專利名稱：一種快速鑒定結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病原微生物的檢測(cè)與鑒定，具體涉及一種用環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增技術(shù) (LAMP技術(shù))快速鑒定結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌的方法。
背景技術(shù)：
近年來，非結(jié)核分枝桿菌感染明顯增加，結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌在臨床上引起的疾病難以區(qū)別，最具代表性的結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病酷似非結(jié)核分枝桿菌肺病，但兩者對(duì)抗結(jié)核藥物敏感性不同，故正確鑒定分枝桿菌在疾病診斷及治療中至關(guān)重要。傳統(tǒng)的生物學(xué)鑒定方法主要依據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)速度、色素產(chǎn)生、對(duì)藥物耐受性、生化反應(yīng)等，方法復(fù)雜、 費(fèi)時(shí)，在得到分離培養(yǎng)物后仍需2 4周方能獲得結(jié)果，因此有必要建立一種快速診斷結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌的方法，對(duì)結(jié)核病確證及臨床用藥具有重要的指導(dǎo)意義。目前鑒別結(jié)核分枝桿菌的分子生物方法有PCR，ELISA、免疫膠體金等方法，以上各種方法雖然可能在臨床上提供較好的價(jià)值，但因需要昂貴的儀器設(shè)備、繁瑣的操作過程、靈敏度低等不同的原因未能在臨床上大規(guī)模推廣使用。環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增技術(shù) (Loop-Mediated Isothermal Amplification,以下簡(jiǎn)稱LAMP法)是日本榮研化學(xué)株式會(huì)社于2000年前后開發(fā)出的基因擴(kuò)增技術(shù)，其具有快速簡(jiǎn)便、操作準(zhǔn)確、容易普及、安全可靠的優(yōu)點(diǎn)，目前尚未有將LAMP法應(yīng)用于快速鑒定結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一組用于快速鑒定結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌的特異性引物，及一種用環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增技術(shù)(LAMP技術(shù))快速鑒定結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌的方法。本鑒定方法方便快捷、價(jià)格低廉，適于推廣應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下
本發(fā)明根據(jù)結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌16S RNA的特異性設(shè)計(jì)4條特異性引物， 利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，在60 65°C，等溫?cái)U(kuò)增6(Γ90分鐘，根據(jù)顯色劑顯示的顏色來區(qū)分結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌。用于快速鑒定結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌的特異性引物，包括
內(nèi)引物 1 :5，- TGGTCGTAGTAGGTCGATGGGGAGTCGATCTGCACACAGCT -3，(SEQ ID No. 1)； 內(nèi)引物 2 :5，- TGCGCGATGGCGAACTCAAGGCACCGTAAACACCGTAG -3，(SEQ ID No. 2)； 外引物 1 :5，- TCATCGCCGATCATCAGG -3，(SEQ ID No. 3)； 外引物 2 :5’ -CGAGTTTGGTCATCAGCCG-3，(SEQ ID No. 4)。一種快速鑒定結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌的方法，具體包括如下步驟
(1)模板DNA的提取提取待檢樣品的DNA，所述待檢樣品是已鑒定為含有分枝桿菌的樣品或分離的分枝桿菌；
(2)環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增反應(yīng)在200μ1PCR管配制反應(yīng)體系引物混合液 μ ，反應(yīng)液
