專利名稱：用于制定大腸菌群定量曲線的標(biāo)準(zhǔn)樣本的制備方法，該定量曲線的制作方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于制定定量曲線的標(biāo)準(zhǔn)樣本的制備方法，該定量曲線的制作方法及其應(yīng)用，特別適用于 液體樣本中大腸菌群的定量檢測(cè)。
背景技術(shù)：
常規(guī)的大腸菌群計(jì)數(shù)方法主要包括大腸菌群Petrifilm 測(cè)試片法、國(guó)標(biāo)GB4789. 3-2010《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》中提到的MPN計(jì)數(shù)法和平板計(jì)數(shù)法。這些檢測(cè)方法耗時(shí)較長(zhǎng)，工作量大，不利于大腸菌群的快速檢測(cè)。目前，開發(fā)出許多利用大腸菌群生長(zhǎng)過(guò)程中酸堿度變化快速檢測(cè)大腸菌群含量的檢測(cè)方法。如實(shí)時(shí)光電微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)，通過(guò)向培養(yǎng)中的樣本加入酸堿指示劑、并利用比色法監(jiān)測(cè)其PH值的變化，當(dāng)pH值達(dá)到某一閾值時(shí)記錄檢出時(shí)間，由檢出時(shí)間對(duì)照定量曲線判斷樣品中大腸菌群含量。實(shí)時(shí)光電微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)易操作且耗時(shí)較短，僅需6-10小時(shí)就可得出檢測(cè)結(jié)果，其中，定量曲線的制作是準(zhǔn)確定量的關(guān)鍵所在。定量曲線制作過(guò)程中用到標(biāo)準(zhǔn)樣本，用目前的方法制備的標(biāo)準(zhǔn)樣本都存在樣本背景不一致的問題，影響定量曲線的準(zhǔn)確性，在最終用于大腸菌群含量的檢測(cè)時(shí)造成不必要的誤差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供用于制定大腸菌群定量曲線的標(biāo)準(zhǔn)樣本的制備方法，使得制備得到的標(biāo)準(zhǔn)樣本之間的背景值一致。本發(fā)明的又一目的是提供制作大腸菌群定量曲線的方法，其中標(biāo)準(zhǔn)樣本的制備方法使得制備得到的標(biāo)準(zhǔn)樣本的背景值一致，可提高大腸菌群定量曲線的準(zhǔn)確性。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供大腸菌群定量曲線在檢測(cè)液體樣本中大腸菌群含量中的應(yīng)用，提高液體樣本中大腸菌群含量檢測(cè)的準(zhǔn)確性。本發(fā)明提供了用于制定大腸菌群定量曲線的標(biāo)準(zhǔn)樣本的制備方法，包括以下步驟取不含大腸菌群的樣本，調(diào)節(jié)pH至6. 7±0. 2，制成無(wú)菌樣本。向每毫升無(wú)菌樣本中加入彡IO4CFU且彡IOltlCFU的活化的大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)菌株，并調(diào)節(jié)pH至6. 7±0. 2，獲得富菌樣本；將富菌樣本用無(wú)菌樣本進(jìn)行十倍遞減稀釋，待稀釋后的富菌樣本的理論大腸菌群濃度值< 10CFU/毫升時(shí)，停止稀釋，制成富菌樣本的十倍遞減系列稀釋液，即為標(biāo)準(zhǔn)樣本。本發(fā)明還提供了大腸菌群定量曲線的制作方法，包括以下步驟根據(jù)上述的標(biāo)準(zhǔn)樣本的制備方法制備標(biāo)準(zhǔn)樣本，標(biāo)準(zhǔn)樣本的樣本總數(shù)> 50個(gè)；分別將標(biāo)準(zhǔn)樣本按相同的體積比接種到大腸菌群選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并監(jiān)測(cè)接種了標(biāo)準(zhǔn)樣本的選擇培養(yǎng)基的PH值的變化，待PH值達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)，記錄標(biāo)準(zhǔn)樣本的檢出時(shí)間；分別利用大腸菌群平板計(jì)數(shù)法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣本中的大腸菌群進(jìn)行計(jì)數(shù)，得出每毫升標(biāo)準(zhǔn)樣本中大腸菌群數(shù)；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣本的檢出時(shí)間和每毫升標(biāo)準(zhǔn)樣本中大腸菌群數(shù)的常用對(duì)數(shù)值繪制大腸菌群定量曲線。
