專利名稱：檢測輪狀病毒a組的組合物、試劑盒及方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，特別涉及一種特異性檢測病毒的組合物、試劑盒和檢測方法。
背景技術：
輪狀病毒主要感染人體小腸上皮細胞，從而造成細胞損傷，引起腹瀉，病程一般為一周左右，發(fā)熱持續(xù)3天，嘔吐2 3天，腹瀉5天，嚴重者出現(xiàn)脫水癥狀。引起小兒秋冬腹瀉的輪狀病毒主要屬A組，成人輪狀病毒多為B組，A、B組形態(tài)上無法區(qū)分。全世界每年因輪狀病毒A組感染導致的嬰幼兒死亡的人數(shù)大約為90萬人，其中大多數(shù)發(fā)生在發(fā)展中國家。在我國，2歲以內的嬰幼兒約為4000萬人，每年大約1000萬嬰幼兒患輪狀病毒感染性胃腸炎，占嬰幼兒人數(shù)的1/4，是引起嬰幼兒嚴重腹瀉的最主要病原。輪狀病毒為雙鏈RNA病毒，球形顆粒，直徑70nm，結構穩(wěn)定，耐熱，耐酸堿，表面有血凝素，培養(yǎng)較困難。輪狀病毒是由糞口路徑傳播，也有可能經(jīng)由呼吸路徑傳染。受感染者每毫克糞便中可以包含上億個有傳染性的病毒顆粒，其中只要10個到100個病毒顆粒就可以具備傳播和感染能力。輪狀病毒A組在20°C左右活躍，其流行有明顯的季節(jié)性。兒童多集中在每年10月至12月期間感染輪狀病毒，秋冬交接時期尤其要注意謹防小兒感染輪狀病毒。人一生中感染輪狀病毒A組的經(jīng)過大致為第一次感染通常會產(chǎn)生癥狀，感染后， 免疫系統(tǒng)產(chǎn)生部分的保護機制，故下一次感染通常無癥狀。童年獲得的免疫力使大部分的成人對輪狀病毒A組并不易感。兩歲以下兒童的感染癥狀發(fā)生比例最高。雖然新生兒感染的機會很常見，但是通常癥狀溫和或是無癥狀；六個月到兩歲的小孩及存在免疫缺陷的小孩的癥狀最為嚴重。輪狀病毒A組在嬰幼兒之間有很強的傳染性和致病性，為了有效的保護患兒和易感兒童，應做到早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早診斷、早治療，這使輪狀病毒A組的早期診斷方法顯得尤為重要。由于該病毒血清型較多，病毒分離或培養(yǎng)繁雜費時，且費用高，實驗條件高，使以往的病原學診斷受到限制?？乖饦朔z測敏感度低，假陰性高，細胞培養(yǎng)費時費力，不利于快速檢測，并且涉及活的病毒培養(yǎng)，對于操作人員來說具備一定的危險性。近年來針對病毒核酸序列的PCR反應快速檢測技術開始出現(xiàn)。對于PCR檢測來說，引物的選擇至關重要， 直接影響檢測的特異性。如果引物特異性不夠，則可能導致檢測的假陽性結果或者假陰性結果的出現(xiàn)。目前，發(fā)明一種能特異性檢測輪狀病毒A組的物質和方法非常緊迫，但是還沒有相關報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的之一在于針對上述存在的問題，提供一種能特異性檢測輪狀病毒A 組的組合物。本發(fā)明采用的技術方案是這樣的一種檢測輪狀病毒A組的組合物，包括下述引物
Pl :5’ - GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCC -3’，
P2 :5，- AAYTGYGGTATATTCAATACCATACA -3，，其中，Y 為 C 或 T。作為優(yōu)先還包括下述探針
Probe :5’ -熒光報告基團AARGAGCTAWCCGYTAGCCAGACGG -熒光淬滅基團_3’，其中R 為A或G，Y為C或T，W為A或T。發(fā)明人針對病毒特異的靶序列設計Taqman探針，用于檢測病毒時很大程度上保證了結果的特異性
