專利名稱：一種基因工程雜合抗菌肽CecA-Temporin-SHF生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)制藥工業(yè)中基因工程生產(chǎn)蛋白藥物領(lǐng)域，尤其涉及一種雜合抗菌肽CecA-Temporin-SHF(CTS)的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
目前養(yǎng)殖業(yè)中，由于抗生素泛濫使用，破壞動(dòng)物腸道微生物菌群平衡，致使?jié)摲隗w內(nèi)的有害菌群大量繁殖會(huì)引起內(nèi)源感染，并且還導(dǎo)致耐藥微生物產(chǎn)生，致使藥物劑量加大、治療周期延長(zhǎng)、死亡率增高等問題，而且細(xì)菌的耐藥性還會(huì)向人類的轉(zhuǎn)移，給人類的健康造成巨大影響?？咕谋徽J(rèn)為是新一代抗生素的理想替代者。抗菌肽是生物體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類具有生物學(xué)活性的小分子多肽，存在于多種生物體中，是宿主免疫防御系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分，具有廣譜抗菌、無耐藥性及毒副作用等優(yōu)點(diǎn)。隨著研究的不斷深入，越來越顯示出了其在醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的獨(dú)特應(yīng)用價(jià)值。雜合抗菌肽CTS具有抗革蘭·氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、真菌的能力，對(duì)耐藥細(xì)菌同樣具有較好抑制效果，同時(shí)具有良好熱穩(wěn)定性和耐酸堿能力，這些特點(diǎn)使得雜合抗菌肽CTS在動(dòng)物疾病防治和飼料添加劑等方面顯露出很好的應(yīng)用前景。通過基因工程手段解決雜合抗菌肽CTS產(chǎn)量問題，減低抗生素使用量，為綠色養(yǎng)殖保駕護(hù)航。目前雜合抗菌肽CTS合成工藝復(fù)雜，獲取量少，無法滿足市場(chǎng)需求，提高雜合抗菌肽CTS產(chǎn)量是一個(gè)急需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述狀況，有必要提供一種工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高的雜合抗菌肽CTS的生產(chǎn)方法。一種雜合抗菌肽CTS的生產(chǎn)方法，包括下列步驟，雜合妝CecA-Temporin-SHF 基因合成；根據(jù)GENBANK 成熟肽段 CecropinA 以(1-8)及 Temporin-SHF(1-8)的氨基酸序列(KWKLFKKIFFFLSRIF)，選用酵母偏愛密碼子設(shè)計(jì)CecA-Temporin-SHF(CTS)雜合肽基因，人工合成優(yōu)化的CecA-Temporin-SHF雜合抗菌肽基因，CecA-Temporin-SHF雜合肽基因5’和3’端分別引入Eco RI> Not I內(nèi)切酶位點(diǎn)；另合成一對(duì)引物Pl與P2，其中，Pl與P2的序列分別為P1 GACTGGTTCCAATTGACAAGC, P2 :GCGGCCGCTCATTGGAAGATTC，該引物 Pl 與P2用于重組載體及重組酵母菌的鑒定，Pl位于畢赤酵母5’ AOX基因區(qū)，P2位于插入片段CecA-Temporin-SHF基因區(qū)，引物P1、P2的擴(kuò)增長(zhǎng)度分別為441bp ；雜合肽CecA-Temporin-SHF重組酵母表達(dá)載體的構(gòu)建；PCR產(chǎn)物和pPIC9K均用Eco RI、Not I雙酶切，T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5a，重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行PCR、缺失酶切位點(diǎn)鑒定，PCR以及酶切鑒定為陽性的質(zhì)粒測(cè)序，構(gòu)建正確的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為PPIC9K-CTS ；pPIC9K-CTS表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化；感受態(tài)Pichia pastorisGS 115 (his/Mut+)與 SacI 線性化 pPIC9K_CTS (5ug)相混合，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的O. 2cm電轉(zhuǎn)杯中，置冰上5min，1.5kV、25uF、200Q電擊，立即加ImL預(yù)冷的lmol/L山梨醇，取200uL涂布于含G418(5. Og/L)的YPD平板上篩選轉(zhuǎn)化子，30°C孵化4 5d至平板出現(xiàn)乳白色的酵母轉(zhuǎn)化菌落；采用PCR方法分析Pichia pastoris轉(zhuǎn)化子，用煮-凍-煮法制備PCR模板，以Pl，P2為引物，PCR反應(yīng)條件-MV 5min ；94°C 45s,61。。