本發(fā)明又提供了如上所述大腸菌群定量曲線在檢測(cè)液體樣本中大腸菌群含量中的應(yīng)用，包括以下步驟取與無(wú)菌樣本為同種產(chǎn)品的液體樣本，調(diào)節(jié)PH至6. 7±0. 2，制成液體樣本的待檢測(cè)液；將待檢測(cè)液按上述體積比接種到大腸菌群選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并監(jiān)測(cè)接種了待檢測(cè)液的選擇培養(yǎng)基的PH值的變化，待pH值達(dá)到上述設(shè)定閾值時(shí)，記錄待檢測(cè)液的檢出時(shí)間；用待檢測(cè)液的檢出時(shí)間對(duì)照大腸菌群定量曲線，得出每毫升待檢測(cè)液中大腸菌群數(shù)的 常用對(duì)數(shù)值，并計(jì)算每毫升液體樣本中的大腸菌群數(shù)。在大腸菌群定量曲線在檢測(cè)液體樣本中大腸菌群含量中的應(yīng)用的一種示意性實(shí)施方式中，接種時(shí)的體積比為1:1。在大腸菌群定量曲線在檢測(cè)液體樣本中大腸菌群含量中的應(yīng)用的一種示意性實(shí)施方式中，培養(yǎng)的溫度為35±1°C。在大腸菌群定量曲線在檢測(cè)液體樣本中大腸菌群含量中的應(yīng)用的一種示意性實(shí)施方式中，通過(guò)比色法監(jiān)測(cè)pH值的變化。在大腸菌群定量曲線在檢測(cè)液體樣本中大腸菌群含量中的應(yīng)用的一種示意性實(shí)施方式中，PH值的設(shè)定閾值為5.8。本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)樣本制備方法中，通過(guò)制備具有相同背景的無(wú)菌樣本和富菌樣本，并將富菌樣本用無(wú)菌樣本進(jìn)行稀釋，制成富菌樣本的十倍遞減系列稀釋液，制成標(biāo)準(zhǔn)樣本，使得標(biāo)準(zhǔn)樣本的背景值一致。本發(fā)明的制作大腸菌群定量曲線的方法中，利用前述標(biāo)準(zhǔn)樣本制備方法制備標(biāo)準(zhǔn)樣本，使得制作的大腸菌群定量曲線能更準(zhǔn)確地反映檢出時(shí)間與實(shí)際菌落量之間的線性關(guān)系，提高了大腸菌群定量檢測(cè)時(shí)的準(zhǔn)確性。本發(fā)明的大腸菌群定量曲線在檢測(cè)液體樣本中大腸菌群含量中的應(yīng)用，使用與液體樣本為同種產(chǎn)品的無(wú)菌樣本、通過(guò)特定的方法制定大腸菌群定量曲線，用于液體樣本中大腸菌群含量的檢測(cè)，使得檢測(cè)結(jié)果更為準(zhǔn)確。


以下附圖僅對(duì)本發(fā)明做示意性說(shuō)明和解釋，并不限定本發(fā)明的范圍。圖I是本發(fā)明實(shí)施例3生成的用于檢測(cè)冰淇淋中大腸菌群的大腸菌群定量曲線。圖2是本發(fā)明實(shí)施例4生成的用于檢測(cè)低溫酸奶中大腸菌群的大腸菌群定量曲線。
具體實(shí)施例方式為了對(duì)發(fā)明的技術(shù)特征、目的和效果有更加清楚的理解，現(xiàn)對(duì)照

本發(fā)明的具體實(shí)施方式
。實(shí)施例I : 一種標(biāo)準(zhǔn)樣本制備方法。I、溶液試劑?；罨拇竽c菌群標(biāo)準(zhǔn)菌株取肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC13882)，接種于滅菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，于36. 5± 1°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24小時(shí),計(jì)數(shù)后備用。2、操作步驟。I)取不含大腸菌群的融化冰淇淋，調(diào)節(jié)pH至6. 7±0. 2，制成無(wú)菌樣本。
