殼粒組成。核衣殼穿過(guò)宿主細(xì)胞核膜進(jìn)入胞漿或其空泡中，外面包上一層由蛋白質(zhì)組成的外膜，最后繞以囊膜形成成熟的子病毒(陳建君，2003)。病毒的囊膜表面無(wú)紅細(xì)胞凝集素，不具血凝特性和血細(xì)胞吸附作用。鴨瘟病毒對(duì)熱敏感，56 °C作用10 min會(huì)喪失感染力， 80 °C作用5 min即可死亡。此外，該病毒對(duì)乙醚和氯仿敏感。用胰蛋白酶和脂肪酶等處理能使病毒部分失活或者完全失活，在PH值為3的酸性和pH值為11的堿性環(huán)境中也很快失活。鴨瘟分布廣泛，具有傳播迅速、發(fā)病率高和死亡率大的特點(diǎn)。1923年Baudet首次報(bào)道荷蘭的家鴨暴發(fā)鴨瘟后，各養(yǎng)鴨國(guó)家和地區(qū)陸續(xù)報(bào)導(dǎo)有該病的發(fā)生和流行。我國(guó)于 1957年首次報(bào)道暴發(fā)鴨瘟，隨后該病在華南、華中和華東等養(yǎng)鴨較多的地區(qū)開(kāi)始流行，是嚴(yán)重威脅養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展的重要傳染病之一。鴨瘟潛伏期約2 5d，臨診特征為病初體溫升高，兩腳發(fā)軟無(wú)力，綠色下痢，流淚； 食道黏膜有小出血點(diǎn)，并有灰黃色假膜覆蓋或潰瘍，泄殖腔黏膜充血、出血、水腫和壞死；肝臟有大小不等的壞死灶及出血點(diǎn)；部分病鴨可見(jiàn)頭頸部粗腫，俗稱“大頭瘟”。病鴨后期體溫下降，衰竭死亡，死亡率可達(dá)90%以上，少數(shù)耐過(guò)的病鴨表現(xiàn)為生長(zhǎng)不良和消瘦，眼角膜混濁或形成角膜潰瘍而失明(王春雨，2008 )。病毒可在9 14 d鴨胚中生長(zhǎng)繁殖，并可引起胚胎死亡。致死的胚體出血，水腫，肝出血、壞死，部分絨毛尿囊膜上有灰白色壞死灶。病毒適應(yīng)鴨胚后也可感染雞胚，可在鴨胚成纖維細(xì)胞和雞胚成纖維細(xì)胞中增殖傳代，產(chǎn)生蝕斑并形成核內(nèi)包涵體(董嘉文等， 2009)。快速準(zhǔn)確地診斷病原是控制鴨瘟流行的前提。鴨瘟病毒只有一種血清型，雖然各毒株之間的毒力存在差異，但在免疫學(xué)特性上都高度近似(董嘉文等，2009 )。適用于鴨瘟病毒常規(guī)的血清學(xué)診斷方法主要有病毒分離與中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定、間接血凝試驗(yàn)等方法，但這些檢測(cè)技術(shù)都不同程度地存在實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜、敏感性低、檢出率不高等缺陷，加之鴨瘟感染病程發(fā)展迅速，急需建立更加快速、特異和敏感的檢測(cè)方法
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供一種鴨瘟病毒檢測(cè)用引物組。本發(fā)明的另一目的是提供由上述引物組構(gòu)成的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)反應(yīng)體系。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的 一種鴨瘟病毒檢測(cè)用引物組，具體組成如下 正向外側(cè)引物F3 =SEQ ID N0:1 ；
反向外側(cè)引物B3 =SEQ ID NO:2 ； 正向內(nèi)側(cè)引物FIP :SEQ ID NO:3 ； 反向內(nèi)側(cè)引物BIP :SEQ ID N0:4。本發(fā)明所述鴨瘟病毒，是指鴨腸炎病毒(Duck Enteritis virus，DEV)。以上引物組是通過(guò)Blast、MegAlign和DNAMar程序篩選出的DEV UL6蛋白基因的保守序列(GenBank: AY995224. 1, 2198-2435)作為模板，用 Primer Explorer V4 軟件設(shè)計(jì)所得。該引物組包括兩條內(nèi)引物(FIP和BIP)和兩條外引物(F3和B3)，內(nèi)引物FIP由Flc (TCCAGAGGATGGTTTGTCCCGT,SEQ ID N0:5)禾口 F2 (ATGTATCATGGACGGCGGT,SEQ ID NO:6)組成，為利于后續(xù)擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切鑒定，BIP由Blc(CAGCGAGTGGGAACGAAAAGC，SEQ ID NO: 7)、 B2 (TCGCACATTAGACGCGGTATC, SEQ ID NO 8)禾口 GAATTC (.EcoR I 酶切位點(diǎn)序列)作為連接子組成。