312. 5μ1，DNA聚合酶0. 5 μ ，模板DNA 2 5μ1，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25μ1，然后加入20μ1 的密封液，將上述反應(yīng)管于63 65°C反應(yīng)6(T90min ；
所述引物混合液含有上述的4條特異性引物(SEQ ID No.廣4)，其中，內(nèi)引物1的濃度為4 8 pmol/μ 、內(nèi)引物2的濃度為4 8 pmol/μ 、外引物1的濃度為1 pmol/μ 、外引物2 的濃度為1 pmol/μ ；
所述反應(yīng)液含有 IOmM dNTP、10XThermoPol 反應(yīng)緩沖液、150mM MgSO4, 5mM Betaine, 四者的體積比為7 9 5 :2 4 :9 11 ；
(3)結(jié)果判斷在上述反應(yīng)管中加入廣2μ1顯色劑STOR GREEN I，混勻后觀察反應(yīng)液的顏色，若呈現(xiàn)綠色則為結(jié)核分枝桿菌，橙色則為非結(jié)核分枝桿菌。優(yōu)選的，所述反應(yīng)液中，IOmMdNTP 10 X ThermoPol 反應(yīng)緩沖液150mM MgSO4 :5mM Betaine (體積比)=8 :5 :3 :10。優(yōu)選的，所述DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶，濃度為8υ/μ1。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明方法方便快捷，能在較短的時(shí)間內(nèi)鑒別結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌，且不需要昂貴的儀器設(shè)備；靈敏度高，最低可檢測(cè)出100個(gè)菌/ml ； 特異性好，本發(fā)明根據(jù)16S RNA基因序列設(shè)計(jì)4對(duì)引物，與目的基因的6個(gè)區(qū)域結(jié)合，具有較高的特異性。本發(fā)明對(duì)于結(jié)核分枝桿菌或非結(jié)核分枝桿菌感染的診斷與臨床用藥具有較高的參考價(jià)值，適于推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式根據(jù)結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌16S RNA的特異性設(shè)計(jì)4條特異性引物，序列分別如下
內(nèi)引物 1 :5，- TGGTCGTAGTAGGTCGATGGGGAGTCGATCTGCACACAGCT -3，(SEQ ID No. 1)； 內(nèi)引物 2 :5，- TGCGCGATGGCGAACTCAAGGCACCGTAAACACCGTAG -3，(SEQ ID No. 2)； 外引物 1 :5，- TCATCGCCGATCATCAGG -3，(SEQ ID No. 3)； 外引物 2 :5’ -CGAGTTTGGTCATCAGCCG-3，(SEQ ID No. 4)。采用上述特異性引物快速鑒定結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌，具體包括如下步驟
(1)模板DNA的提取提取待檢樣品的DNA，所述待檢樣品是已鑒定為含有分枝桿菌的樣品或分離的分枝桿菌；
(2)環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增反應(yīng)在200μ1PCR管配制反應(yīng)體系引物混合液 μ ，反應(yīng)液 12. 5μ1， ΝΑ聚合酶0. 5 μ ，模板DNA 2 5μ1，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25μ1，然后加入20μ1 的密封液，將上述反應(yīng)管于63 65°C反應(yīng)6(T90min ；
所述引物混合液含有上述的4條特異性引物(SEQ ID No.廣4)，其中，內(nèi)引物1的濃度為4 8 pmol/μ 、內(nèi)引物2的濃度為4 8 pmol/μ 、外引物1的濃度為1 pmol/μ 、外引物2 的濃度為1 pmol/μ ；
所述反應(yīng)液含有 IOmM dNTP、10XThermoPol 反應(yīng)緩沖液、150mM MgSO4, 5mM Betaine, 四者的體積比為7 9 5 :2 4 :9 11 ；
(3)結(jié)果判斷在上述反應(yīng)管中加入廣2μ1顯色劑STORGREEN I，混勻后觀察反應(yīng)液的顏色，若呈現(xiàn)綠色則為結(jié)核分枝桿菌，橙色則為非結(jié)核分枝桿菌。
優(yōu)選的，所述反應(yīng)液中，IOmMdNTP 10 X ThermoPol 反應(yīng)緩沖液150mM MgSO4 :5mM Betaine (體積比)=8 :5 :3 :10。優(yōu)選的，所述DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶，濃度為8υ/μ1。以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。實(shí)施例1
環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增反應(yīng)體系的準(zhǔn)備
