專利名稱：一種利用甘油為單一碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用甘油為單一碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε -聚賴氨酸的方法，具體地說是指通過兩階段PH值控制和流加發(fā)酵的方法，利用甘油作碳源高效發(fā)酵生產(chǎn)ε -聚賴氨酸， 屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
ε -聚賴氨酸(ε -PL)是由L-賴氨酸的α -COOH和ε -NH2縮合而成，由微生物合成的一種同型氨基酸聚合物，聚合度一般在25 35。ε -PL的多陽離子性賦予了它廣泛的用途，如用于食品防腐劑、藥物載體、生物可降解高吸水性樹脂、基因芯片和藥物包裝等。作為食品添加劑，它是一種優(yōu)良的生物防腐劑，可以有效抑制革蘭氏陽性、革蘭氏陰性、酵母菌和霉菌的生長，被廣泛用于淀粉質(zhì)類方便食品的防腐。ε "PL是通過微生物深層好氧發(fā)酵生產(chǎn)，并經(jīng)過提取、精制獲得。目前，國際上只有日本窒素公司(Chisso Corporation)實現(xiàn)了 ε-PL工業(yè)化生產(chǎn)且已形成年產(chǎn)千噸級的規(guī)模。ε-PL在國內(nèi)的研究，大多處在實驗室和中試開發(fā)階段且發(fā)酵水平較日本有相當(dāng)大差距。因此，建立ε-PL高效發(fā)酵工藝提高 ε -PL發(fā)酵產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率，對于建立我國ε -PL產(chǎn)業(yè)具有重要意義。到目前為止，葡萄糖是發(fā)酵生產(chǎn)ε -PL唯一碳源。巖田敏治等人(CN 1260004Α)利用改造后的小白鏈霉菌Iysinopolymerus亞種11011A-1(FERM BP-1109)轉(zhuǎn)化葡萄糖合成大量ε-PL。徐虹等人(CN101509021A)利用細(xì)胞固定化方法培養(yǎng)北里孢菌PL6-3，以葡萄糖作碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε -PL。賈士儒等人(CN101671703A)利用葡萄糖作碳源生產(chǎn)ε _PL的同時，在補料階段流加L-賴氨酸，建立了 ε-PL生產(chǎn)新方法。事實上，利用葡萄糖生產(chǎn)ε-PL 時，在補料階段由于葡萄糖溶解度以及流加方式的限制，必然引起對發(fā)酵液的稀釋，從而降低ε-PL濃度，增加了后提取成本。Shima 等人(Shima S，Sakai H. Agric Biol Chem 1981,45 :2497-2502)在 ε-PL 產(chǎn)生菌發(fā)現(xiàn)之初就證明葡萄糖和甘油都是合成ε-PL的最適碳源。然而，甘油在20世紀(jì) 80年代是緊俏的化工原料，其高昂的價格不可能在發(fā)酵工業(yè)作為原料被考慮，所以很自然選擇價格低廉和來源廣泛的葡萄糖作為原料用于發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL。而甘油只在實驗室作為碳源用于 ε-PL 合成研究(CN1696279A ;CN10U85046A ;Nishikawa et al. Appl Environ Microbiol 2002,68 :3575-3581 ；Hirohara et al. Appl Microbiol Biotechnol 2006, 73 :321-331 ；Ouyang et al. Biotechnol J 2006,1 :1459-1463 ；Hirohara et al. Appl Microbiol Biotechnol 2007，76 1009-1016)。進(jìn)入本世紀(jì)，隨著生物柴油產(chǎn)業(yè)和油脂工業(yè)的快速發(fā)展，它們形成的大量副產(chǎn)品-工業(yè)甘油已經(jīng)成為一種廉價的工業(yè)碳源并廣泛用于其他發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)(da Silva et al. Biotechnol Adv 2009，27 :30-39)。另外，最近 Nishikawa 等人(Nishikawa et al. Appl Environ Microbiol 2006，72 :2301-2312)研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵過程中添加甘油能夠有效降低ε-PL聚合度而不影響其抑菌特性。