專利名稱：革胡子鯰生長激素基因表達(dá)定量pcr分析中用于內(nèi)參基因擴(kuò)增的引物序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于機(jī)理研究的分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。特別涉及一種革胡子鯰(Clarias gariepinus)在養(yǎng)殖過程中與生長相關(guān)的重要內(nèi)分泌因子——革胡子鯰生長激素基因表達(dá)定量PCR分析中用于內(nèi)參基因擴(kuò)增的引物序列。
背景技術(shù)：
革胡子鯰具有耐低氧能力強(qiáng)、生長快、疾病少等特點，是一種發(fā)展前景良好的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，在國內(nèi)外養(yǎng)殖非常普遍。在食用價值上該魚具有蛋白質(zhì)含量高、營養(yǎng)豐富、肉味鮮美，刺少肉多的特點，并且具有滋補(bǔ)功效，對于手術(shù)傷口愈合有顯著的輔助治療作用。國內(nèi)外對革胡子鯰的研究主要集中在人工繁殖和苗種培育、養(yǎng)殖模式及其養(yǎng)殖技術(shù)的研究， 而對革胡子鯰的基礎(chǔ)生物學(xué)方面的研究報道極少，主要有對其性激素、組織對氨的積累、對水中某些化學(xué)物質(zhì)的組織病理學(xué)反應(yīng)以及對水中重金屬離子的積累等研究。而對革胡子鯰生長迅速、抗逆性強(qiáng)的機(jī)理的基礎(chǔ)研究未見報道。魚類的生長與其他脊椎動物相同，是一個復(fù)雜的生物代謝過程，受基因型、激素、 營養(yǎng)、環(huán)境等多方面的影響。對動物生長機(jī)理的研究其首選是從生長軸入手，生長軸是動物體內(nèi)從下丘腦——垂體——靴器官的一系列激素及其受體所組成的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)。其中，生長激素(GH)是調(diào)控脊椎動物生長的重要內(nèi)分泌因子，也是研究動物生長最重要的因子。GH除了對魚類的生長有很強(qiáng)的促進(jìn)作用外，同時對魚類的免疫系統(tǒng)、生殖生理及海水適應(yīng)性也有著重要的影響。此外還有研究顯示GH基因多態(tài)性與動物的生產(chǎn)性能有關(guān)。從魚類生長軸中的關(guān)鍵因子GH入手，通過GH基因表達(dá)的實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)分析，探討高密度養(yǎng)殖革胡子鯰快速生長的機(jī)理。對于基因表達(dá)的qPCR分析，既要有擬分析的目標(biāo)基因，又要有適宜的內(nèi)參基因。常用的內(nèi)參基因有beta-actirulSS rRNA和GAPDH基因。在qPCR中，引物序列對產(chǎn)物的特異性和有效擴(kuò)增來說至關(guān)重要。只有適宜的寡核苷酸序列，在qPCR中同時滿足下述3個條件第一，利用較高濃度cDNA (如反轉(zhuǎn)錄后稀釋5 10倍的cDNA)在進(jìn)行qPCR時Ct值應(yīng)小于18 20 ；第二，每個反應(yīng)的熔解曲線應(yīng)為1個峰；第三，通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的擴(kuò)增效率應(yīng)在90 105% (標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2 值應(yīng)大于0. 98，重復(fù)樣本Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)彡0. 5)。此時的寡核苷酸序列才能作為qPCR的引物。盡管qPCR技術(shù)已經(jīng)成熟，目前已成為不同樣本間進(jìn)行基因表達(dá)水平定量差異比較的權(quán)威性方法。在過去的10年間，該方法迅速流行，出版的文章超過2萬余篇，涉及醫(yī)學(xué)、 環(huán)境和農(nóng)業(yè)研究。但在應(yīng)用此技術(shù)的實驗過程中，需要研究人員自己設(shè)計并檢測引物是否可用于qPCR。目前沒有革胡子鯰相關(guān)目標(biāo)基因表達(dá)qPCR分析適宜的引物核苷酸序列，特別是用于內(nèi)參基因擴(kuò)增的弓I物核苷酸序列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種革胡子鯰生長激素基因表達(dá)定量PCR(qPCR)分析中用于內(nèi)參基因擴(kuò)增的引物核苷酸序列，提供有利于對革胡子鯰生長迅速的機(jī)理的基礎(chǔ)研究的工具。本發(fā)明設(shè)計并檢測了 2對目標(biāo)基因(GH)和4對內(nèi)參基因(beta-actin和18S rRNA 各2對)弓丨物序列，其中1對目標(biāo)基因和2對內(nèi)參基因的引物符合qPCR的要求。本發(fā)明的優(yōu)點在于內(nèi)參基因擴(kuò)增的引物應(yīng)用廣，不僅可以用于革胡子鯰的GH基因表達(dá)分析，理論上可用于該種魚類的任一基因的qPCR分析；此外，GenBank檢索認(rèn)為，申請的2對內(nèi)參基因的擴(kuò)增引物，還可用于其他一些鯰形目魚類的基因表達(dá)的qPCR分析。這一發(fā)明為革胡子鯰以及幾種鯰形目魚類的基礎(chǔ)研究奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明具體內(nèi)容一種革胡子鯰GH基因表達(dá)qPCR分析時用于內(nèi)參基因(18S rRNA)擴(kuò)增的2對引物的核苷酸序列，其特征見表1表1申請專利的引物核苷酸序列信息