鴨瘟病毒的引物設(shè)計(jì)比較復(fù)雜，且對(duì)引物擴(kuò)增區(qū)的要求較高。所以引物設(shè)計(jì)沒(méi)有普通引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，要設(shè)計(jì)出優(yōu)良的引物，需要在各種生物信息軟件評(píng)估的基礎(chǔ)上進(jìn)行費(fèi)時(shí)的篩選。由于所設(shè)計(jì)的引物具有高度的選擇特異性，在進(jìn)行病原檢測(cè)時(shí)，要求引物所針對(duì)的靶序列位點(diǎn)應(yīng)該相當(dāng)保守，這樣所建立的方法才具有適用性。研究中也可以設(shè)計(jì)一些兼并引物以增強(qiáng)其應(yīng)用的廣泛性，但兼并度高的引物會(huì)對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)造成負(fù)面影響。靶序列長(zhǎng)度應(yīng)控制在200 bp左右，才有利于擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行，過(guò)長(zhǎng)會(huì)給反應(yīng)起始物的形成與后期循環(huán)反應(yīng)帶來(lái)困難，有時(shí)甚至在1 h內(nèi)沒(méi)有明顯擴(kuò)增。對(duì)于一些具有GC含量高、變異性強(qiáng)、保守區(qū)離散等特點(diǎn)的目的序列，沒(méi)有辦法設(shè)計(jì)出非常適用的引物，使LAMP技術(shù)的應(yīng)用受到限制。由于LAMP產(chǎn)物的獨(dú)特性給線性雙鏈DNA的分離增加了難度，更加有效的分離方法有待于進(jìn)一步的研究。產(chǎn)物電泳圖為梯狀拖帶圖樣，一旦出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增就不易被察覺(jué)， 所以用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行鑒定就顯得十分必要。該技術(shù)非常適用于鑒定某種基因的存在， 但擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)于基因克隆與測(cè)序意義不大。因此，在分子生物學(xué)領(lǐng)域，LAMP技術(shù)在疾病診斷、性別鑒定與食品安全有著比常規(guī)PCR技術(shù)更出色的表現(xiàn)，但在很多方面，如基因序列確定、文庫(kù)建立，是無(wú)法取代傳統(tǒng)PCR技術(shù)的。一種檢測(cè)鴨瘟病毒的LAMP反應(yīng)體系，其特征在于該反應(yīng)體系包括反應(yīng)緩沖液 (200 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 20 mM MgSO4, 100 mM (NH4)2SO4, 1% Triton X-100)， dNTPs (包括等比例的 dATPs、dTTPs、dGTPs 和 dCTPs)，上述引物組(F3、B3、FIP 和 BIP)，Mg2+ (一般用MgSO4),甜菜堿(Betaine)，Bst DNA聚合酶，待檢樣品基因組DNA和去離子水。Mg2+穩(wěn)定堿基配對(duì)，維持聚合酶的反應(yīng)活性都有重要作用，它對(duì)LAMP的影響方式與PCR的相同，濃度太高或太低都使反應(yīng)無(wú)法進(jìn)行或時(shí)間延長(zhǎng)同時(shí)反應(yīng)過(guò)程中焦磷酸鎂沉淀的析出使反應(yīng)體系中Mg2+的濃度不斷下降，因此摸索Mg2+最佳濃度很有意義。經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)篩選，LAMP反應(yīng)體系中Mg2+濃度優(yōu)選4 7 mM，最佳為5 mM。甜菜堿濃度最佳為0. 4 M0 dNTPs 濃度為 1. 2 mM(即 dATPs、dTTPs、dGTPs 和 dCTPs 的濃度均為1. 2 mM)。作為一種優(yōu)選方案，本發(fā)明的LAMP反應(yīng)體系為每25PL中含有以下組分 IO反應(yīng)緩沖液2.5 pL
dNTPs (10 mM)3 μ
FIP (10 μΜ)2“L
BP (10 μΜ)2 μ
F3 (10 μΜ)0.5 pL
Β3 (10 μΜ)0.5 pL。
MgSO4 (25 mM)3 μ
甜菜堿(0.4 Μ)2.5 μ!