與此同時， 形成的低聚合度ε-PL會顯著提高單位質(zhì)量ε-PL抑菌效價和降低ε-PL添加量。除此之外，甘油密度大(1.26g/cm3)，凝固點低，在補料階段引起的稀釋作用會遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于葡萄糖。因此，甘油是提高ε-PL發(fā)酵水平和效價的理想碳源。但是，甘油卻并未被用于ε-PL發(fā)酵生產(chǎn)，也未見甘油被用于發(fā)酵生產(chǎn)ε "PL的方法和相關(guān)技術(shù)參數(shù)的報道。在ε-PL 發(fā)酵控制工藝方面，Kahar 等人(Kahar et al. J Biosci Bioeng 2001， 91 =190-194)報道了一種兩階段pH值調(diào)控方法第一階段，控制發(fā)酵pH值保持在5. O以上保證菌體細(xì)胞大量生長，達(dá)到增加菌體量目的；第二階段，控制發(fā)酵PH值維持在4. O左右用于ε-PL合成，實現(xiàn)ε-PL大量累積。該工藝適合菌體在pH4. O左右生長緩慢的ε-PL產(chǎn)生菌。然而，對于能在ΡΗ4. O左右正常生長又能合成ε-PL這類產(chǎn)生菌來說，該工藝會導(dǎo)致菌體量大量增加，從而引起發(fā)酵液粘度增大，帶來傳質(zhì)困難和增加動力消耗等弊端；同時還會導(dǎo)致ε-PL轉(zhuǎn)化率下降，最終會增加ε-PL發(fā)酵生產(chǎn)成本(Shih et al. Process Biochem 2006,41:1644-1649)。因此，需要根據(jù)ε-PL產(chǎn)生菌生長類型和ε-PL合成特點，建立針對性的PH值控制方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供一種利用甘油為單一碳源高效發(fā)酵生產(chǎn)ε -PL的方法， 提高ε "PL發(fā)酵產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率，降低生產(chǎn)成本。本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下利用ε -PL產(chǎn)生菌培養(yǎng)20 30h的種子液，接種甘油作碳源的培養(yǎng)基，在初始pH 6. 5 7. O、溫度為28 32°C、溶氧保持在15 40%的培養(yǎng)條件下，采用兩階段pH值調(diào)控策略和流加發(fā)酵法生產(chǎn)ε -PL。本發(fā)明所指的培養(yǎng)基由甘油、酵母膏、(NH4)2SO4,KH2PO4,MgSO4 ·7Η20、和!^eSO4 ·7Η20 組成。最優(yōu)配方為甘油，60g/L ； (NH4)2S04，5g/L ；酵母膏，10g/L ；KH2PO4,4g/L ；MgSO4 ·7Η20， 0. 8g/L ；FeSO4 · 7Η20，0· 05g/L。本發(fā)明所指的兩階段pH值調(diào)控策略是當(dāng)發(fā)酵起始pH值下降至3. 5 4. 0時，用氨水等堿性液體或液氨控制PH穩(wěn)定在3. 0 3. 8，并保持到32 40h ；隨后，用氨水等堿性液體或液氨使PH值緩慢升至3. 5 4. 2，保持到發(fā)酵結(jié)束。本發(fā)明所指的流加發(fā)酵法是在ε -PL發(fā)酵過程中，當(dāng)甘油濃度低于5g/L時，流加甘油，直到甘油濃度達(dá)到15g/L ；當(dāng)(NH4)2SO4濃度低于1 10g/L，流加(NH4) 2S04溶液，直到(NH4)2SO4濃度達(dá)到7 15g/L。與葡萄糖為碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL方法相比，本發(fā)明所示白勺禾U用甘油為單一碳源發(fā)酵牛產(chǎn)ε -PL m^m^^nt^ 1、簡化了發(fā)酵操作葡萄糖作碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε "PL時，為避免葡萄糖與氮源之間產(chǎn)生美拉德反應(yīng)所生成的色素類物質(zhì)會增加后續(xù)提取難度和提取成本，以及可能會阻礙菌體生長，葡萄糖往往需要單獨滅菌后再加入發(fā)酵體系。這樣，一方面增加了發(fā)酵過程的染菌幾率；另一方面也增加了生產(chǎn)成本和勞動強度。