專利名稱：一種從疾病動物模型外周血中快速提取循環(huán)的非血緣性有核細(xì)胞的組合物和試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及一種從疾病動物模型外周血中快速提取循環(huán)的非血緣性有核細(xì)胞的組合物及試劑盒，以及該組合物或試劑盒在用于新藥研發(fā)、尋找新的生物標(biāo)示物如腫瘤標(biāo)示物等基于疾病動物模型的生物醫(yī)學(xué)實驗、手動或借助于自動化檢測儀器設(shè)備的操作中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
提取并檢測外周血中的循環(huán)的非血緣性有核細(xì)胞(如血管內(nèi)皮細(xì)胞,腫瘤上皮細(xì)胞)的巨大臨床意義早已被人們所證實。目前常用的提取循環(huán)的非血緣性有核細(xì)胞的方法是利用抗體與這些細(xì)胞表面的特殊標(biāo)識物相結(jié)合從而達(dá)到直接捕獲的目的。然而這種直接 捕獲的技術(shù)手段敏感性低，重復(fù)性差，且因表面標(biāo)識物對于不同種類的細(xì)胞表達(dá)量差異極大，從而不能作為一種提取血液樣品中的非血緣性有核細(xì)胞的通用手段。近來大量的科研與臨床實驗已證明通過去除血中的血緣性有核細(xì)胞(如白細(xì)胞等)從而達(dá)到富集提取血中的非血緣性有核細(xì)胞是最為有效的手段。雖然此手段過程中涉及的某些單一方法已經(jīng)有所報道，如免疫磁性顆粒法去除白細(xì)胞，血型糖蛋白-A(glycophorinA)交聯(lián)法去除紅細(xì)胞，以及必須借助特殊細(xì)胞分離器械的免疫磁性顆粒與密度離心結(jié)合的初步嘗試等，但這些方法耗時長，白細(xì)胞去除率低，靶細(xì)胞回收率差，且須使用特殊器材從而帶來應(yīng)用的不便。由于上述原因，本發(fā)明將基于利用一種密度分離劑(即細(xì)胞分離介質(zhì))的組合物或試劑盒的離心方法與偶聯(lián)了抗動物白細(xì)胞抗體的免疫磁微粒相結(jié)合，在無融破裂解紅細(xì)胞實驗步驟的情況下取得了令人意料不到的實驗結(jié)果，證明利用此組合物或試劑盒結(jié)合上述方法能夠快速、高效、特異性地去除血液樣品中的絕大部分血緣性有核細(xì)胞、紅細(xì)胞及血漿蛋白質(zhì)，從而能夠快速富集并提取外周血中循環(huán)的非血緣性有核細(xì)胞，如循環(huán)的腫瘤上皮細(xì)胞，循環(huán)的血管內(nèi)皮細(xì)胞等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明將基于本發(fā)明的密度分離劑(即，細(xì)胞分離介質(zhì))的離心方法一方面提供了一種獨特高效地從外周血中分離循環(huán)的非血緣性有核細(xì)胞，如循環(huán)的腫瘤上皮細(xì)胞和循環(huán)的血管內(nèi)皮細(xì)胞等的組合物。另一方面，本發(fā)明還提供了一種獨特高效地從外周血中分離循環(huán)的非血緣性有核細(xì)胞，如循環(huán)的腫瘤上皮細(xì)胞和循環(huán)的血管內(nèi)皮細(xì)胞等的試劑盒。又一方面，本發(fā)明還提供了上述組合物或試劑盒在用于新藥研發(fā)，尋找新的生物標(biāo)示物如腫瘤標(biāo)示物等基于疾病動物模型的生物醫(yī)學(xué)實驗、手動或借助于自動化檢測儀器設(shè)備的操作中的應(yīng)用。一方面，本發(fā)明提供了一種用于從疾病動物模型的哺乳類動物血液中快速獲取循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞的組合物，由下述成份組成緩沖液，包被了抗血緣性有核細(xì)胞表面標(biāo)識物抗體的磁性或非磁性免疫微球或免疫顆粒，以及細(xì)胞分離介質(zhì)，其中，所述緩沖液的滲透壓介于260 320m0sm/kg Η20、ρΗ為6. 8 7. 8,所述細(xì)胞分離介質(zhì)在20°C下的比重為I. 