進一步的其中所述熒光報告基團為FAM，所述熒光淬滅基團為ECLIPSE。本發(fā)明的目的之二在于提供一種能特異性檢測輪狀病毒A組的試劑盒。采用的技術方案為一種檢測輪狀病毒A組的試劑盒，包括病毒RNA逆轉錄反應體系、PCR反應體系和上述的組合物。作為優(yōu)選所述PCR反應體系為實時熒光PCR反應體系。本發(fā)明的發(fā)明目的之三在于提供一種能特異性檢測輪狀病毒A組的方法。采用的技術方案為一種檢測輪狀病毒A組的方法，依次包括以下步驟
1)提取樣品中的病毒RNA;
2)使用權利要求1-3中所述的組合物和使用權利要求4或5所述的試劑盒，用PCR 法擴增所述病毒相應核酸序列；
3)反應的結果進行分析上述步驟(2)實時熒光PCR反應的結果進行分析，得出檢測結論。作為優(yōu)選所述的PCR法為實時熒光PCR法。進一步的所述實時熒光PCR反應體系為反應體系為20 μ 1，包括5 X PCR緩沖液 4 ？ lU0mmol/L dNTP 0. 8 l、20 mol/L 引物各 0. 4 ？ 1、10 mol/L 探針各 0. 4 ？ 1、 QIAGEN逆轉錄酶和聚合酶混合物0. 8 1、模板2ul，加滅菌水至終體系20 ？ 1。作為優(yōu)選所述PCR法的循環(huán)參數(shù)為
50°C，逆轉錄30min ；95°C,10min;進入循環(huán)階段95°C變性15s，56°C退火延伸lmin， 共反應40個循環(huán)，退火延伸階段采集熒光信號。綜上所述，由于采用了上述技術方案，本發(fā)明的有益效果是本檢測體系所檢測標本無活病毒，在樣品處理的第一步RNA提取的裂解過程中就可使活病毒迅速死亡，減少了對操作人員的生物危害。本方法無需培養(yǎng)，整個反應在3小時內完成，大大節(jié)省了人力與時間，可用于快速檢測輪狀病毒A組。在更加優(yōu)選的實施方式中，采用本發(fā)明所述的特異性探針，利用TaqMan實時熒光 PCR技術進行檢測，該方法由于自動化程度高，無需開蓋檢測PCR產(chǎn)物，減少了產(chǎn)物污染的機會。利用本發(fā)明的組合物、試劑盒和/或方法對輪狀病毒A組進行檢測時，檢測范圍為 IO8 IO1拷貝基因組當量/反應體系，該檢測快速簡便，整個反應在3小時內完成，并且特異性高，準確度高。


圖1實時熒光PCR檢測體系檢測輪狀病毒RNA的靈敏度對比圖(圖中IO6 IO1為輪狀病毒RNA的拷貝數(shù))；
圖2實時熒光PCR檢測體系對輪狀病毒A組RNA的檢測特異性對比圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明做詳細的說明。需要指出的是，這里列出的實施例僅僅為示例性說明的目的，而不應將其解釋為對本發(fā)明范圍的任何限制。其中使用的試劑盒、緩沖液等試劑僅僅為該具體實施例中具體選擇的試劑，應理解，本領域技術人員可根據(jù)需要選擇其他公司的相應試劑以實現(xiàn)本發(fā)明的目的。為了特異性檢測輪狀病毒A組，發(fā)明人選擇了其基因組特異性序列作為靶標序列，針對該序列設計了特異性引物，并通過大量實驗選擇了最具有特異性的一對引物(Pl 和P2，見下表1)用于本發(fā)明中。在本發(fā)明的一個實施方式中，選擇Pl和P2作為特異性引物，用RT-PCR方法檢測樣品中輪狀病毒A組的RNA的存在。使用該方法，可特異性檢測樣品中輪狀病毒A組的RNA， 進而特異性檢測樣品中輪狀病毒A組的存在，并且在檢測初期就要求裂解使病毒死亡，不會對實驗操作人員造成威脅。優(yōu)選使用熒光實時PCR法檢測，同時整個檢測過程中無需對檢測物開蓋取出進行普通PCR的凝膠電泳，減少了污染，節(jié)約了時間，使檢測和分析更加簡便，縮短了檢測的時間；使用TaqMan技術標記的熒光實時PCR法，該探針為針對該靶標序列特異性探針，增強了檢測的特異性。本發(fā)明中熒光報告基團和熒光淬滅基團可以分別是FAM 禾口 Eclipse。引物和TaqMan探針的設計與合成