而以甘油作碳源，可以與其他營養(yǎng)成分一并滅菌，不需要單獨操作。2、提高了 ε -PL產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率利用甘油作碳源結(jié)合兩階段pH值控制策略和流加發(fā)酵方法生產(chǎn)ε -PL，較原有發(fā)酵工藝，ε -PL發(fā)酵產(chǎn)量提高了 25 50%，轉(zhuǎn)化率提高了 50 75% ；該工藝一方面提供甘油作碳源更適合ε-PL產(chǎn)生菌合成ε-PL，另一方面在發(fā)酵補料階段流加甘油原液比葡萄糖引起的稀釋作用要明顯下降，從而減少了后提取體積， 降低了提取成本，同時也降低了發(fā)酵廢水處理量。
具體實施方法根據(jù)下列實施例，可以更好地理解本發(fā)明。實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件以及結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)力要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實施例1 現(xiàn)有牛產(chǎn)工藝在裝有3.25L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中(葡萄糖培養(yǎng)基葡萄糖，50g/L ； (NH4) 2S04，10g/L ；酵母粉，5g/L ；MgSO4,0. 5g/L ；ZnSO4,0. 04g/L ；FeSO4,0. 03g/L ；K2HPO4, 0. 8g/L ； KH2PO4,1. 36g/L)，接種0. 25 Le -PL產(chǎn)生菌的20 30h種子培養(yǎng)液，在初始pH 6. 8、溫度為30°C、溶氧保持在30%的培養(yǎng)條件下發(fā)酵。當(dāng)pH值自然下降到4. 0左右，流加 25%氨水維持該pH值至發(fā)酵結(jié)束。在發(fā)酵后期，流加800g/L葡萄糖和80g/L(NH4)2SO4,使葡萄糖維持在10g/L左右。培養(yǎng)16他，ε -PL產(chǎn)量達(dá)到Mg/L，轉(zhuǎn)化率為7. 8%。棚列2泔麟·齢賺胃PH fti··傾舗在裝有3. 25L培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中(甘油培養(yǎng)基甘油，100g/L ； (NH4)2S04, 20g/ L ；牛肉膏，10g/L ；KH2PO4,4g/L ；MgSO4 · 7H20，0. 8g/L ；FeSO4 · 7Η20，0· 05g/L)，接種 0. 25 L ε -PL產(chǎn)生菌的20 30h種子培養(yǎng)液，在初始pH 6. 0、溫度為25°C、溶氧保持在15%的培養(yǎng)條件下發(fā)酵。當(dāng)PH值自然下降到4. 0，流加2mol/L氫氧化鈉溶液維持該pH至發(fā)酵40h， 隨后，用2mol/L氫氧化鈉溶液使pH緩慢升至4. 5，保持到發(fā)酵結(jié)束。培養(yǎng)78h，ε-PL產(chǎn)量達(dá)到4. 3g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到4. 2 %。棚列3泔麟·齢賺胃PH fti··傾舗 在裝有3. 25L培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中(甘油培養(yǎng)基甘油，100g/L ； (NH4) 2S04， 20g/L ；牛肉膏，10g/L ；KH2PO4,4g/L ；MgSO4 · 7H20，0. 8g/L ；FeSO4 · 7Η20，0· 05g/L)，接種 0. 25L ε -PL產(chǎn)生菌的20 30h種子培養(yǎng)液，在初始pH 7. 5、溫度為38°C、溶氧保持在40% 的培養(yǎng)條件下發(fā)酵。當(dāng)PH值自然下降到3. 0，流加2mol/L氫氧化鉀溶液維持該pH至發(fā)酵 32h，隨后，用2mol/L氫氧化鉀溶液使pH緩慢升至4.0，保持到發(fā)酵結(jié)束。培養(yǎng)48h，ε-PL 產(chǎn)量達(dá)到3. 8g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到10. 2%0^mm 4 -Mmmm^miY^ pH inmwM^M^m在裝有3. 