072 I. 076克/毫升，所述細(xì)胞分離介質(zhì)包含選自下列試劑中的任意一種或任意兩種以上的成份聚乙烯吡咯烷酮包被的膠質(zhì)二氧化硅，多聚糖和泛影酸鈉或其衍生物，一種含糖的溶液，由蔗糖和表氯醇聚合而成的非離子聚合物。優(yōu)選地，所述免疫微球的比重高于所述細(xì)胞分離介質(zhì)的比重，所述免疫微球或免疫顆粒共價或非共價結(jié)合有特異性地識別下述的白細(xì)胞表面標(biāo)示物的一種或多種的多克隆或單克隆抗體CD3、CD31、CD34、CD45、CD69、CD84、或 CD102。優(yōu)選地，所述循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞選自循環(huán)的具有上皮來源的任何實體瘤細(xì)胞、或不具有上皮來源的任何腫瘤細(xì)胞，循環(huán)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞，干細(xì)胞，以及免疫細(xì)胞。 優(yōu)選地，其中，所述緩沖液的滲透壓介于260 320m0sm/kgH20、pH為6. 85 I. 75，所述含糖溶液為選自以下的糖的溶液右旋糖苷、多聚糖和泛影酸鈉或其衍生物、或蔗糖等，所述細(xì)胞分離介質(zhì)在20°C下的比重為I. 0722 I. 0758克/毫升。疾病動物模型為腫瘤動物模型，所述腫瘤細(xì)胞來自動物自身生長，或因引入人或動物的所有上皮來源的實體瘤細(xì)胞，包括但不局限于胰腺癌、肺癌、宮頸癌、食管癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等；或不具有上皮來源的腫瘤細(xì)胞，如黑色素瘤；循環(huán)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞，血中胎兒細(xì)胞，干細(xì)胞，以及免疫細(xì)胞等。優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞選自所有上皮來源的實體瘤細(xì)胞，如肺癌、宮頸癌、食管癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等；或不具有上皮來源的腫瘤細(xì)胞，如黑色素瘤等；循環(huán)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞，血中胎兒細(xì)胞，干細(xì)胞，以及免疫細(xì)胞等。優(yōu)選地，本發(fā)明的用于從疾病動物模型的哺乳類動物血液中快速獲取循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞的組合物，不包括融破裂解紅細(xì)胞的組分，如紅細(xì)胞裂解劑等。另一方面，本發(fā)明提供了一種用于從血液中快速獲取循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞的試劑盒，包括一種組合物，所述組合物由下述成份組成緩沖液，包被了抗血緣性有核細(xì)胞表面標(biāo)識物抗體的磁性或非磁性免疫微球或免疫顆粒，以及細(xì)胞分離介質(zhì)；適用于保存外周血中循環(huán)稀有細(xì)胞的抗凝劑；適用于免疫熒光或免疫組織化學(xué)染色并保證細(xì)胞不會脫落的包被電荷的載玻片；其中，所述緩沖液的滲透壓介于260 320m0sm/kg Η20、ρΗ為6. 8 7. 8，所述細(xì)胞分離介質(zhì)在20°C下的比重為I. 072 I. 076克/毫升，所述細(xì)胞分離介質(zhì)包含選自下列試劑中的任意一種或任意兩種以上的成份聚乙烯吡咯烷酮包被的膠質(zhì)二氧化硅，多聚糖和泛影酸鈉或其衍生物，一種含糖的溶液，由蔗糖和表氯醇聚合而成的非離子聚合物；容納該組合物的容器；帶有適合保存循環(huán)稀有細(xì)胞的抗凝劑；適用于免疫熒光或免疫組織化學(xué)染色并保證細(xì)胞不會脫落的包被電荷的載玻片；以及所述試劑盒的使用說明書。優(yōu)選地，所述免疫微球或免疫顆粒的比重高于所述細(xì)胞分離介質(zhì)的比重，所述免疫微球或免疫顆粒共價或非共價結(jié)合有特異性地識別下述的哺乳類動物白細(xì)胞表面標(biāo)示物的一種或多種的抗體⑶3、⑶31、⑶34、⑶45、⑶69、⑶84、或⑶102。優(yōu)選地，其中，所述緩沖液的滲透壓介于260 320m0sm/kgH20、pH為6. 85 7. 75，
