專利名稱：一種提取森林土壤和凋落物中微生物總rna的方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物技術領域，涉及一種提取微生物總RNA的方法，尤其涉及一種提取森林土壤和凋落物中微生物總RNA的方法。該方法主要適合于科研、教學、環(huán)保等部門對森林土壤和凋落物中微生物功能基因轉錄組學研究過程中，提取樣品中的微生物總RNA。
背景技術：
現(xiàn)有技術條件下，95%以上微生物不可培養(yǎng)，這是傳統(tǒng)微生物生態(tài)學在揭示自然界微生物群落結構、生態(tài)功能及其相互關系研究中的最大障礙。隨著分子生物學的理論與技術在微生物生態(tài)學研究中的不斷滲透，直接對環(huán)境樣品中分離的微生物總DNA進行分析的方法，在一定程度上彌補了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法所存在的局限性。但是，由于基因表達的時空特異性，復雜環(huán)境條件下環(huán)境微生物基因特異性表達及其功能并不能通過對微生物DNA的研究得到揭示，而這種信息是生態(tài)環(huán)境研究中的重要部分。近年來，通過轉錄組學的方法， 從mRNA水平上研究環(huán)境微生物，取得了很大的成功，且獲得的結果更準確、可靠。該方法首先通過提取樣品中所有微生物的RNA，將其中的mRNA反轉錄為cDNA，再運用定量PCR、 Northern雜交和cDNA文庫構建等下游實驗技術研究功能基因的豐度、群落結構和生態(tài)功能等。因此，獲得高質量的RNA是順利進行該方法下游實驗的最基本前提。森林凋落物的微生物分解直接影響著森林土壤肥力和森林生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)過程。對森林凋落物和土壤中微生物群落結構和功能的研究，已成為國際土壤微生物研究領域的熱點。但森林凋落物和土壤中含豐富的腐殖酸、多糖、多酚等物質，使提取的微生物總 RNA純度不高，且環(huán)境中廣泛存在著RNA酶，RNA易被其降解，給RNA提取帶來了許多困難。 有為數(shù)不多的商業(yè)公司研發(fā)了土壤RNA提取試劑盒，但價格昂貴，且對土壤樣品選擇性較強，尤其是提取森林凋落物中微生物總RNA時，所提的RNA產量低、效果不穩(wěn)定。而絕大部分通過手提法獲得的土壤微生物總RNA產量不高、腐殖酸污染較嚴重，會干擾下游試驗的順利進行。此外，目前對環(huán)境微生物總RNA提取的方法主要針對土壤、堆肥、水和大氣等環(huán)境樣品，尚缺乏針對森林凋落物中微生物總RNA的有效提取方法。因此，開發(fā)一種高產量、 高質量的既適合森林土壤又適合森林凋落物中微生物總RNA提取的方法，是進行森林生態(tài)系統(tǒng)凋落物微生物分解過程研究的迫切需要。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種提取森林土壤和凋落物中微生物總RNA的方法， 利用該方法提取的微生物總RNA產量高、完整性好、純度較好。為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術方案一種森林土壤和凋落物中微生物總RNA提取的方法，其步驟是A、將實驗所用的所有試劑、耗材用0. 1% (ν/ν,以下相同)焦碳酸二乙酯(DEPC) 水浸泡過夜后高壓滅菌，若配制的試劑不可高壓滅菌，用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的水配制，所述的試劑包括十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)緩沖液、20% (w/w)十二烷基硫酸鈉(SDS)、6% (w/w)硅藻土、5M異硫氰酸胍(GITC)、聚乙二醇6000 (PEG6000)溶液、 72% 75% (ν/ν)乙醇和0. 焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水等，所述的耗材包括碾缽、碾棒、玻璃珠、離心管、吸頭和試劑瓶等。