Bst DNA 聚合賄1 μΙ-
待檢樣品基因組DNA1 μ ·
去離子水加至25 μ ο本發(fā)明的檢測(cè)鴨瘟病毒的LAMP反應(yīng)體系的使用方法，優(yōu)選反應(yīng)溫度為62°C，反應(yīng)時(shí)間為50 mim。本發(fā)明的反應(yīng)體系可以進(jìn)行簡(jiǎn)化的反應(yīng)步驟，即將反應(yīng)體系所需各組分混合完畢，放置于恒溫水浴鍋進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)完畢后可憑借液體渾濁度肉眼判定擴(kuò)增結(jié)果，渾濁管偉陽(yáng)性，清亮管為陰性，也可加入STOR Green I進(jìn)行核酸染色，亮綠色為陽(yáng)性，保留染料初始棕紅色為陰性。簡(jiǎn)化步驟中反應(yīng)體系最好用前現(xiàn)配，避免反應(yīng)緩沖液失效造成假陽(yáng)性。為避免反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)帶來(lái)交叉污染和殘留污染，反應(yīng)體系配置完畢后每管添加惰性液體礦物油30 μ L，以起到液封反應(yīng)液的作用。上述LAMP反應(yīng)體系用于檢測(cè)鴨瘟病毒可以通過(guò)在反應(yīng)產(chǎn)物中加入熒光顯色劑 SYBR green I，根據(jù)反應(yīng)顏色直接觀察，如果反應(yīng)產(chǎn)物溶液變?yōu)椴菥G色，則檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，表明有鴨瘟病毒，如果反應(yīng)產(chǎn)物溶液為橙黃色，則為陰性?；蛘邔⒎磻?yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳，如果電泳結(jié)果在195 bp, 255 bp和310 bp處出現(xiàn)條帶，則檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
(1)只需要在恒定溫度下就能進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，可以直接使用水浴鍋進(jìn)行反應(yīng)。不需要預(yù)先進(jìn)行雙鏈DNA的變性及類似于PCR循環(huán)反應(yīng)中的反復(fù)變性、退火、延伸等變溫過(guò)程。(2)高特異性應(yīng)用四條引物識(shí)別目的片段的六個(gè)區(qū)域，并且這六個(gè)區(qū)域的順序、 長(zhǎng)短、退火溫度都有相應(yīng)要求。理論上LAMP法擴(kuò)增的特異性很高，可以根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷目標(biāo)基因的存在與否，可應(yīng)用于遺傳背景相似的細(xì)菌或病毒的分型定性檢測(cè)。(3)擴(kuò)增反應(yīng)快速、高效整個(gè)擴(kuò)增在不到1 h即可完成，且產(chǎn)率可達(dá)到0. 15 mg/ mL。為提高LAMP反應(yīng)的速度。
(4)靈敏度高擴(kuò)增模板可達(dá)10拷貝，比常規(guī)PCR法高1至3個(gè)數(shù)量級(jí)。本研究中，LAMP方法比PCR方法要敏感100倍。(5)步驟簡(jiǎn)單擴(kuò)增DNA可在反應(yīng)體系配置完畢后放置恒溫水浴鍋進(jìn)行反應(yīng)，擴(kuò)增RNA只要在DNA基因擴(kuò)增試劑的基礎(chǔ)上加上逆轉(zhuǎn)錄酶，進(jìn)行短暫的反轉(zhuǎn)錄時(shí)間后就能夠完全如DNA基因擴(kuò)增一樣，一步法實(shí)現(xiàn)RNA擴(kuò)增(Hiroko et al. ,2006 ；Soliman et al.， 2006 ；Kazuya et al.，2007)，RT-LAMP反應(yīng)同樣不需PCR儀和其他特殊試劑。(6)鑒定簡(jiǎn)便在核酸大量合成時(shí)，添加核酸染色劑STOR green I，可根據(jù)反應(yīng)液顏色變化直觀明了地判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。高效擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的 Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物(焦磷酸鎂沉淀)，通過(guò)肉眼觀察或濁度儀檢測(cè)沉淀濁度就能夠判斷擴(kuò)增與否。雖然僅靠這些判斷并不準(zhǔn)確，也不能排除非特異性擴(kuò)增，但結(jié)果的可視觀察可以脫離凝膠成像的操作要求和儀器限制，加上擴(kuò)增是等溫進(jìn)行，不用依賴PCR儀復(fù)雜的循環(huán)溫度變化來(lái)完成，在水浴鍋中就能進(jìn)行，這些都使該技術(shù)在小型研究所、獸醫(yī)站乃至普通養(yǎng)殖戶有著更廣闊的應(yīng)用前景。


