專利名稱：一種Gallinacin-6基因工程抗菌肽生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)制藥工業(yè)中基因工程生產(chǎn)蛋白藥物領(lǐng)域，尤其涉及一種利用基因工程重組法方法生產(chǎn)抗菌肽Gallinacin-6的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
目前養(yǎng)殖業(yè)中，由于抗生素泛濫使用，破壞動物腸道微生物菌群平衡，致使?jié)摲隗w內(nèi)的有害菌群大量繁殖會引起內(nèi)源感染，并且還導(dǎo)致耐藥微生物產(chǎn)生，致使藥物劑量加大、治療周期延長、死亡率增高等問題，而且細(xì)菌的耐藥性還會向人類的轉(zhuǎn)移，給人類的健 康造成巨大影響。特別在肉雞養(yǎng)殖中，由于抗生素破壞腸道菌群平衡，產(chǎn)氣莢膜梭菌過量繁殖，導(dǎo)致壞死性腸炎病情越發(fā)嚴(yán)重。產(chǎn)氣莢膜梭菌還是引起人類的食物中毒的主要病原菌之一，目前禽肉加工過程中檢出率都較高，高達(dá)84%，造成巨大的食品安全問題。抗菌肽被認(rèn)為是新一代抗生素的理想替代者?？咕氖巧矬w內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類具有生物學(xué)活性的小分子多肽，存在于多種生物體中，是宿主免疫防御系統(tǒng)的一個重要組成部分，具有廣譜抗菌、無耐藥性及毒副作用等優(yōu)點(diǎn)。隨著研究的不斷深入，越來越顯示出了其在醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的獨(dú)特應(yīng)用價(jià)值。防御素(Defensin)是一類富含半胱氨酸的內(nèi)源性陽離子多肽，具有較強(qiáng)的殺菌功能，能有效地殺滅細(xì)菌、真菌、螺旋體和囊膜病毒，是機(jī)體抵御外界病原微生物入侵的最初防御屏障[4-6]?？咕腉allinacin-6,—種雞β-防御素,前體肽由67個氨基酸殘基組成，其cDNA全長為20 Ibp，其成熟肽由40個氨基酸構(gòu)成，分子量
4.3KD。Gallinacin-6具有抗革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、真菌的能力，能夠有效抑制空腸彎桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌等主要食物源性病原體，特別對產(chǎn)氣莢膜梭菌抑制效果尤為顯著(MIC = 8μ g/mL)，同時具有良好熱穩(wěn)定性和耐酸堿能力，這些特點(diǎn)使得Gallinacin-6在動物疾病防治和飼料添加劑等方面顯露出很好的應(yīng)用前景。然目前從肉雞提取抗菌肽Gallinacin-6工藝復(fù)雜，獲取量少，同時還收提取材料限制，無法滿足市場需求，提高抗菌肽Gallinacin-6產(chǎn)量是一個急需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述狀況，有必要提供一種工藝簡單、產(chǎn)量高的抗菌肽Gallinacin-6的生產(chǎn)方法。一種Gallinacin-6基因工程抗菌肽生產(chǎn)方法,包括下列步驟，抗菌妝Gallinacin-6基因合成根據(jù)GENBANK，Gallinacin-6 的氨基酸序列(NCBI 序列號ΝΡ_001001193· I)，選用酵母偏愛密碼子設(shè)計(jì)Gallinacin-6基因，人工合成優(yōu)化的Gallinacin-6抗菌肽基因；Gallinacin-6基因5’和3’端分別引入Eco RI.Not I內(nèi)切酶位點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成一對引物F1，R1，用于重組載體及重組酵母菌的鑒定；抗菌肽Gallinacin-6重組酵母表達(dá)載體的構(gòu)建PCR產(chǎn)物和pPIC9K均用Eco RI、Not I雙酶切，T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α，重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行PCR、缺失酶切位點(diǎn)鑒定；PCR以及酶切鑒定為陽性的質(zhì)粒測序，構(gòu)建正確的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為PPIC9K-G6 ；pPIC9K-G6表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化感受態(tài)Pichia pastorisGS115與SacI線性化pPIC9K_G6相混合，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的O. 2cm電轉(zhuǎn)杯中，電擊，立即加ImL預(yù)冷的lmol/L山梨醇，涂布于MD和麗平板，30°C孵化4 5d至平板出現(xiàn)乳白色的酵母轉(zhuǎn)化菌落，篩選都能生長良好的Mut+的菌落，然后依次轉(zhuǎn)移含G418的不同濃度YH)平板上篩選轉(zhuǎn)化子，目的基因高拷貝的重組菌株；采用PCR方法分析Pichia pastoris轉(zhuǎn)化子，以Fl, Rl為引物，以能擴(kuò)增出149bp的克隆定為陽性轉(zhuǎn)化子；重組Pichia pastoris的誘導(dǎo)表達(dá)將篩選到的陽性酵母菌接種到5mL BMGY中，30°C、230r/min振蕩培養(yǎng)約22h至0D600達(dá)到3 6 ;室溫3000r/min離心2min，收集菌體重懸于25mL BMMY培養(yǎng)基，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；28°C、250r/min培養(yǎng)100h，期間每24h補(bǔ)加終濃度為1% (V/V)的甲醇；120h后5000r/min離心IOmin ;收集培養(yǎng)液上清，即獲得抗菌肽Gallinacin-6蛋白，分子量4. 3kD,