(1)反應(yīng)液10mMdNTP、10XThermoPol 反應(yīng)緩沖液、150mM MgSO4, 5mM Betaine，四者的體積比為8 5 3 10 ；
(2)引物液包括4ρπιο1/μ1內(nèi)引物1、4ρπιο1/μ1內(nèi)引物2、1pmol/μ 外引物1、1 pmol/ μι外引物2，四條引物分別為
內(nèi)引物 1 :5，- TGGTCGTAGTAGGTCGATGGGGAGTCGATCTGCACACAGCT -3，(SEQ ID No. 1)； 內(nèi)引物 2 :5，- TGCGCGATGGCGAACTCAAGGCACCGTAAACACCGTAG -3，(SEQ ID No. 2)； 外引物 1 :5，- TCATCGCCGATCATCAGG -3，(SEQ ID No. 3)； 外引物 2 :5’ -CGAGTTTGGTCATCAGCCG-3，(SEQ ID No. 4)；
(3)DNA聚合酶Bst DNA聚合酶，濃度為8UM ；
(4)顯色劑熒光染料IXSTORGreen I。用上述反應(yīng)體系按以下方法對(duì)結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行鑒定。本實(shí)施例的待檢樣品為已鑒定為分枝桿菌患者的痰液，當(dāng)然，也可以為已鑒定為分枝桿菌患者的支氣管灌洗液及其它樣品，或者分離的分枝桿菌。1、模板DNA提取
1)將3ml的痰標(biāo)本置于室溫；
2)在痰樣標(biāo)本中加入2倍痰樣體積的4%的NaOH ；
3)每隔aiiin渦旋振蕩15s，處理15min，然后吸取Iml加入帶旋蓋的離心管中；
4)12000r/min 離心 15min，去上清液；
5)加入0. 9%的NaCl lml，洗滌，12000r/min離心15min，去上清液；
6)加入ΙΟΟμΙ的純化水；
7)100°C煮 20min，然后冰浴 IOmin ；
8)離心取上清液轉(zhuǎn)移至另一支離心管中作為模板DNA。2、環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增反應(yīng)在200μ1 PCR管配制反應(yīng)體系引物混合物 μ ，反應(yīng)液12. 5μ1，DNA聚合酶 μ ，模板DNA 2μ1，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25μ1，然后加入20μ1 的密封液，將上述反應(yīng)管放入63°C水浴鍋內(nèi)，反應(yīng)60min后取出反應(yīng)管。3、結(jié)果判定在上述反應(yīng)管中加入 μ IXSYBR Green I，混勻后觀察反應(yīng)液的顏色，若呈現(xiàn)綠色則為結(jié)核分枝桿菌，橙色則為非結(jié)核分枝桿菌。本實(shí)施例中，PCR管顯綠色，表明待檢樣品所感染的分枝桿菌為結(jié)核分枝桿菌。實(shí)施例2常規(guī)PCR反應(yīng)與本發(fā)明方法靈敏度的比較
取分離純化的結(jié)核分枝桿菌依次稀釋為1.0 X 106、1. O X 105、1. O X 104、1. O X 103、 l.OXlO^l.OXlO1 CFU/ mL，分別用本發(fā)明的鑒定方法和常規(guī)PCR方法進(jìn)行鑒定。1、本發(fā)明的LAMP檢測(cè)方法
環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增反應(yīng)體系的準(zhǔn)備(1)反應(yīng)液:10mMdNTP、10XThermoPol 反應(yīng)緩沖液、150mM MgSO4, 5mM Betaine，四者的體積比為8 5 3 10 ；
(2)引物液包括8ρπιο1/μ1內(nèi)引物1、8ρπιο1/μ1內(nèi)引物2、1pmol/μ 外引物1、1 pmol/ μι外引物2，四條引物分別為
內(nèi)引物 1 :5，- TGGTCGTAGTAGGTCGATGGGGAGTCGATCTGCACACAGCT -3，(SEQ ID No. 1); 內(nèi)引物 2 :5，- TGCGCGATGGCGAACTCAAGGCACCGTAAACACCGTAG -3，(SEQ ID No. 2)； 外引物 1 :5，- TCATCGCCGATCATCAGG -3，(SEQ ID No. 3)； 外引物 2 :5’ -CGAGTTTGGTCATCAGCCG-3，(SEQ ID No. 4)；
(3)DNA聚合酶Bst DNA聚合酶，濃度為8UM ；
(4)顯色劑熒光染料IXSTORGreen I。用上述反應(yīng)體系按以下方法分別對(duì)不同濃度的菌液進(jìn)行檢測(cè)，做3個(gè)重復(fù) (1)模板DNA的提取
1)取3ml的菌液置于室溫；
2)加入2倍菌液體積的4%的NaOH ；
3)每隔aiiin渦旋振蕩15s，處理15min，然后吸取Iml加入帶旋蓋的離心管中；
4)12000r/min 離心 15min，去上清液；
5)加入0. 9%的NaCl lml，洗滌，12000r/min離心15min，去上清液；
6)加入ΙΟΟμΙ的純化水；