圖1 DEV UL6基因保守區(qū)LAMP擴(kuò)增電泳圖，M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 ；1為DEV 弱毒苗株的擴(kuò)增結(jié)果；2為陰性對(duì)照。圖2.自然光下LAMP產(chǎn)物的沉淀可視結(jié)果，a為陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物管，顯渾濁；b為陰性對(duì)照。圖3.自然光下LAMP產(chǎn)物添加核酸染料變色結(jié)果，其中a為陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物管，顯示草綠色；b為陰性對(duì)照，顯示橙黃色。圖4.在不同反應(yīng)溫度下LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖，M :DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 ；泳道1 5依次分別為在61 0C >62 0C >63 °C >64 °C >65 °C條件下DEV基因DNA的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物；N為陰性對(duì)照。圖5.選擇不同Mg2+濃度時(shí)LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果圖，M :DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) DL2000 ；泳道 1 8 從左到右依次是 MgSO4 濃度為 7 mM、6 mM、5 mM、4 mM、3 mM、2 mM、l mM、 0 mM時(shí)的LAMP擴(kuò)增；N為陰性對(duì)照。圖6.選擇不同甜菜堿濃度的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果圖，M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) DL2000 ；泳道1 6依次是甜菜堿濃度為0 M、0. 2 M、0. 4 M、0. 6 M、0. 8 M、1 M時(shí)的LAMP擴(kuò)增；N為陰性對(duì)照。圖7.選擇不同dNIPs濃度時(shí)LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果圖，M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) DL2000 ；泳道 1 6 依次是MgSO4 濃度為 1. 6 mM、1.4 mM、1.2 mM、1.0 mM、0. 8 mM、0. 6 mM 時(shí)的LAMP擴(kuò)增；N為陰性對(duì)照。圖8.不同反應(yīng)時(shí)間LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果圖，M :DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 ；泳道1 4分別為DEV基因在反應(yīng)60 min、50 min、40 min、30 min后的LAMP擴(kuò)增結(jié)果，N為陰性對(duì)照。圖9. DEV LAMP反應(yīng)特異性試驗(yàn)電泳結(jié)果圖，M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 ；泳道1 6從左到右分別為DEV LAMP引物檢測(cè)DEV、MDV、MDPV, DHV I、H9 AIV和MDRV的結(jié)果。圖10. DEV LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的酶切鑒定電泳圖，M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 ；泳道1