具有明顯抑菌活性。本發(fā)明抗菌肽Gallinacin-6是一種性能優(yōu)良抗菌肽，具有抗革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、真菌的能力，對產(chǎn)氣莢膜梭菌抑制效果尤為顯著，同時具有良好熱穩(wěn)定性和耐酸堿能力，這些特點(diǎn)使得Gallinacin-6在動物疾病防治和飼料添加劑等方面顯露出很好的應(yīng)用前景。通過采用pPIC9K/Pichia pastoris GS115系統(tǒng)，構(gòu)建高效表達(dá)抗菌肽Gallinacin-6基因工程菌株，大量獲得抗菌肽Gallinacin-6，可以減少抗生素使用，健康養(yǎng)殖、食品安全提供強(qiáng)有力的保障。


圖I是以重組質(zhì)粒pPIC9K-G6為模板，用F1、R1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因片段，所得電泳圖譜；圖2是重組質(zhì)粒pPIC9K-G6的酶切分析圖；圖3是重組菌株的PCR分析圖；圖4是表達(dá)蛋白SDS-PAGE電泳圖譜；圖5是抑菌試驗(yàn)對照圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開一種Gallinacin-6基因工程抗菌肽生產(chǎn)方法，其詳細(xì)過程如下。抗菌肽基因序列的優(yōu)化和獲得抗菌肽基因序列的優(yōu)化外源基因的內(nèi)在特性如密碼子偏好性是影響外源蛋白的有效表達(dá)重要因素。本發(fā)明根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性，將抗菌肽基因的酵母低頻密碼子優(yōu)化成高頻密碼子，以提高目的蛋白的翻譯速度和表達(dá)量?？咕幕騼?yōu)化情況如下GAATTCAAA AGAGACACAT TAGCCTGTAG ACAATCTCAT GGATCCTGTA GTTTTGTTGCATGCAGAGCT CCTTCTGTTG
ATATAGGAAC TTGTAGAGGT GGAAAATTGA AGTGCTGCAA ATGGGCTCCA TCAAGTCAATGAGCGGCCGC通過軟件分析，在基因序列的5’端和3’端分別加上EcoR I、Not I兩個酶切位點(diǎn)?？咕幕蛐蛄械暮铣煽咕幕蛐蛄杏扇斯ね瓿?。合成的抗菌肽基因全序列為GAATTCAAA AGAGACACAT TAGCCTGTAG ACAATCTCAT GGATCCTGTA GTTTTGTTGCATGCAGAGCT CCTTCTGTTGATATAGGAAC TTGTAGAGGT GGAAAATTGA AGTGCTGCAA ATGGGCTCCA TCAAGTCAAT·GAGCGGCCGC畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)引物根據(jù)新合成的序列設(shè)計(jì)上下游引物F1、R1，及合成通用引物A0X1，新合成的引物序列如下F1 GAATTCAAA AGAGACACAT ；R1 GCGGCCGCTCATTGACTT ；5 ' AOXl GACTGGTTCCAATTGACAAGC ；3/ AOX I :GCAAATGGCATTCTGACATCC。G6基因的克隆首先以合成G6基因?yàn)槟０?，用F1、R1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系如下
ddH209. 05 μ L
~10XPCR buffer I. 5μ LMg2+0. 9 μ L
dNTP0. 6μ L
~ ΙO. 375 μ L
O. 375 μ L Taq DNA 聚合酶 O. 2 μ L PUC18-T-G62. 0μ L
總體積15 μ L反應(yīng)條件PCR反應(yīng)條件94 °C 5min ；94°C 45s，50°C 45s, 72 °C 45s, 25 個循環(huán)；72 °C 5min。PCR產(chǎn)物跑0.8%瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶，然后用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收。
PCR產(chǎn)物的純化與回收將經(jīng)過初步鑒定后剩余的PCR產(chǎn)物全部跑O. 8%瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶，采用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，操作方法如下(I)用瓊脂糖凝膠電泳將目的DNA片段與其它DNA盡可能分開，然后用干凈的手術(shù)刀割下含所要回收DNA的瓊脂塊，放入I. 5mL離心管中。判定DNA片段的位置時，要盡可能使用長波長紫外光，在紫外光下照射的時間應(yīng)盡可能短。(2)每IOOmg瓊脂糖凝膠中或100 μ L的DNA溶液中加入400 μ LBinding Buffer,置于50-60°C水浴中l(wèi)Omin，每2min混勻一次，以保證凝膠全部融化。(3)將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移到套放于2mL收集管的UNIQ-IO柱中，室溫放置2min。8000rpm室溫離心lmin。適當(dāng)降低離心轉(zhuǎn)速有助于提高DNA結(jié)合率。(4)取下UNIQ-IO柱，倒掉收集管中廢液，將UNIQ-IO柱放回收集管中，加入500 μ LWash Solution, IOOOOrpm 室溫離心 30s。(5)重復(fù)步驟⑷一次。(6)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中廢液，將UNIQ-10柱放回收集管中，IOOOOrpm室溫尚;L·、15s οG6基因與pPIC9K載體連接將G6基因與pPIC9K載體連接，連接體系如下