B、采集新鮮森林土壤或森林凋落物樣品，剪碎后立即投入液氮中速凍，經冷凍干燥儀冷凍干燥，磨細、混勻，得粉末樣品，將粉末樣品置于-70°C保存。C、取于_70°C保存的粉末樣品0.2 0.5g，加入300 400 μ L0. 焦碳酸二乙酯 (DEPC)處理水，待水滲透樣品后，得混合物Α，將混合物A放入-70°C，過夜；D、于經-70°c過夜的混合物A中，分別加入0. 2 0. 5g玻璃珠混合物、100 400μ 十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)緩沖液、20 8(^1^20% (w/w)十二烷基硫酸鈉 (SDS)、40 80 μ L 6% (w/w)硅藻土和300 500 μ L酚/氯仿/異戊醇混合液，于渦旋儀上混勻，得混合液B ；其中玻璃珠混合物中0. Imm和0. 5mm直徑玻璃珠的質量比為1:1， 十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)緩沖液中十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)的濃度為5% (w/ w)、磷酸緩沖液的濃度為120mM、氯化鈉(NaCl)的濃度為0. 35M、pH值為8. 0 8. 5，酚/氯仿/異戊醇混合液中酚、氯仿、異戊醇的體積比為25 24 1、ρΗ值為8.0;E、將所得混合液B放入快速核酸提取儀，以4. 5 5. 5m/s的速度裂解細胞30 45s后，于4°C、14000rpm，離心10 15min，得上清液；F、步驟(E)所得的上清液中加入IOOyL 5M異硫氰酸胍(GITC)，混勻，于4°C、 12000 14000rpm，離心5 lOmin，得上清液，并重復該步驟1 3次；G、步驟(E)所得的上清液或步驟(F)所得的上清液中，加入等體積的氯仿/異戊醇混合液，氯仿/異戊醇混合液中氯仿、異戊醇的體積比為M 1，輕輕混勻，于4°C、 12000 14000rpm，離心lOmin，得上清液；H、步驟(G)所得的上清液中加入2倍體積的聚乙二醇6000 (PEG6000)溶液，聚乙二醇溶液中聚乙二醇6000 (PEG6000)的濃度為30% 40% (w/w)、氯化鈉(NaCl)的濃度為1. 5 2. 0M，充分混勻，室溫QO 25°C，以下相同)放置1 2h以沉淀核酸；于4°C、 14000rpm，離心lOmin，棄掉上清液，得核酸沉淀；I、用300 400 μ L預冷的72% 75% (ν/ν)乙醇，分兩次清洗步驟(H)所得的核酸沉淀，瞬時離心10 15s，用移液器吸走殘留乙醇溶液，于超凈工作臺中，自然晾干5 IOmin,加50 100 μ L 0. 1 %焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水，溶解，混勻，得DNA/RNA溶液C。J、用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA/RNA溶液C中DNA和RNA的完整性，用DNA酶消化 DNA/RNA溶液C中的DNA，得RNA溶液D，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA溶液D中RNA的完整性，用核酸蛋白測定儀檢測RNA溶液D中RNA的濃度和純度，并將RNA溶液D保存于-70°C 上述的技術方案中，所述CTAB緩沖液與SDS裂解液體積比的控制是該技術方案的關鍵之一，CTAB緩沖液同時具有裂解細胞和去除樣品中的腐殖質、多糖等物質的功能，在 CTAB緩沖液中加入SDS可增加破壞細胞壁和裂解細胞的能力，提高RNA的產量；當試驗樣品為森林土壤時，可適當降低CTAB/SDS的比例，即所述步驟⑶中CTAB緩沖液的加入量為 100 300 μ L，SDS的加入量為40 80 μ L ；當試驗樣品為凋落物時，可適當增加CTAB/SDS 的比例，即所述步驟(D)中CTAB緩沖液的加入量為200 400 μ L，SDS的加入量為20 40 μ L0