6為終產(chǎn)物；2為內(nèi)切酶I消化后的結(jié)果。圖11. DEV LAMP反應(yīng)的靈敏度試驗(yàn)電泳圖，M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 ；圖a泳道 Γ8分別為模板稀釋至ΙΟ—^ΙΟΛΙΟΛΙΟΛΙΟΛΙΟΛΙΟ—^ΙΟ—8倍的LAMP檢測(cè)結(jié)果，圖b泳道1 8分別為模板稀釋至10人10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、10_7、10_8倍的常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中如無(wú)特殊說(shuō)明，均為本領(lǐng)域常規(guī)實(shí)驗(yàn)試劑和常規(guī)操作步驟。實(shí)施例1鴨瘟病毒獲取及鑒定 1.材料
1.1病毒和病料
鴨瘟弱毒疫苗株由廣東溫氏食品集團(tuán)禽病室提供。對(duì)照病原禽傳染性喉氣管炎陽(yáng)性毒株(ILTV)、番鴨細(xì)小陽(yáng)性毒株(MDPV)、H9亞型禽流感病毒抗原(H9 AIV)、鴨病毒性肝炎I型毒株(DHV I )和番鴨呼腸孤病毒株(MDRV) 為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院家禽研究室分離保存。15份病死鴨及發(fā)病鴨內(nèi)臟組織由中山獸醫(yī)防疫監(jiān)督所、廣東溫氏食品集團(tuán)莆田分公司提供。1. 2 鴨胚
13 14日齡非免疫鴨胚由廣東溫氏食品集團(tuán)莆田分公司提供。1. 3主要試劑
Bst DNA聚合酶(8 U/μ L)及配套緩沖液為NEB公司產(chǎn)品；AMV反轉(zhuǎn)錄酶(5 U/yL)、 HRP RNA 酶抑制劑(40 U/μ L)及相應(yīng)緩沖液、Ex Taq DNA 聚合酶(5 U/μ L), dNTPs (2.5 mM each)、^boR I (15 U/μ L)、DNA Marker DL 2000 均為 TaKaRa 產(chǎn)品。DNA Mark DL 2000 :2000、1000、750、500、250、100 bp。DNA提取試劑盒ChargeSwitch gDNA為hvitrogen公司產(chǎn)品；RNA提取試劑 TRIzol ReagentShvitrogen公司產(chǎn)品；DEPC和飽和酚購(gòu)自上海生工生物工程公司；甜菜堿betaine購(gòu)自Sigma公司；10000 X STOR Green I購(gòu)自百維信生物科技有限公司；氨芐青霉素、鏈霉素、溴化乙錠(EB)購(gòu)自寶泰克生物科技有限公司；瓊脂糖購(gòu)自基因有限公司。1. 4常用溶液
PBS 緩沖溶液(pH 7. 2) =KH2PO4 0. 2 g, Na2HPO4 · 12H20 2. 85 g, NaCl 8 g，KCl 0.2 g 力口超純水定容至1000 mL。無(wú)RNA酶的DEPC水按1 1000的比例將DEPC加入超純水，室溫放置12 h以上，
高壓滅菌。50XTAE =Tris 堿 M2 g, Na2EDTA 37. 2 g，冰醋酸 57. 1 mL，加超純水定容至 1000 mL。使用液為IX TAE溶液。1. 5主要儀器及設(shè)備
PCR Express Gradient PCR儀，法國(guó)HYBAID公司產(chǎn)品；水浴鍋，上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；凝膠成像及分析系統(tǒng)，法國(guó)VL產(chǎn)品；Allegra TM 64R centrifuge臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，BECKMAN公司產(chǎn)品；AIR-TECH醫(yī)用超凈工作臺(tái)，上海沙瀘凈化設(shè)備廠產(chǎn)品；METTLER TOLEDO AB204-E分析天平，梅特勒托利多儀器，上海有限公司。
2.方法與結(jié)果
2. 1病毒分離鑒定病毒分離與繁殖
病死鴨與發(fā)病鴨肝脾組織加無(wú)菌IXPBS漂洗去除多余血液與雜物，加液氮研磨成糜， 加入含青霉素2000 IU/mL、鏈霉素1000 IU/mL的PBS制成20% (W/V)懸液，反復(fù)凍融三次，37 °C作用30 min,5000 rpm離心10 min，取上清0. 2 mL以尿囊腔途徑接種14日齡未免疫的鴨胚，0.2 mL/胚，每病料接種兩個(gè)胚蛋，另設(shè)兩胚接種0.2 mL PBS作為對(duì)照，隨后放置在38 ！恒溫箱繼續(xù)孵育，每隔12 h照蛋1次，棄去對(duì)h內(nèi)死亡胚蛋，無(wú)菌收獲72 96 h內(nèi)感染胚尿囊液，用于核酸抽提，然后用PCR法進(jìn)行鑒定，余下-80 °C保存?zhèn)溆谩＝Y(jié)果病料上清液接種于30枚鴨胚，24 h內(nèi)無(wú)鴨胚死亡，48 h后陸續(xù)死亡，主要集中于接種后3 5 d，最終死亡率達(dá)100 %，接種PBS胚體發(fā)育正常。將死胚置4 °C冰箱過(guò)夜，收取尿囊液。死亡胚的胚液清亮，絨毛尿囊膜增厚，有出血點(diǎn)，胚體全身出血。病毒鑒定的提取