7)100°C煮 20min，然后冰浴 IOmin ；
8)離心取上清液轉(zhuǎn)移至另一支離心管中作為模板DNA。(2)恒溫基因擴(kuò)增反應(yīng)在200μ1 PCR管配制反應(yīng)體系引物混合物 μ ，反應(yīng)液 12. 5μ1， ΝΑ聚合酶0. 5μ1，模板DNA 2μ1，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25μ1，然后加入20μ1的密封液，將上述反應(yīng)管放入63°C水浴鍋內(nèi)，反應(yīng)65min后取出。(3)結(jié)果判定在上述反應(yīng)管中加入 μ IXSYBR Green I，混勻后觀察反應(yīng)液的顏色，無擴(kuò)增的PCR管呈黃色，有擴(kuò)增的PCR管呈綠色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。本實(shí)施例中，1.0X106、l.0X105、1. 0X104、1. 0X103、1. OX IO2 CFU/ mL 的 PCR 管均為綠色，表示有擴(kuò)增反應(yīng)；1.0 X IO1 CFU/ mL的PCR管為橙色，表明無擴(kuò)增反應(yīng)。2、常規(guī)PCR檢測(cè)
(1)樣品DNA提取與LAMP方法中的步驟一致。(2) PCR引物PCR反應(yīng)引物采用本方法反應(yīng)中的外引物1和外引物2。(3) PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)體系為25μ1體系，10XPCR Buffer (PCR反應(yīng)緩沖液， Promega公司5μ1, IOmM dNTPs (Promega公司)0. 5μ1，上、下游引物分別對(duì)應(yīng)外引物1和外引物2，各0. 5μ1，Taq酶(5UM，Promega公司)0. 5μ1，模板DNA 2μ1，用滅菌去離子水補(bǔ)至25μ1。反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min，95°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，72°C延伸7min。PCR產(chǎn)物取10μ1與洲瓊脂糖凝膠電泳，100V電壓下30min，通過凝膠成像分析儀觀察結(jié)果，預(yù)期目的條帶為278bp。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。常規(guī)PCR方法的靈敏度為1.0 X 102、 1.0X101 CFU/ mL顯示為陰性，即無擴(kuò)增。
注“ + ”表示檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，即有擴(kuò)增；“_”表示檢測(cè)結(jié)果為陰性，即無擴(kuò)增。由兩種方法比較可以看出，本發(fā)明的鑒定方法靈敏度可以達(dá)到1.0X102 CFU/ mL 的濃度，而PCR方法的靈敏度為1.0X103 CFU/ mL，而1.0X102 CFU/ mL或以下顯示為陰性結(jié)果；經(jīng)比對(duì)，本發(fā)明的鑒定方法靈敏度明顯高于PCR方法的敏感度，能檢測(cè)出更低含量的樣品。實(shí)施例3特異性實(shí)驗(yàn)
用實(shí)施例1的鑒定方法分別對(duì)分離純化的結(jié)核分枝桿菌、鳥-胞內(nèi)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、偶然分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、海分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、瑪爾摩分枝桿菌、猿猴分枝桿菌、嗜血分枝桿菌、土地分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、草分枝桿菌、轉(zhuǎn)黃分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、戈登分枝桿菌進(jìn)行鑒定。用實(shí)施例2 的常規(guī)PCR方法進(jìn)行檢驗(yàn)。鑒定結(jié)果顯示鳥-胞內(nèi)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、偶然分枝桿菌、龜分枝桿菌、 膿腫分枝桿菌、海分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、瑪爾摩分枝桿菌、猿猴分枝桿菌、嗜血分枝桿菌、土地分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、草分枝桿菌、轉(zhuǎn)黃分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、戈登分枝桿菌的反應(yīng)管均為橙色，即無擴(kuò)增；結(jié)核分枝桿菌的反應(yīng)管為綠色，即有擴(kuò)增。本結(jié)果與常規(guī)PCR結(jié)果相一致，顯示出良好的特異性。
權(quán)利要求