權(quán)利要求
1.一種Gallinacin-6基因工程抗菌肽生產(chǎn)方法,包括下列步驟， 51:抗菌肽Gallinacin-6基因合成； 52:抗菌肽Gallinacin-6重組酵母表達(dá)載體的構(gòu)建，且構(gòu)建正確的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為 pPIC9K-G6 ； 53pPIC9K-G6表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化； 54:重組Pichia pastoris的誘導(dǎo)表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種Gallinacin-6基因工程抗菌肽生產(chǎn)方法，其中所述SI過程中包括根據(jù)GENBANK，Gallinacin-6的氨基酸序列，其NCBI序列號為NP_001001193. I，選用酵母偏愛密碼子設(shè)計(jì)Gallinacin_6基因，人工合成優(yōu)化的Gallinacin-6抗菌妝基因；Gallinacin_6基因5’和3’端分別引入Eco RI> Not I內(nèi)切酶位點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成一對引物Fl，R1，用于重組載體及重組酵母菌的鑒定。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種Gallinacin-6基因工程抗菌肽生產(chǎn)方法，其中所述S2過程中包括PCR產(chǎn)物和pPIC9K均用Eco RI、Not I雙酶切，T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α，重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行PCR、缺失酶切位點(diǎn)鑒定；PCR以及酶切鑒定為陽性的質(zhì)粒測序，構(gòu)建正確的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為PPIC9K-G6。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種Gallinacin-6基因工程抗菌肽生產(chǎn)方法，其中所述S3過程中包括感受態(tài)Pichia pastorisGSl 15與SacI線性化pPIC9K_G6相混合,轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的O. 2cm電轉(zhuǎn)杯中，電擊，立即加ImL預(yù)冷的lmol/L山梨醇，涂布于MD和麗平板，30°C孵化4 5d至平板出現(xiàn)乳白色的酵母轉(zhuǎn)化菌落，篩選都能生長良好的Mut+的菌落，然后依次轉(zhuǎn)移含G418的不同濃度YPD平板上篩選轉(zhuǎn)化子，目的基因高拷貝的重組菌株；采用PCR方法分析Pichia pastoris轉(zhuǎn)化子，以Fl，Rl為引物，以能擴(kuò)增出149bp的克隆定為陽性轉(zhuǎn)化子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種Gallinacin-6基因工程抗菌肽生產(chǎn)方法，其中所述S4過程中包括將篩選到的陽性酵母菌接種到5mL BMGY中，30°C、230r/min振蕩培養(yǎng)約22h至0D600達(dá)到3 6 ;室溫3000r/min離心2min，收集菌體重懸于25mL BMMY培養(yǎng)基，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；28°C、250r/min培養(yǎng)100h，期間每24h補(bǔ)加終濃度為1% (V/V)的甲醇；120h后5000r/min離心IOmin ;收集培養(yǎng)液上清，即獲得抗菌肽Gallinacin-6蛋白，分子量4. 3kD,具有明顯抑菌活性。
全文摘要
本發(fā)明公開一種Gallinacin-6基因工程抗菌肽生產(chǎn)方法，包括下列步驟，S1抗菌肽Gallinacin-6基因合成；S2抗菌肽Gallinacin-6重組酵母表達(dá)載體的構(gòu)建，且構(gòu)建正確的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pPIC9K-G6；S3pPIC9K-G6表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化；S4重組Pichia pastoris的誘導(dǎo)表達(dá)。本抗菌肽Gallinacin-6的生產(chǎn)方法工藝簡單、產(chǎn)量高。
文檔編號C12N15/12GK102952804SQ20111025213
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月30日
發(fā)明者孫同毅, 張大偉, 王希輝 申請人:青島根源生物技術(shù)集團(tuán)有限公司