利用Genbank的Blast工具對輪狀病毒A組基因組進行分析，選擇其穩(wěn)定的保守區(qū)域作為檢測靶標序列，并針對檢測靶標序列設計引物和探針(見表1)。引物和探針均由日本 TaKaRa大連寶生物公司合成，其中檢測探針5’端標記FAM熒光基團，3’端標記Eclipse熒光淬滅基團。表1引物及探針序列
權利要求
1.一種檢測輪狀病毒A組的組合物，其特征在于包括下述引物Pl :5’ - GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCC -3’，P2 :5，- AAYTGYGGTATATTCAATACCATACA -3，，其中，Y 為 C 或 T。
2.根據(jù)權利要求1所述的檢測輪狀病毒A組的組合物，其特征在于所述的組合物中還包括下述探針Probe :5’ -熒光報告基團AARGAGCTAWCCGYTAGCCAGACGG -熒光淬滅基團_3’，其中R 為A或G，Y為C或T，W為A或T。
3.根據(jù)權利要求2所述的檢測輪狀病毒A組的組合物，其特征在于其中所述熒光報告基團為FAM，所述熒光淬滅基團為Eclipse。
4.一種檢測輪狀病毒A組的試劑盒，其特征在于包括病毒RNA逆轉錄反應體系、PCR 反應體系和權利要求1-3中任一項所述的組合物。
5.根據(jù)權利要求4所述的檢測輪狀病毒A組的試劑盒，其特征在于所述PCR反應體系為實時熒光PCR反應體系。
6.一種檢測輪狀病毒A組的方法，其特征在于依次包括以下步驟提取樣品中的病毒RNA;使用權利要求1-3中所述的組合物和使用權利要求4或5所述的試劑盒，用PCR法擴增所述病毒相應核酸序列；反應的結果進行分析上述步驟(2)實時熒光PCR反應的結果進行分析，得出檢測結論。
7.根據(jù)權利要求6所述的檢測輪狀病毒A組的方法，其特征在于所述的PCR法為實時熒光PCR法。
8.根據(jù)權利要求7所述的檢測輪狀病毒A組的方法，其特征在于所述實時熒光PCR反應體系反應體系為 20 μ 1，包括 5XPCR緩沖液4 ？ lUOmmol/L dNTP 0. 8 l、20 mol/L 引物各0.4 ？ l、10 mol/L探針各0. 4 ？ 1、QIAGEN逆轉錄酶和聚合酶混合物0. 8 1、模板2ul，加滅菌水至終體系20 ？ 1。
9.根據(jù)權利要求6所述的檢測輪狀病毒A組的方法，其特征在于所述PCR法的循環(huán)參數(shù)為50°C，逆轉錄30min ；95°C,10min;進入循環(huán)階段95°C變性15s，56°C退火延伸lmin， 共反應40個循環(huán)，退火延伸階段采集熒光信號。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測輪狀病毒A組的組合物，屬于生物技術領域，包括下述引物5’-GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCC-3’和5’-AAYTGYGGTATATTCAATACCATACA-3’還包括探針5’-熒光報告基團AARGAGCTAWCCGYTAGCCAGACGG-熒光淬滅基團-3’，還公開了包含上述引物和探針的試劑盒及應用其檢測輪狀病毒A組的方法，利用本發(fā)明的組合物、試劑盒和/或方法對輪狀病毒A組進行檢測時，檢測范圍為108～101拷貝基因組當量/反應體系，該檢測快速簡便，整個反應在3小時內完成，并且特異性高，準確度高。
文檔編號C12Q1/70GK102260752SQ20111024606
公開日2011年11月30日 申請日期2011年8月25日 優(yōu)先權日2011年8月25日
發(fā)明者汪耀, 王玲 申請人:成都新基因格生物科技有限公司