25L培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中(甘油培養(yǎng)基甘油，100g/L ； (NH4) 2S04， 20g/L ；牛肉膏，10g/L ；KH2PO4,4g/L ；MgSO4 · 7H20，0. 8g/L ；FeSO4 · 7Η20，0· 05g/L)，接種 0. 25L ε -PL產(chǎn)生菌的20 30h種子培養(yǎng)液，在初始pH 7. 0、溫度為30°C、溶氧保持在30% 的培養(yǎng)條件下發(fā)酵。當(dāng)PH值自然下降到3. 5，流加10 25%氨水維持pH至發(fā)酵36h，隨后， 用10 25%氨水使pH緩慢升至3.8，保持到發(fā)酵結(jié)束。培養(yǎng)50h，ε-PL產(chǎn)量達(dá)到10. Ig/ L，轉(zhuǎn)化率為16. 2%0實施例5 甘油作碳源結(jié)合兩階段PH倌調(diào)控策略補料-分批發(fā)酵在裝有3. 25L培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中(甘油培養(yǎng)基甘油，100g/L ； (NH4) 2S04， 20g/L ；牛肉膏，10g/L ；KH2PO4,4g/L ；MgSO4 · 7H20，0. 8g/L ；FeSO4 · 7Η20，0· 05g/L)，接種 0. 25L ε -PL產(chǎn)生菌的20 30h種子培養(yǎng)液，在初始pH 6. 0、溫度為25°C、溶氧保持在15% 的培養(yǎng)條件下發(fā)酵。當(dāng)PH值自然下降到4. 0，流加2mol/L氫氧化鈉溶液維持該pH至發(fā)酵 40h，隨后，用2mol/L氫氧化鈉溶液使pH緩慢升至4. 5，保持到發(fā)酵結(jié)束。當(dāng)發(fā)酵后期甘油濃度低于15g/L時，流加甘油，直到甘油濃度達(dá)到25g/L ；當(dāng)(NH4)#04濃度低于10g/L，流加(NH4)2SO4，直到(NH4)2SO4濃度達(dá)到15g/L。培養(yǎng)16他，ε-PL產(chǎn)量達(dá)到18. 3g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到 8. 2%。實施例6 甘油作碳源結(jié)合兩階段DH倌調(diào)控策略補料-分批發(fā)酵在裝有3. 25L培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中(甘油培養(yǎng)基甘油，100g/L ； (NH4)2S04, 20g/ L ；牛肉膏，10g/L ；KH2PO4,4g/L ；MgSO4 · 7H20，0. 8g/L ；FeSO4 · 7Η20，0· 05g/L)，接種 0. 25 L ε -PL產(chǎn)生菌的20 30h種子培養(yǎng)液，在初始pH 7. 5、溫度為38°C、溶氧保持在40%的培養(yǎng)條件下發(fā)酵。當(dāng)PH值自然下降到3.0，流加2mol/L氫氧化鉀溶液維持該pH至發(fā)酵32h，隨后，用2mol/L氫氧化鉀溶液使pH緩慢升至4.0，保持到發(fā)酵結(jié)束。當(dāng)發(fā)酵后期甘油濃度低于 5g/L時，流加甘油，直到甘油濃度達(dá)到15g/L ；當(dāng)(NH4)2SO4濃度低于lg/L，流加(NH4)2SO4, 直到(NH4)2SO4濃度達(dá)到7g/L。培養(yǎng)168h, ε -PL產(chǎn)量達(dá)到25. 3g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到15. 2%。實施例7 甘油作碳源結(jié)合兩階段DH倌調(diào)控策略補料-分批發(fā)酵在裝有3. 25L培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中(甘油培養(yǎng)基甘油，100g/L ； (NH4) 2S04， 20g/L ；牛肉膏，10g/L ；KH2PO4,4g/L ；MgSO4 · 7H20，0. 8g/L ；FeSO4 · 7Η20，0· 05g/L)，接種 0. 25L ε -PL產(chǎn)生菌的20 30h種子培養(yǎng)液，在初始pH 7. 0、溫度為30°C、溶氧保持在30% 的培養(yǎng)條件下發(fā)酵。當(dāng)PH值自然下降到3. 5，流加10 25 %氨水維持pH至發(fā)酵36h，隨后，用10 25%氨水使pH緩慢升至3.8，保持到發(fā)酵結(jié)束。當(dāng)發(fā)酵后期甘油濃度低于5g/ L時，流加甘油，直到甘油濃度達(dá)到15g/L ；當(dāng)(NH4)2SO4濃度低于5g/L，流加(NH4)2SO4,直到 (NH4)2SO4濃度達(dá)到10g/L。培養(yǎng)168h, ε -PL產(chǎn)量達(dá)到30. llg/L，轉(zhuǎn)化率為13. 2%0