上述的技術方案中，所述快速核酸提取儀購自美國MP BIO公司，型號為 FastPrep-24 ；所述步驟(E)中，混合液B放入快速核酸提取儀，以4. 5 5. 5m/s的速度裂解細胞30 45s，可被替換為將混合液B置于轉速1500 2000rpm的渦旋儀上，渦旋10 15min。上述的技術方案中，所述步驟(F)中，加入的GITC是一種蛋白質變性劑，多次加入 5M GITC能有效去除蛋白質類物質；根據(jù)不同樣品，若提取的RNA OD2607280 ^ 1.8，可省去所述步驟(F)，若提取出的RNA OD2607280 < 1. 8，則有必要進行所述步驟(F)。上述的技術方案中，所述步驟(H)中，以PEG6000為沉淀劑，可使核酸與腐殖質類物質有效分離，所提取的RNA的純度比以乙醇或異丙醇作為沉淀劑有大大提高。上述的技術方案中，所述RNA質量的檢測，可按本領域常規(guī)方法進行，本發(fā)明采用的RNA質量檢測方法如下1)取1 3 μ L上述技術方案中步驟⑴所得DNA/RNA溶液C，經1. 5% (w/w)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA/RNA溶液C中DNA和RNA的完整性；2)再取適量DNA酶液，加入適量的DNA/RNA溶液C，于37°C水浴保溫30 60min， 對DNA/RNA溶液C中的DNA進行消化，得RNA溶液D ；3)取1 3 μ LRNA溶液D，經1. 5 % (w/w)瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA溶液D中RNA 的完整性；4)取1 2 μ LRNA溶液D，用核酸蛋白測定儀測定RNA溶液D中RNA的濃度和純度；以OD26tl表示RNA濃度，以OD26W表示RNA的蛋白質污染程度，其值> 1. 8表示RNA基本未被蛋白質污染，以(ω·/表示RNA的腐殖質污染程度，其值1. 7 2. 0表示RNA受腐殖質污染較輕。本發(fā)明與現(xiàn)有RNA提取技術相比，具有以下優(yōu)點和效果1)操作方便提取過程簡單、易操作；2)效果優(yōu)良操作過程中RNA不易降解，提取的RNA產量高QO 150μ g/g干樣)、純度較好(0D26(1/28C1值為1. 8 2. OjOD2607230值為1. 5 1. 8)、完整性好，可直接用于反轉錄、RT-PCR、Northern雜交等后續(xù)實驗。3)適用范圍廣適用不同地區(qū)、不同來源的森林土壤和森林凋落物中微生物總 RNA的提取，亦可用于提取農田土壤中的微生物總RNA，具有廣普適用性；4)經濟實用綜合成本低，并且能同時提取樣品中微生物總DNA和RNA，對于需要同時研究微生物總DNA和RNA的試驗，采用該方法，實驗操作更省時、經濟。


圖1為一種森林土壤和凋落物中微生物總RNA提取的方法的電泳圖。本發(fā)明實施例1中從森林土壤中提取的微生物總DNA和RNA的1. 5% (w/w)瓊脂糖凝膠電泳圖；1，2，3，4，5分別代表五個小樣方所提取的土壤中微生物總DNA和RNA ；M為 D2000 DNA Marker (索萊寶公司)。圖2為一種森林土壤和凋落物中微生物總RNA提取的方法的電泳圖。本發(fā)明實施例1中從森林土壤中提取的微生物總RNA的1. 5% (w/w)瓊脂糖凝膠電泳圖；M為D2000DNA Marker (索萊寶公司)；Sl代表實施例1中標準樣方的土壤中微生物總RNA。圖3為一種森林土壤和凋落物中微生物總RNA提取的方法的電泳圖。本發(fā)明實施例2中從森林凋落物中提取的微生物總DNA和RNA的1. 5% (w/w)瓊脂糖凝膠電泳圖；6，7，8，9，10分別代表五個小樣方所提取的凋落物中微生物總DNA和RNA ； M為D2000 DNA Marker (索萊寶公司)。圖4為一種森林土壤和凋落物中微生物總RNA提取的方法的電泳圖。本發(fā)明實施例2中從森林凋落物中提取的微生物總RNA的1. 5% (w/w)瓊脂糖凝膠電泳圖；M為D2000DNA Marker (索萊寶公司)；S2代表實例2中標準樣方的凋落物中微生物總RNA。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例1 一種森林土壤和凋落物中微生物總RNA提取的方法(提取馬尾松林土壤中微生物總RNA)，其步驟是(1)將實驗所用的所有試劑、耗材用0. 