引物對引物名稱引物序列5’—3’引物的堿基數(shù)bp第1對q-18SFlATTACCCATTCCCGACAC18q-18S RlACGCTCATTCCGATTACA18第2對q-18S F4 q-18SR4GCCGTCAAACTCGCCTGAATACCT AAATGCTTTCGCTTTCGTCCGTCT24 24表中的兩對引物不僅可作為革胡子鯰GH基因表達(dá)qPCR分析時內(nèi)參基因(18S rRNA)的擴(kuò)增引物，而且可作為革胡子鯰所有待檢目標(biāo)基因表達(dá)qPCR分析時，以18S rRNA 為內(nèi)參基因的擴(kuò)增引物。表中的兩對引物不僅可應(yīng)用于革胡子鯰的研究，還可應(yīng)用于其它一些鯰形目魚類的待檢目標(biāo)基因表達(dá)qPCR分析時以18S rRNA作為內(nèi)參基因的研究。革胡子鯰GH基因表達(dá)qPCR分析時用于內(nèi)參基因(18S rRNA)擴(kuò)增的2對引物核苷酸序列的制作方法一、總體RNA的提取應(yīng)用Trizol試劑提取單個垂體的總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測， 分析其完整性和純度。

圖1瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示RNA樣本的^S/18S rRNA的條帶亮度的比值在1 2之間，提示RNA樣本的完整性較好；而表2中RNA樣本的0D26_D28(1和OD26tl/ OD230的比值均在1. 8 2. 0之間，表明這兩個RNA樣本沒有蛋白和酚的污染，均可用于qPCR 實驗。表2總RNA的分光光度計檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1. 一種革胡子鯰生長激素基因表達(dá)定量PCR分析中用于內(nèi)參基因擴(kuò)增的引物序列，其特征是引物對引物名稱引物序列5’—3’引物的堿基數(shù)bp第1對q-18SFlATTACCCATTCCCGACAC18q-18S RlACGCTCATTCCGATTACA18第2對q-18S F4 q-18SR4GCCGTCAAACTCGCCTGAATACCT AAATGCTTTCGCTTTCGTCCGTCT24 24
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的革胡子鯰生長激素基因表達(dá)定量PCR分析中用于內(nèi)參基因擴(kuò)增的引物序列，這兩對引物不僅可作為革胡子鯰GH基因表達(dá)qPCR分析時內(nèi)參基因(18S rRNA)的擴(kuò)增引物，而且可作為革胡子鯰所有待檢目標(biāo)基因表達(dá)qPCR分析時，以18S rRNA 為內(nèi)參基因的擴(kuò)增引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的革胡子鯰生長激素基因表達(dá)定量PCR分析中用于內(nèi)參基因擴(kuò)增的引物序列，這兩對引物不僅可應(yīng)用于革胡子鯰的研究，還可應(yīng)用于其它一些鯰形目魚類的待檢目標(biāo)基因表達(dá)qPCR分析時以18S rRNA作為內(nèi)參基因的研究。
4.革胡子鯰GH基因表達(dá)qPCR分析時用于內(nèi)參基因(18SrRNA)擴(kuò)增的兩對引物核苷酸序列的制作方法一、總體RNA的提取應(yīng)用Trizol試劑提取單個垂體的總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測，分析其完整性和純度。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示RNA樣本的^S/18S rRNA的條帶亮度的比值在 1 2之間，提示RNA樣本的完整性較好；分光光度計檢測兩個RNA樣本的0D26_D28(1和OD26tl/ OD230的比值分別為1. 89和1. 99以及1. 96和2. 00，即兩個RNA樣本的OD26qaii28q和0D26(1/。D23。 的比值均在1. 8 2. O之間。表明這兩個RNA樣本沒有蛋白和酚的污染，均可用于qPCR實驗。二、RNA的反轉(zhuǎn)錄將上述1個RNA樣本反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一條鏈(RevertAid cDNA第一條鏈合成試劑盒)，用于所設(shè)計引物的評估。三、引物的設(shè)計與常規(guī)PCR評估1). GH、18S rRNA和beta-actin基因片段擴(kuò)增引物的設(shè)計本試驗中待檢目標(biāo)基因為GH，擬用18S rRNA或beta-actin作為內(nèi)參基因。GH基因擴(kuò)增引物根據(jù)本實驗室克隆的革胡子鯰GH全長cDNA(GenBank檢索號FJ823972)、18S rRNA和beta-actin基因的擴(kuò)增引物分別根據(jù)GenBank檢索的18S rRNA (GenBank檢索號 AJ876383)和 beta-actin(GenBank 檢索號腿76擬99)序列，應(yīng)用軟件 Primer 5. O 設(shè)計。 根據(jù)qPCR引物設(shè)計的基本原則，從設(shè)計的數(shù)十對引物中預(yù)選出GH、18S rRNA和beta-actin 擴(kuò)增的引物各2對，并由上海生工生物工程有限公司合成；其引物信息如下表。
全文摘要
一種革胡子鯰GH基因表達(dá)qPCR分析時用于內(nèi)參基因(18S rRNA)擴(kuò)增的2對引物的核苷酸序列，兩對引物不僅可作為革胡子鯰GH基因表達(dá)qPCR分析時內(nèi)參基因(18S rRNA)的擴(kuò)增引物，而且可作為革胡子鯰所有待檢目標(biāo)基因表達(dá)qPCR分析時，以18SrRNA為內(nèi)參基因的擴(kuò)增引物。兩對引物不僅可應(yīng)用于革胡子鯰的研究，還可應(yīng)用于其它一些鯰形目魚類的待檢目標(biāo)基因表達(dá)qPCR分析時以18S rRNA作為內(nèi)參基因的研究。
文檔編號C12Q1/68GK102321624SQ201110252308
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月30日
發(fā)明者何靜慧, 徐敏, 王曉梅, 王茜, 郭永軍 申請人:天津農(nóng)學(xué)院