1.用于快速鑒定結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌的特異性引物，其特征在于，包括內(nèi)引物 1 :5，- TGGTCGTAGTAGGTCGATGGGGAGTCGATCTGCACACAGCT -3，(SEQ ID No. 1)；內(nèi)引物 2 :5，- TGCGCGATGGCGAACTCAAGGCACCGTAAACACCGTAG -3，(SEQ ID No. 2)；外引物 1 :5，- TCATCGCCGATCATCAGG -3，(SEQ ID No. 3)；外引物 2 :5’ -CGAGTTTGGTCATCAGCCG-3，(SEQ ID No. 4)。
2.一種快速鑒定結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌的方法，其特征在于，采用權(quán)利要求 1所述的4條特異性引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，加入模板DNA，在60 65°C， 等溫?cái)U(kuò)增6(Γ90分鐘，具體包括如下步驟(1)模板DNA的提取提取待檢樣品的DNA作為模板DNA，所述待檢樣品是已鑒定為含有分枝桿菌的樣品或分離的分枝桿菌；(2)環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增反應(yīng)在200μ1PCR管配制反應(yīng)體系引物混合液 μ ，反應(yīng)液 12. 5μ1，DNA聚合酶0. 5 μ ，模板DNA 2 5μ1，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25μ1，然后加入20μ1 的密封液，將上述反應(yīng)管于63 65°C反應(yīng)6(T90min ；所述引物混合液含有權(quán)利要求1所述的4條特異性引物，其中，內(nèi)引物1的濃度為4、 pmol/μ 、內(nèi)引物2的濃度為4 8 pmol/μ 、外引物1的濃度為1 pmol/μ 、外引物2的濃度為 1 pmol/μ ；所述反應(yīng)液含有 IOmM dNTP、10XThermoPol 反應(yīng)緩沖液、150mM MgSO4, 5mM Betaine, 四者的體積比為7 9 5 :2 4 :9 11 ；(3)結(jié)果判斷在上述反應(yīng)管中加入廣2μ1顯色劑STORGREEN I，混勻后觀察反應(yīng)液的顏色，若呈現(xiàn)綠色則為結(jié)核分枝桿菌，橙色則為非結(jié)核分枝桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種快速鑒定結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌的方法，其特征在于，所述反應(yīng)液中，IOmM dNTP 10 X ThermoPol 反應(yīng)緩沖液150mM MgSO4 :5mM Betaine (體積比)=8 5 3 :10ο
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種快速鑒定結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌的方法，其特征在于，所述DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶，濃度為8υ/μ1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌的快速鑒定方法。其原理是根據(jù)結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌16SRNA的特異性設(shè)計(jì)4條特異性引物，采用四條特異性引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在63~65°C對(duì)樣品DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，短時(shí)間擴(kuò)增效率可達(dá)到109~1010個(gè)拷貝，通過加入SYBRGreenI觀察顏色變化來判斷擴(kuò)增與否。本發(fā)明方法具有方便快捷，靈敏度高，特異性高等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于結(jié)核分枝桿菌或非結(jié)核分枝桿菌感染的診斷與臨床用藥具有較高的參考價(jià)值，適于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102304575SQ201110246388
公開日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2011年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月25日
發(fā)明者葉宇鑫, 周琳, 唐大運(yùn), 常彥磊, 石磊, 鐘球, 陳濤 申請(qǐng)人:廣東省結(jié)核病控制中心, 廣州迪澳生物科技有限公司