1% (ν/ν,以下相同)焦碳酸二乙酯(DEPC) 水浸泡過夜后高壓滅菌，若配制的試劑不可高壓滅菌，用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的水配制，所述的試劑包括十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)緩沖液、20% (w/w)十二烷基硫酸鈉(SDS),6% (w/w)硅藻土、5M異硫氰酸胍(GITC)、聚乙二醇6000 (PEG6000)溶液、 72% 75% (ν/ν)乙醇和0. 焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水等，所述的耗材包括碾缽、碾棒、玻璃珠、離心管、吸頭和試劑瓶等。(2)在馬尾松林(針葉林)，選擇一個標準樣方(20 X 20m)，在標準樣方中選擇5個小樣方(5X5m)，編號分別為1、2、3、4和5，分別采集表土(0 20cm)，混勻，按四分法分取約50g，放入滅菌鋁箔包好，立即投入液氮中速凍，帶回實驗室；經冷凍干燥儀冷凍干燥，去除樣品中的水分，經磨細、混勻后，置于-70 V保存。(3)取0. 5g于_70°C保存的土壤樣品放入2mL離心管，加入300 μ L 0. 1% DEPC處理水，待水滲透樣品后，放入-70°C，過夜；(4)加入 0. 5g 玻璃珠、150 μ L CTAB 緩沖液、80 μ L 20% (w/w) SDS、40 μ L 6% (w/ w)的硅藻土，400yL酚/氯仿/異戊醇(體積比25 24 LpH 8. 0)，于渦旋儀上混勻； 所用的玻璃珠由1 1質量比的0. Imm和0.5mm直徑的玻璃珠混合，所用的CTAB緩沖液中含 5% (胃/^)07^、1201111磷酸緩沖液、0. 35M NaCl.pH 8. 0 ；(5)放入快速核酸提取儀，以5. 5m/s的速度裂解細胞40s，4°C、14000rpm，離心 lOmin，轉移上清液至另一新的1. 5mL離心管；(6)加入 IOOyL 5M GITC，4 °C、14000rpm，離心 5min，轉移上清液至另一新的 1. 5mL離心管，重復該步驟2次；(7)加入等體積氯仿/異戊醇(體積比M 1)，輕輕混勻，4°C、14000rpm,離心 lOmin，轉移上清液至另一新的1. 5mL離心管；(8)加入2倍體積的PEG溶液，充分混勻，室溫(20 25°C，以下相同)放置2h，4°C、14000rpm，離心 lOmin，棄上清液；所用的 PEG 溶液中含 35 % (w/w)PEG6000 禾口 1. 5M NaCl ；(9)分兩次加入400 μ L預冷的75% (ν/ν)乙醇，瞬時離心15s，用移液器吸走殘留乙醇溶液，于超凈工作臺中，自然晾干IOminJn 50yL 0. 1% DEPC處理水，混勻，得DNA/ RNA混合液。(10)從編號為1 5的土壤樣品中提取的DNA/RNA混合液分別取1. 5 μ L用1. 5% (w/w)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA和RNA的完整性，如圖1所示；從編號為1 5的土壤樣品中提取的DNA/RNA混合液中各取4 μ L溶液(共20 μ L)，加入5 μ L DNA酶，于37°C水浴保溫30min，所得RNA編號為Si，取1. 5 μ L DNA酶消化過的RNA，用1. 5% (w/w)瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，如圖2所示；另取1. 5 μ L DNA酶消化過的RNA，用核酸蛋白測定儀檢測RNA的濃度和純度，并將DNA酶消化過的RNA保存于_70°C備用。圖1、圖2中RNA帶型整齊、清晰，無明顯降解，說明所提取的RNA完整性好；此外，經核酸蛋白測定儀檢測用DNA酶消化過的RNA, OD260為180ng/ μ L，即22. 5 μ g/g干土， 0D26(1/28。值為1. 85，0D26(1/23(1值為1. 64，說明從土壤中提取的RNA濃度高，純度較好，可用于下游RT-PCR等實驗。