45s, 72°C 45s，25個(gè)循環(huán)；72°C 5min。以能擴(kuò)增出441bp的克隆定為陽性轉(zhuǎn)化子；重組Pichia pastoris的誘導(dǎo)表達(dá)；將篩選到的陽性酵母菌接種到5mL BMGY中，30°C、230r/min振蕩培養(yǎng)約22h至0D600達(dá)到3-6 ;室溫3000r/min離心2min，收集菌體重懸于25mL BMMY培養(yǎng)基，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；28°C、250r/min培養(yǎng)60h，期間每24h補(bǔ)加終濃度為1% (V/V)的甲醇；72h后5000r/min離心IOmin ;收集培養(yǎng)液上清，即獲得雜合肽CecA-Temporin-SHF蛋白，分子量2. IKD,具有明顯抑菌活性。本發(fā)明采用pPIC9K/Pichia pastoris GSl 15系統(tǒng)，構(gòu)建高效表達(dá)雜合抗菌肽CTS 基因工程菌株，大量獲得雜合抗菌肽CTS，為健康養(yǎng)殖、食品安全提供強(qiáng)有力的保障。


圖I是以重組質(zhì)粒pPIC9K-CTS為模板，用P1、P2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因片段，所得電泳圖譜；圖2是重組質(zhì)粒pPIC9K-CTS的酶切分析圖；圖3是重組菌株的PCR分析圖；圖4是表達(dá)蛋白SDS-PAGE電泳圖譜；圖5是抑菌試驗(yàn)對(duì)照?qǐng)D。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開一種雜合抗菌肽CTS的生產(chǎn)方法，其詳細(xì)過程如下。雜合抗菌肽CTS序列的優(yōu)化；外源基因的內(nèi)在特性如密碼子偏好性是影響外源蛋白的有效表達(dá)重要因素。根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性，將雜合抗菌肽CTS基因的酵母低頻密碼子優(yōu)化成高頻密碼子，以提高目的蛋白的翻譯速度和表達(dá)量。雜合抗菌肽CTS基因優(yōu)化情況如下GAATTCAAAAGAAAGTGGAAGTTGTTCAAGAAGATCTTCTTCTTCTTGTCTAGAATCTTCCAATGAGCGGCCGC通過軟件分析，在基因序列的5’端和3’端分別加上EcoR I、Not I兩個(gè)酶切位點(diǎn)。雜合抗菌肽CTS基因序列的合成合成雜合抗菌肽CTS基因序列由人工完成。合成的雜合抗菌肽CTS基因全序列為GAATTCAAAAGAAAGTGGAAGTTGTTCAAGAAGATCTTCTTCTTCTTGTCTAGAATCTTCCAATGAGCGGCCGC畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)引物根據(jù)新合成的序列設(shè)計(jì)上下游引物Pl，P2，新合成的引物序列如下Pl (5' AOXI) GACTGGTTCCAATTGACAAGC ；P2 GCGGCCGCTCATTGGAAGATTC雜合抗菌肽CTS基因的克隆首先以合成雜合抗菌肽CTS基因?yàn)槟０澹肞l，P2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系如下
權(quán)利要求
1.一種基因工程雜合抗菌肽CecA-Temporin-SHF生產(chǎn)方法，包括下列步驟， 51:雜合妝CecA-Temporin-SHF基因合成； 52:雜合肽CecA-Temporin-SHF重組酵母表達(dá)載體的構(gòu)建； 53pPIC9K-CTS表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化； 54:重組Pichia pastoris的誘導(dǎo)表達(dá)。