為了檢測(cè)的方便，可根據(jù)樣本的濃稠度，用滅菌的生理鹽水對(duì)不含大腸菌群的融化冰淇淋進(jìn)行一定比例的稀釋，再調(diào)節(jié)pH至6. 7 ± O. 2，制成無(wú)菌樣本。2)取9份無(wú)菌樣本分別加入如下表所示一定量的活化的大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)菌株，并調(diào)節(jié)pH至6. 7 ± O. 2，獲得9份富菌樣本。
樣本編號(hào)標(biāo)準(zhǔn)菌株的力口入量(CFU/暈升)_
富菌樣本I 5. OXlO4 富菌樣本2 5. OXlO9 富菌樣本3 I. IXlO5 富菌樣本4 9. 5 X IO8 富菌樣本5 I. 5 X IO9· 富菌樣本6 I. 5 X IO9 富菌樣本7 7. IXlO8 富菌樣本8 8. 2 X IO4 富菌樣本9 |2. OXlO93)將9份富菌樣本分別用無(wú)菌樣本進(jìn)行十倍遞減稀釋，待稀釋后的富菌樣本的理論大腸菌群濃度值< 10CFU/毫升時(shí)，停止稀釋，制成9份富菌樣本的十倍遞減系列稀釋液，為9組標(biāo)準(zhǔn)樣本。例如，富菌樣本8中標(biāo)準(zhǔn)菌株的加入量為8. 2X IO4 CFU/毫升，對(duì)其進(jìn)行十倍遞減稀釋得到的理論大腸菌群濃度值應(yīng)該分別為稀釋倍數(shù)為10時(shí)的理論大腸菌群濃度值為8. 2 X IO3CFU/毫升；稀釋倍數(shù)為IO2時(shí)的理論大腸菌群濃度值為8. 2 X IO2 CFU/毫升、稀釋倍數(shù)為IO3時(shí)的理論大腸菌群濃度值為8. 2 X IO1CFU/毫升；稀釋倍數(shù)為IO4時(shí)的理論大腸菌群濃度值為8. 2 CFU/毫升。其中，當(dāng)稀釋倍數(shù)為IO4時(shí)的理論大腸菌群濃度值為8.2 CFU/毫升，小于10CFU/毫升，所以，當(dāng)對(duì)富均樣本8的稀釋達(dá)到IO4倍時(shí)，停止稀釋。實(shí)施例2 :另一種標(biāo)準(zhǔn)樣本制備方法。I、溶液試劑。活化的大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)菌株取弗氏檸檬酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC43864)，接種于滅菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，于36. 5± 1°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24小時(shí),計(jì)數(shù)后備用。2、操作步驟。I)取不含大腸菌群的低溫酸奶,調(diào)節(jié)pH至6. 7±0. 2,制成無(wú)菌樣本。為了檢測(cè)的方便，可根據(jù)樣本的濃稠度，用滅菌的生理鹽水對(duì)不含大腸菌群的低溫酸奶進(jìn)行一定比例的稀釋，再調(diào)節(jié)pH至6. 7 ± O. 2，制成無(wú)菌樣本。2)取7份無(wú)菌樣本，分別加入如下表所示一定量的活化的大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)菌株，并調(diào)節(jié)pH至6. 7 ± O. 2，獲得7份富菌樣本。
樣本編號(hào)標(biāo)準(zhǔn)菌株的力口入量(CFU/暈升)_
富菌樣本I 6. 4 X IO8富菌樣本2 4. 8 X IO8富菌樣本3 6. 2 X IO8富菌樣本4 4. 9 X IO8富菌樣本5 6. 2 X IO8富菌樣本6 I. 5 X IO9富菌樣本7 \7. 4 X IO83)將7份富菌樣本分別用無(wú)菌樣本進(jìn)行十倍遞減稀釋，待稀釋后的富菌樣本的理論大腸菌群濃度值< 10CFU/毫升時(shí)，停止稀釋，制成7份富菌樣本的十倍遞減系列稀釋液，為7組標(biāo)準(zhǔn)樣本。例如，富菌樣本2中標(biāo)準(zhǔn)菌株的加入量為4. 8 X IO8CFU/毫升，對(duì)其進(jìn)行十倍遞減稀釋得到的理論大腸菌群濃度值應(yīng)該分別為稀釋倍數(shù)為10時(shí)的理論大腸菌群濃度值為4. 8 X IO7CFU/毫升；稀釋倍數(shù)為IO2時(shí)的理論大腸菌群濃度值為4. 8 X IO6CFU/毫升、稀釋倍數(shù)為IO3時(shí)的理論大腸菌群濃度值為4. 8X IO5CFU/毫升；稀釋倍數(shù)為IO4時(shí)的理論大腸菌群濃度值為4. 8 X IO4 CFU/毫升；稀釋倍數(shù)為IO5時(shí)的理論大腸菌群濃度值為