所述含糖溶液為選自以下的糖的溶液如右旋糖苷，多聚糖和泛影酸鈉或其衍生物，或蔗糖
坐寸ο
優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞選自所有上皮來源的實體瘤細(xì)胞，包括但不限于肺癌、宮頸癌、食管癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等；或不具有上皮來源的腫瘤細(xì)胞，如黑色素瘤等；循環(huán)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞，血中胎兒細(xì)胞，干細(xì)胞，以及免疫細(xì)胞等。所述疾病動物模型是在哺乳類動物包括但不限于小鼠，裸鼠，大鼠，豚鼠，兔，貓，狗，羊，豬，馬，驢，騾，駱駝，靈長類如猴子，猩猩等體內(nèi)建立的疾病模型。優(yōu)選地，疾病動物模型如腫瘤動物模型，心臟病動物模型，建于哺乳類動物(包括小鼠，裸鼠，大鼠，豚鼠，兔，貓，狗，羊，豬，馬，5戶，驟，駱騎，靈長類如猴，猩猩等)體內(nèi)。優(yōu)選地，本發(fā)明的用于從疾病動物模型的哺乳類動物血液中快速獲取循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞的試劑盒，其中的組合物不包括融破裂解紅細(xì)胞的組分，如紅細(xì)胞裂解劑等。又一方面，本發(fā)明還提供了上述組合物或試劑盒在用于各種疾病動物模型的生物醫(yī)學(xué)實驗中的用途，所述生物醫(yī)學(xué)實驗包括但不限于新藥開發(fā)，新的生物標(biāo)識物的發(fā)現(xiàn)。其中疾病動物模型包括所有與人類疾病相關(guān)的疾病模型，包括腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和糖尿病。相對于目前市場上通用的商品化離心介質(zhì)而言，本發(fā)明的新的組合物或試劑盒的使用僅針對哺乳類實驗動物，可極大地縮短離心時間，并將細(xì)胞回收率從原有的60±20%穩(wěn)定地提高到95%以上。該組合物與去除白細(xì)胞試劑手段相結(jié)合，在免除融破紅細(xì)胞實驗步驟的前提下，可以有效地快速富集提取外周血中循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞，如腫瘤上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞等，對腫瘤及心臟病的早期診斷研究，抗腫瘤新藥及治療心血管疾病新藥的研發(fā)等方面，都具有極大的現(xiàn)實意義。而且本發(fā)明提供的上述組合物或試劑盒用于生物醫(yī)學(xué)實驗，或手動或用于借助于自動化檢測儀器設(shè)備的操作中可極大地簡化操作并提聞效率。
具體實施例方式本發(fā)明將基于特殊密度的分離劑的離心方法與去除血緣性有核細(xì)胞的手段相結(jié)合，在一具體實施例中提供了一種獨特高效地從實驗動物外周血中分離循環(huán)的非血緣性有核細(xì)胞，如循環(huán)的腫瘤上皮細(xì)胞和循環(huán)的血管內(nèi)皮細(xì)胞等的組合物。在實施例中，本發(fā)明還提供了一種獨特高效地從外周血中分離循環(huán)的非血緣性有核細(xì)胞，如循環(huán)的腫瘤上皮細(xì)胞和循環(huán)的血管內(nèi)皮細(xì)胞等的試劑盒。在具體實施例中，本發(fā)明還提供了上述組合物或試劑盒在用于生物醫(yī)學(xué)實驗、或手動或用于借助于自動化檢測儀器設(shè)備的操作中的應(yīng)用。