2.如權(quán)利要求I所述的一種基因工程雜合抗菌肽CecA-Temporin-SHF生產(chǎn)方法其中所述SI過程中包括根據(jù)GENBANK成熟肽段CecropinA以及Temporin-SHF的氨基酸序列，其序列號(hào)KWKLFKKIFFFLSRIF，選用酵母偏愛密碼子設(shè)計(jì)CecA-Temporin-SHF雜合肽基因，人工合成優(yōu)化的CecA-Temporin-SHF雜合抗菌肽基因,CecA-Temporin-SHF雜合肽基因5’和3’端分別引入Eco RI> Not I內(nèi)切酶位點(diǎn)；另合成一對(duì)引物Pl與P2，其中，Pl與P2的序列分別為P1 GACTGGTTCCAATTGACAAGC, P2 GCGGCCGCTCATTGGAAGATTC,該引物 Pl 與P2用于重組載體及重組酵母菌的鑒定，Pl位于畢赤酵母5’ AOX基因區(qū)，P2位于插入片段CecA-Temporin-SHF基因區(qū)，引物P1、P2的擴(kuò)增長(zhǎng)度分別為441bp。
3.如權(quán)利要求2所述的一種基因工程雜合抗菌肽CecA-Temporin-SHF生產(chǎn)方法其中所述S2過程中包括PCR產(chǎn)物和pPIC9K均用Eco RI.Not I雙酶切，T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α，重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行PCR、缺失酶切位點(diǎn)鑒定，PCR以及酶切鑒定為陽性的質(zhì)粒測(cè)序，構(gòu)建正確的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為PPIC9K-CTS。
4.如權(quán)利要求3所述的一種基因工程雜合抗菌肽CecA-Temporin-SHF生產(chǎn)方法其中所述S3過程中包括感受態(tài)Pichia pastorisGSl 15與SacI線性化pPIC9K_CTS相混合，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的O. 2cm電轉(zhuǎn)杯中，置冰上5min，I. 5kV、25uF、200 Ω電擊，立即加ImL預(yù)冷的lmol/L山梨醇，取200uL涂布于含G418 (5. Og/L)的YPD平板上篩選轉(zhuǎn)化子，30°C孵化4 5d至平板出現(xiàn)乳白色的酵母轉(zhuǎn)化菌落；采用PCR方法分析Pichia pastoris轉(zhuǎn)化子,用煮-凍-煮法制備 PCR 模板，以 P1，P2 為引物，PCR 反應(yīng)條件94°C 5min ；94°C 45s，61°C 45s, 72°C 45s，25個(gè)循環(huán)；72°C 5min。以能擴(kuò)增出441bp的克隆定為陽性轉(zhuǎn)化子。
5.如權(quán)利要求4所述的一種基因工程雜合抗菌肽CecA-Temporin-SHF生產(chǎn)方法其中所述S4過程中包括將篩選到的陽性酵母菌接種到5mL BMGY中，30°C、230r/min振蕩培養(yǎng)約22h至0D600達(dá)到3-6 ;室溫3000r/min離心2min，收集菌體重懸于25mL BMMY培養(yǎng)基，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；28°C、250r/min培養(yǎng)60h，期間每24h補(bǔ)加終濃度為1% (V/V)的甲醇；72h后5000r/min離心IOmin ;收集培養(yǎng)液上清，即獲得雜合肽CecA-Temporin-SHF蛋白，分子量2. IKD，具有明顯抑菌活性。
全文摘要
本發(fā)明公開一種基因工程雜合抗菌肽CecA-Temporin-SHF生產(chǎn)方法，包括下列步驟，S1雜合肽CecA-Temporin-SHF基因合成；S2雜合肽CecA-Temporin-SHF重組酵母表達(dá)載體的構(gòu)建；S3pPIC9K-CTS表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化；S4重組Pichia pastoris的誘導(dǎo)表達(dá)。本雜合抗菌肽CecA-Temporin-SHF的生產(chǎn)方法工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高。
文檔編號(hào)C12R1/84GK102952820SQ20111025213
公開日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2011年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月30日
發(fā)明者孫同毅, 張大偉, 王希輝 申請(qǐng)人:青島根源生物技術(shù)集團(tuán)有限公司