4.8 X IO3 CFU/毫升；稀 釋倍數(shù)為IO6時(shí)的理論大腸菌群濃度值為4. 8 X IO2 CFU/毫升；稀釋倍數(shù)為IO7時(shí)的理論大腸菌群濃度值為4. 8 X IO1 CFU/毫升；稀釋倍數(shù)為IO8時(shí)的理論大腸菌群濃度值為4. 8 CFU/毫升。其中，當(dāng)稀釋倍數(shù)為IO8時(shí)的理論大腸菌群濃度值為4. 8CFU/毫升，小于10CFU/毫升，所以，當(dāng)對(duì)富均樣本2的稀釋達(dá)到IO8倍時(shí)，停止稀釋。實(shí)施例3 :—種用于檢測(cè)冰淇淋中大腸菌群定量曲線的制作方法。I、儀器設(shè)備。實(shí)時(shí)光電微生物快速檢測(cè)儀選用Soleris實(shí)時(shí)光電微生物快速檢測(cè)儀。2、溶液耗材。Soleris- Coliform Medium CC-102試劑瓶(每個(gè)試劑瓶中包含大腸菌群選擇培養(yǎng)基5毫升和酸堿指示劑)。3、操作步驟。I)根據(jù)實(shí)施例I中所述標(biāo)準(zhǔn)樣本制備方法制備標(biāo)準(zhǔn)樣本。2)分別將標(biāo)準(zhǔn)樣本5. O毫升接種到Soleris- Coliform Medium CC-102試劑瓶中，并將試劑瓶放入Soleris實(shí)時(shí)光電微生物快速檢測(cè)儀中于35± 1°C下進(jìn)行培養(yǎng)，并通過(guò)Soleris實(shí)時(shí)光電微生物快速檢測(cè)儀用比色法來(lái)監(jiān)測(cè)試劑瓶中pH值的變化，待pH值達(dá)到設(shè)定閾值5. 8時(shí)，記錄標(biāo)準(zhǔn)樣本的檢出時(shí)間，如下表所示。3)分別利用大腸菌群平板計(jì)數(shù)法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣本中的大腸菌群進(jìn)行計(jì)數(shù)，得出每毫升標(biāo)準(zhǔn)樣本中大腸菌群數(shù)，如下表所示。其中，樣本編號(hào)中的前一個(gè)數(shù)字表示相應(yīng)富菌樣本的編號(hào)，后一個(gè)數(shù)字為該標(biāo)準(zhǔn)樣本制備時(shí)相應(yīng)富菌樣本的稀釋倍數(shù)的常用對(duì)數(shù)值。例如“標(biāo)準(zhǔn)樣本2-3”為富菌樣本2用無(wú)菌樣本進(jìn)行IO3倍稀釋后制得。
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權(quán)利要求
1.用于制定大腸菌群定量曲線的標(biāo)準(zhǔn)樣本的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 取不含大腸菌群的樣本，調(diào)節(jié)PH至6. 7±0. 2，制成無(wú)菌樣本； 向每毫升所述無(wú)菌樣本中加入> IO4CFU且< IOltlCFU的活化的大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)菌株，并調(diào)節(jié)pH至6. 7±0. 2，獲得富菌樣本；和 將所述富菌樣本用所述無(wú)菌樣本進(jìn)行十倍遞減稀釋，待稀釋后的所述富菌樣本的理論大腸菌群濃度值< 10CFU/毫升時(shí)，停止所述稀釋，制成所述富菌樣本的十倍遞減系列稀釋液，即為標(biāo)準(zhǔn)樣本。
2.大腸菌群定量曲線的制作方法，其特征在于，包括以下步驟 根據(jù)權(quán)利要求I所述的標(biāo)準(zhǔn)樣本制備方法制備所述標(biāo)準(zhǔn)樣本，所述標(biāo)準(zhǔn)樣本的樣本總數(shù)彡50個(gè)； 分別將所述標(biāo)準(zhǔn)樣本按相同的體積比接種到大腸菌群選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并監(jiān)測(cè)接種了所述標(biāo)準(zhǔn)樣本的所述選擇培養(yǎng)基的PH值的變化，待所述pH值達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)，記錄所述標(biāo)準(zhǔn)樣本的檢出時(shí)間； 分別利用大腸菌群平板計(jì)數(shù)法對(duì)所述標(biāo)準(zhǔn)樣本中的大腸菌群進(jìn)行計(jì)數(shù)，得出每毫升所述標(biāo)準(zhǔn)樣本中大腸菌群數(shù)；和 根據(jù)所述標(biāo)準(zhǔn)樣本的所述檢出時(shí)間和所述每毫升所述標(biāo)準(zhǔn)樣本中大腸菌群數(shù)的常用對(duì)數(shù)值繪制大腸菌群定量曲線。