總DNA的提取使用ChargeSwitch gDNA試劑盒(美國(guó))。提取出的DNA片段置于100 μ 洗脫緩沖液并儲(chǔ)存在-20 °C，備用。具體操作過(guò)程如下
(1)先將250μ 尿囊液加200 μ L緩沖液GA，振蕩至徹底懸??；
(2)加入20μ L蛋白酶K (20 mg/μ L)，混勻，進(jìn)行下一步；
(3)加入220μ L緩沖液GB，充分顛倒混勻，70 °C放置10 min，簡(jiǎn)短離心以除去管蓋內(nèi)壁的水珠；
(4)加220μ L無(wú)水乙醇，充分振蕩混勻15 sec，簡(jiǎn)短離心以除去管蓋內(nèi)壁的水
珠；
(5)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000 rpm離心1 min倒掉廢液，吸附柱CB3放回收集管中；
(6)向吸附柱CB3中加入500 μ L去蛋白液⑶，12000 rpm離心1 min，棄廢液，吸附柱 CB3放回收集管中；
(7)向吸附柱CB3中加入700μ L漂洗液PW，12000 rpm離心1 min，棄廢液，吸附柱CB3放回收集管中；
(8)向吸附柱CB3中加入700μ L漂洗液PW，12000 rpm離心1 min，棄廢液；
(9)將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm離心2 min。將吸附柱CB3置于50 V 恒溫箱放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；
(10)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100μ L 經(jīng)65 70 ！水浴預(yù)熱的洗脫緩沖液ΤΕ，室溫放置2 5 min, 12000 rpm離心30 sec ；
(11)離心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室溫放置2min, 12000 rpm離心^iiin。抽提所得到的病毒DNA樣品保存于-20 °C冰箱。運(yùn)用PCR技術(shù)鑒定DEV
所用弓丨物對(duì) DEV-F :5，-GTAGACGAAGGCGGGTATG-3，(SEQ ID NO:9)與 DEV-R 5‘-CGTATTGGTTTCTGAGTTGG-3‘ (SEQ ID NO: 10)針對(duì)鴨癌病毒UL31基因設(shè)計(jì)，理論擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為563 bp。PCR反應(yīng)體系(20 μι)包括1 μ DNA模板，0.25 mM DEV上下游引物，2μ 10XPCR buffer, 2. 5 mM dNTPs mixture (1 μ ), 15. 5 μ ddH20 和 1· 5 U Ex Taq DNA 聚合酶。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 °C預(yù)變性3 min ；94 °C變性40 sec,53 °C退火40 sec,72 V 延伸40 sec，共反應(yīng)30個(gè)循環(huán)；隨后進(jìn)行72 °C延伸10 min。結(jié)果以30枚病死鴨胚與正常鴨胚尿囊液抽提的DNA為模板進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果判定有6個(gè)病樣接種胚(12枚鴨胚)呈現(xiàn)陽(yáng)性，初步判定獲得6株鴨瘟病毒。實(shí)施例2鴨瘟病毒LAMP檢測(cè)方法的建立引物設(shè)計(jì)與合成
通過(guò)Blast、MegAlign和DNAMar程序選擇了鴨瘟病毒UL6蛋白基因的保守段，并應(yīng)用 Primer Explorer V4軟件分別設(shè)計(jì)4條引物，其中包括兩條內(nèi)引物(FIP和BIP)和兩條外引物(F3和B3)，內(nèi)引物FIP由Flc、F2組成，為利于后續(xù)擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切鑒定，BIP由Blc、 B2和GAATTC CFcoR I酶切位點(diǎn)序列)作為連接子組成。本試驗(yàn)還利用了診斷鴨瘟病毒的 PCR引物對(duì)DEV-F與DEV-R，用于PCR檢測(cè)方法與新建立LAMP檢測(cè)方法的比較，所有引物由北京奧科生物工程公司合成。合成后的引物用超純水稀釋成10 mmol/mL溶液，-20 ！保存。引物序列如下