權(quán)利要求
1.一種利用甘油為單一碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε -聚賴氨酸的方法，其特征在于ε -聚賴氨酸產(chǎn)生菌以甘油為碳源，在初始pH 6. 0 7. 5、溫度為25 38°C、溶氧保持在15 40%的培養(yǎng)條件下發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸。當(dāng)ε-聚賴氨酸開始合成時，采用兩階段PH值調(diào)控策略和流加發(fā)酵法，達(dá)到提高ε -聚賴氨酸發(fā)酵水平和轉(zhuǎn)化率，降低生產(chǎn)成本和減少廢水量的目的。
2.如權(quán)利要求1所述的一種利用甘油為單一碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε_聚賴氨酸的方法，其特征在于所述甘油是純度為90%以上的工業(yè)甘油。
3.如權(quán)利要求1所述的一種利用甘油為單一碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε_聚賴氨酸的方法，其特征在于采用兩階段PH值控制策略第一階段為接種發(fā)酵開始后的32 40h，控制發(fā)酵液 PH值穩(wěn)定在3. 0 3. 8 ；發(fā)酵32 40h以后為第二階段，控制發(fā)酵液pH值穩(wěn)定在3. 5 4. 2，直至發(fā)酵結(jié)束。
4.如權(quán)利要求1所述的一種利用甘油為單一碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε_聚賴氨酸的方法，，其特征在于采用甘油流加發(fā)酵方法發(fā)酵起始甘油濃度為30 100g/L，在發(fā)酵后期甘油濃度低于5 15g/L時，開始流加甘油，直到其濃度達(dá)到15 25g/L。
5.如權(quán)利要求1所述的一種利用甘油為單一碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε_聚賴氨酸的方法，，其特征在于采用(NH4)2SO4流加發(fā)酵方法發(fā)酵起始(NH4)2SO4濃度為5 20g/L，當(dāng)(NH4)2SO4 濃度低于1 10g/L，流加(NH4)2SO4溶液，直至IJ (NH4)2SO4濃度達(dá)至IJ 7 15g/L。
6.如權(quán)利要求1所述的一種利用甘油為單一碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε_聚賴氨酸的方法，其特征在于控制PH的方法是向發(fā)酵體系適當(dāng)流加氨水、氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉等堿性溶液，或直接通入液氨。
全文摘要
本發(fā)明涉及到一種利用甘油為單一碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的方法。采用甘油作碳源，結(jié)合兩階段pH值調(diào)控策略和流加發(fā)酵方法生產(chǎn)ε-聚賴氨酸。利用本發(fā)明建立的發(fā)酵工藝，比葡萄糖作碳源的ε-聚賴氨酸發(fā)酵產(chǎn)量提高25～50％，轉(zhuǎn)化率提高50～75％。本發(fā)明改變了現(xiàn)有ε-聚賴氨酸生產(chǎn)方法，顯著提高了ε-聚賴氨酸的發(fā)酵水平。同時，本發(fā)明拓展了ε-聚賴氨酸發(fā)酵碳源的選擇，為工業(yè)級甘油在ε-聚賴氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。
文檔編號C12P13/02GK102352385SQ20111025012
公開日2012年2月15日 申請日期2011年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月29日
發(fā)明者唐蕾, 張宏建, 張建華, 李樹, 毛忠貴, 陳旭升 申請人:江南大學(xué)