3.如權(quán)利要求2所述的大腸菌群定量曲線在檢測(cè)液體樣本中大腸菌群含量中的應(yīng)用，包括以下步驟 取與所述無(wú)菌樣本為同種產(chǎn)品的液體樣本，調(diào)節(jié)PH至6. 7±0. 2，制成所述液體樣本的待檢測(cè)液； 將所述待檢測(cè)液按所述體積比接種到大腸菌群選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并監(jiān)測(cè)接種了所述待檢測(cè)液的所述選擇培養(yǎng)基的PH值的變化，待pH值達(dá)到所述設(shè)定閾值時(shí)，記錄所述待檢測(cè)液的檢出時(shí)間； 用所述待檢測(cè)液的所述檢出時(shí)間對(duì)照所述大腸菌群定量曲線，得出每毫升所述待檢測(cè)液中大腸菌群數(shù)的常用對(duì)數(shù)值，并計(jì)算每毫升所述液體樣本中的大腸菌群數(shù)。
4.如權(quán)利要求3所述大腸菌群定量曲線在檢測(cè)液體樣本中大腸菌群含量中的應(yīng)用，其 >中，所述接種時(shí)的所述體積比為I :1。
5.如權(quán)利要求3所述大腸菌群定量曲線在檢測(cè)液體樣本中大腸菌群含量中的應(yīng)用，其中，所述培養(yǎng)的溫度為35±1°C。
6.如權(quán)利要求3所述大腸菌群定量曲線在檢測(cè)液體樣本中大腸菌群含量中的應(yīng)用，其中，通過(guò)比色法監(jiān)測(cè)所述pH值的變化。
7.如權(quán)利要求3所述大腸菌群定量曲線在檢測(cè)液體樣本中大腸菌群含量中的應(yīng)用，其中，所述PH值的所述設(shè)定閾值為5. 8。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于制定大腸菌群定量曲線的標(biāo)準(zhǔn)樣本的制備方法，該定量曲線的制作方法及其應(yīng)用。首先取與待測(cè)的液體樣本為同種產(chǎn)品的不含大腸菌群的樣本，并調(diào)節(jié)pH值，制成無(wú)菌樣本；再向無(wú)菌樣本中加入大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)菌株，并調(diào)節(jié)pH值，制得富菌樣本，用無(wú)菌樣本將富菌樣本進(jìn)行十倍遞減稀釋，制得標(biāo)準(zhǔn)樣本。將標(biāo)準(zhǔn)樣本進(jìn)行培養(yǎng)，檢測(cè)其pH值達(dá)到某一閾值時(shí)的檢出時(shí)間。同時(shí)用平板法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣本中的大腸菌群數(shù)。根據(jù)檢出時(shí)間和平板法檢測(cè)結(jié)果繪制大腸菌群定量曲線。取液體樣本并調(diào)節(jié)pH值，制成待檢測(cè)液，并用上述方法得到檢出時(shí)間，再對(duì)照定量曲線得到液體樣本的大腸菌群數(shù)。由于本方法平衡了樣本之間的背景值，因此提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
文檔編號(hào)C12Q1/06GK102952844SQ20111024639
公開日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2011年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月24日
發(fā)明者劉曉川, 薛志清, 杜麗, 喻東威, 趙源, 劉志楠, 李梅, 劉衛(wèi)星 申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團(tuán))股份有限公司