表1. 1 DEV檢測(cè)用LAMP引物
權(quán)利要求
1.一種鴨瘟病毒檢測(cè)用引物組，其特征在于，所述引物組組分如下正向外側(cè)引物F3 =SEQ ID N0:1 ；反向外側(cè)引物B3 =SEQ ID NO:2 ；正向內(nèi)側(cè)引物FIP :SEQ ID NO:3 ；反向內(nèi)側(cè)引物BIP :SEQ ID N0:4。
2.一種檢測(cè)鴨瘟病毒的LAMP反應(yīng)體系，其特征在于該反應(yīng)體系包括反應(yīng)緩沖液， dNTPs，權(quán)利要求1所述引物組，Mg2+，甜菜堿，Bst DNA聚合酶，待檢樣品基因組DNA和去離子水。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測(cè)鴨瘟病毒的LAMP反應(yīng)體系，其特征在于LAMP反應(yīng)體系中 Mg2+濃度為5 mM。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測(cè)鴨瘟病毒的LAMP反應(yīng)體系，其特征在于LAMP反應(yīng)體系中甜菜堿濃度為0. 4 M0
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測(cè)鴨瘟病毒的LAMP反應(yīng)體系，其特征在于LAMP反應(yīng)體系中 dNTPs終濃度為1. 2 mM。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測(cè)鴨瘟病毒的LAMP反應(yīng)體系，其特征在于每25PL中含有以下組分10 X 反應(yīng)緩沖液 2. 5 μ , dNTPs (10 mM) 3 μ , FIP (10 μΜ) 2 μ , BIP (10 μΜ) 2 μ , F3 (10 μΜ) 0. 5 μ , Β3 (10 μΜ) 0. 5 μ , MgSO4 (25 mM) 3 41^，甜菜堿(0.4 Μ) 2. 5 μ , Bst DNA聚合酶1 μ ，待檢樣品基因組DNA 1 μ ，去離子水加至25 μ 。
7.權(quán)利要求2飛所述任意一項(xiàng)檢測(cè)鴨瘟病毒的LAMP反應(yīng)體系的使用方法，其特征在于 LAMP的反應(yīng)溫度為62°C，反應(yīng)時(shí)間為50 mim。
8.權(quán)利要求2飛所述任意一項(xiàng)檢測(cè)鴨瘟病毒的反應(yīng)體系的使用方法，其特征在于是將反應(yīng)體系所需各組分混合完畢，放置于恒溫水浴鍋進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)完畢后可憑借液體渾濁度肉眼判定擴(kuò)增結(jié)果，渾濁管為陽(yáng)性，清亮管為陰性；或反應(yīng)完畢后加入STOR Green I進(jìn)行核酸染色，亮綠色為陽(yáng)性，保留染料初始棕紅色為陰性。
9.權(quán)利要求8所述檢測(cè)鴨瘟病毒的LAMP反應(yīng)體系的使用方法，其特征在于所述LAMP 反應(yīng)體系使用之前現(xiàn)配，配制完畢后每25PL添加礦物油30μ 。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種鴨瘟病毒檢測(cè)用引物組及其構(gòu)成的LAMP反應(yīng)體系。該檢測(cè)用引物組包括正向外側(cè)引物F3SEQ ID NO:1、反向外側(cè)引物B3SEQ ID NO:2、正向內(nèi)側(cè)引物FIPSEQ ID NO:3和反向內(nèi)側(cè)引物BIPSEQ ID NO:4。由前述引物組成的LAMP反應(yīng)體系，還包括反應(yīng)緩沖液，dNTPs，Mg2+，甜菜堿，BstDNA聚合酶，待檢樣品基因組DNA和去離子水等。該反應(yīng)體系操作方法簡(jiǎn)單，特異性和靈敏度高，檢測(cè)結(jié)果鑒定簡(jiǎn)便，在小型研究所、獸醫(yī)站乃至普通養(yǎng)殖戶有著更廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102304590SQ20111024567
公開(kāi)日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2011年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月25日
發(fā)明者冀君, 孫寶麗, 畢英佐, 謝青梅, 鄒祿生, 馬靜云 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)