實施例2 一種森林土壤和凋落物中微生物總RNA提取的方法(提取喀斯特常綠落葉闊葉混交林凋落物中微生物總RNA)，其步驟是(1)將所用的所有試劑、耗材用0. 1% (ν/ν,以下相同)DEPC水浸泡過夜后高壓滅菌，若配制的試劑不可高壓滅菌，用0. 1 % DEPC處理過的水配制，所述的所有試劑為CTAB緩沖液、20% (w/w) SDS,6% (w/w)硅藻土、5M GITC、PEG6000 溶液、72% 75% (ν/ν)乙醇和 0. 1% DEPC處理水等，所述的耗材包括碾缽、碾棒、玻璃珠、離心管、吸頭和試劑瓶等。(2)在喀斯特常綠落葉闊葉混交林，選擇一個標準樣方(20X20m)，在標準樣方中選擇5個小樣方(5X5m)，編號分別為6、7、8、9和10，分別采集凋落物，用剪刀剪碎，混勻， 按四分法分取約50g，放入滅菌鋁箔包好，立即投入液氮中速凍；帶回實驗室，經冷凍干燥儀冷凍干燥，去除樣品中的水分，經磨細、混勻后，置于-70 V保存。(3)取0. 2g于_70°C保存的凋落物樣品放入2mL離心管，加入400 μ L 0. 1% DEPC 處理水，待水滲透樣品后，放入-70°C，過夜；(4)加入 0. 2g 玻璃珠、300 μ L CTAB 緩沖液、30 μ L 20% (w/w) SDS、40 μ L 6% (w/ w)硅藻土，400yL酚/氯仿/異戊醇(體積比25 24 LpH 8. 0)，于渦旋儀上混勻；所用的玻璃珠由1 1質量比的0. Imm和0.5mm直徑的玻璃珠混合，所用的CTAB緩沖液中含 5% (胃/^)07^、1201111磷酸緩沖液、0.351 NaCUpH 8.0。(5)放入快速核酸提取儀，以4. 5m/s的速度裂解細胞30s，4°C、14000rpm，離心 15mm，轉移上清液至另一新的1. 5mL離心管；(6)加入等體積氯仿/異戊醇(體積比M 1)，輕輕混勻，4°C、14000rpm,離心 lOmin，轉移上清液至另一新的1. 5mL離心管；(7)加入2倍體積的PEG溶液，充分混勻，室溫放置2h，4°C、14000rpm，離心lOmin， 棄上清液；所用的PEG溶液中含35% (w/w)PEG6000和1. 5M NaCl ；(8)分兩次加入400 μ L預冷的75% (ν/ν)乙醇，瞬時離心15s，用移液器吸走殘留乙醇溶液，于超凈工作臺中，自然晾干IOminJn 50yL 0. 1% DEPC處理水，混勻，得DNA/ RNA混合液。(9)從編號為6 10的土壤樣品中提取的DNA/RNA混合液分別取1. 5 μ L用1. 5% (w/w)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA和RNA的完整性，如圖3所示；從編號為6 10的凋落物樣品中提取的DNA/RNA混合液中各取4 μ L溶液(共20 μ L)，加入5 μ L DNA酶，于37°C水浴保溫30min，所得RNA編號為S2，取1. 5 μ L DNA酶消化過的RNA，經1. 5% (w/w)瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，如圖4所示；另取1. 5 μ L DNA酶消化過的RNA，用核酸蛋白測定儀檢測RNA的濃度和純度，并將DNA酶消化過的RNA保存于_70°C備用。圖3、圖4中RNA帶型整齊、清晰，無明顯降解，說明所提取的RNA完整性好；此外， 經核酸蛋白測定儀檢測用DNA酶消化過的RNA，OD260為300ng/ μ L，即93. 75 μ g/g干凋落物，0D26(1/28(1值為1. 95，OD2607230值為1. 72，說明從凋落物中提取的RNA濃度高，純度好，可用于下游RT-PCR等實驗。
權利要求
1. 一種森林土壤和凋落物中微生物總RNA提取的方法，其步驟是A、將實驗所用的所有試劑、耗材用0.1% ν/ν焦碳酸二乙酯水浸泡過夜后高壓滅菌，不可高壓滅菌的試劑，用0. 1% ν/ν焦碳酸二乙酯處理過的水配制，所述的試劑包括十六烷基三甲基溴化銨緩沖液、20% w/w十二烷基硫酸鈉、6% w/w硅藻土、5M異硫氰酸胍、聚乙二醇 6000溶液、72% 75% ν/ν乙醇和0. 1 % ν/ν焦碳酸二乙酯處理水；B、采集森林土壤或森林凋落物樣品，剪碎后投入液氮中速凍，經冷凍干燥儀冷凍干燥， 磨細、混勻，得粉末樣品，將粉末樣品置于-70°C保存；C、取于_70°C保存的粉末樣品0.2 0. 5g，加入300 400 μ L0. 1% ν/ν焦碳酸二乙酯處理水，待水滲透樣品后，得混合物Α，將混合物A放入-70°C，過夜；D、于經_70°C過夜的混合物A中，分別加入0.2 0. 5g玻璃珠混合物、100 400 μ L 十六烷基三甲基溴化銨緩沖液、20 80 μ L 20% w/w十二烷基硫酸鈉、40 80 μ L 6% w/ w硅藻土和300 500 μ L酚/氯仿/異戊醇混合液，于渦旋儀上混勻，得混合液B ；其中玻璃珠混合物中0. Imm和0. 5mm直徑玻璃珠的質量比為1 1，十六烷基三甲基溴化銨緩沖液中十六烷基三甲基溴化銨的濃度為5% w/w、磷酸緩沖液的濃度為120mM、氯化鈉的濃度為0. 35M、pH值為8. 0 8. 5，酚/氯仿/異戊醇混合液中酚、氯仿、異戊醇的體積比為 25 24 1、ρΗ 值為 8. 0 ；E、將所得混合液B放入快速核酸提取儀，以4.5 5. 5m/s的速度裂解細胞30 45s 后，于4°C、14000rpm，離心10 15min，得上清液；F、步驟E所得的上清液中加入IOOyL5M異硫氰酸胍，混勻，于4 °C、12000 14000rpm,離心5 lOmin，得上清液，并重復該步驟1 3次；G、步驟E所得的上清液或步驟F所得的上清液中，加入等體積的氯仿/異戊醇混合液， 氯仿/異戊醇混合液中氯仿、異戊醇的體積比為M 1，混勻，于4°C、12000 14000rpm， 離心lOmin，得上清液；H、步驟G所得的上清液中加入2倍體積的聚乙二醇6000溶液，聚乙二醇6000溶液中聚乙二醇6000的濃度為30% 40% w/w、氯化鈉的濃度為1. 5 2. OM,混勻，室溫放置1 2h以沉淀核酸；于4°C、14000rpm，離心lOmin，棄掉上清液，得核酸沉淀；I、用300 400μ L預冷的72% 75% ν/ν乙醇，分兩次清洗步驟H所得的核酸沉淀， 瞬時離心10 15s，用移液器吸走殘留乙醇溶液，于超凈工作臺中，自然晾干5 lOmin，加 50 100 μ L 0. 1 % ν/ν焦碳酸二乙酯處理水，溶解，混勻，得DNA/RNA溶液C ；J、用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA/RNA溶液C中DNA和RNA的完整性，用DNA酶消化DNA/ RNA溶液C中的DNA，得RNA溶液D，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA溶液D中RNA的完整性，用核酸蛋白測定儀檢測RNA溶液D中RNA的濃度和純度，并將RNA溶液D保存于_70°C備用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提取森林土壤和凋落物中微生物總RNA的方法，其步驟1、冷凍干燥森林土壤或凋落物樣品后，磨細、混勻；2、粉末樣品中加入焦碳酸二乙酯處理水，-70℃過夜；3、加入玻璃珠、十六烷基三甲基溴化銨緩沖液、十二烷基硫酸鈉、硅藻土和酚/氯仿/異戊醇，混勻；4、將混合液劇烈振蕩后，離心，得上清液；5、上清液中加入異硫氰酸胍，離心，得上清液；6、上清液中加入氯仿/異戊醇，離心，得上清液；7、上清液中加入聚乙二醇6000，放置，離心，棄掉上清液；8、經洗滌、溶解、DNA酶消化后，得RNA溶液；9、用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，用核酸蛋白測定儀檢測RNA的濃度和純度。利用該方法提取的RNA產量高、完整性好、純度較好。
文檔編號C12N15/10GK102286467SQ20111025199
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月30日 優(yōu)先權日2011年8月30日
發(fā)明者何尋陽, 梁月明, 蘇以榮, 陳香碧 申請人:中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所