在具體實施例中，本發(fā)明提供了一種用于從疾病動物模型的哺乳類動物外周血液中快速獲取循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞的組合物，由下述成份組成緩沖液，包被了抗血緣性有核細(xì)胞表面標(biāo)識物抗體的磁性或非磁性免疫微球或免疫顆粒，以及細(xì)胞分離介質(zhì)，其中，所述緩沖液的滲透壓介于260 320m0sm/kg H2O, pH為6. 8 7. 8，所述細(xì)胞分離介質(zhì)在20°C下的比重為I. 072 I. 076，所述細(xì)胞分離介質(zhì)包含選自下列試劑中的任意一種或任意兩種以上的成份聚乙烯吡咯烷酮包被的膠質(zhì)二氧化硅，多聚糖和泛影酸鈉或其衍生物，一種含糖的溶液，由蔗糖和表氯醇聚合而成的非離子聚合物。由于本發(fā)明應(yīng)用于哺乳類動物的試驗，所以細(xì)胞分離介質(zhì)的比重的精確度控制在小數(shù)點后三位即可。在優(yōu)選實施例中，所述免疫微球或免疫顆粒的比重高于所述細(xì)胞分離介質(zhì)的比重，所述免疫微球或免疫顆粒共價或非共價結(jié)合有特異性地識別下述的白細(xì)胞表面標(biāo)示物的一種或多種的抗體CD3, CD31, CD34, CD45, CD69, CD84，或 CD102。在優(yōu)選實施例中，所述循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞選自循環(huán)的具有上皮來源的任何實體瘤細(xì)胞、或不具有上皮來源的任何腫瘤細(xì)胞，循環(huán)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞，血中胎兒細(xì)胞，干細(xì)胞，以及免疫細(xì)胞等?！ぴ趯嵤├?，所述緩沖液的滲透壓介于260 320m0sm/kgH20、pH為6. 85 7. 75，所述含糖溶液為選自以下糖的溶液如右旋糖苷、多聚糖和泛影酸鈉或其衍生物、或蔗糖等，所述細(xì)胞分離介質(zhì)在20°C下的比重為I. 0722 I. 0758克/毫升。在優(yōu)選實施例中，所述腫瘤細(xì)胞選自所有上皮來源的實體瘤細(xì)胞，如肺癌、宮頸癌、食管癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等；或不具有上皮來源的腫瘤細(xì)胞，如黑色素瘤
坐寸ο在優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的用于從疾病動物模型的哺乳類動物血液中快速獲取循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞的試劑盒，其中的組合物不包括融破裂解紅細(xì)胞的組分，如紅細(xì)胞裂解劑等。在優(yōu)選具體實施例中，本發(fā)明提供了一種用于從實驗動物外周血液中快速獲取循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞的試劑盒,包括一種組合物，所述組合物由下述成份組成緩沖液，包被了抗血緣性有核細(xì)胞表面標(biāo)識物抗體的磁性或非磁性免疫微球，以及細(xì)胞分離介質(zhì)；其中，所述緩沖液的滲透壓介于260 320m0sm/kgH20、pH為6. 8 7. 8，所述細(xì)胞分離介質(zhì)在20°C下的比重為I. 072 I. 076克/毫升，所述細(xì)胞分離介質(zhì)包含選自下列試劑中的任意一種或任意兩種以上的成份聚乙烯吡咯烷酮包被的膠質(zhì)二氧化硅，聚糖，泛影酸鈉或其衍生物，一種含糖的溶液，由蔗糖和表氯醇聚合而成的非離子聚合物；容納所述組合物的容器以及帶有適合保存循環(huán)稀有細(xì)胞的抗凝劑；適用于免疫熒光或免疫組織化學(xué)染色并保證細(xì)胞不會脫落的包被載玻片以及所述試劑盒的使用說明書。在優(yōu)選實施例中，所述免疫微球或免疫顆粒的比重高于所述細(xì)胞分離介質(zhì)的比重，所述免疫微球或免疫顆粒共價或非共價結(jié)合有特異性地識別下述的哺乳類動物的白細(xì)胞表面標(biāo)示物的一種或多種的抗體⑶3，⑶31，⑶34，⑶45，⑶69，⑶84，或⑶102。在優(yōu)選實施例中，所述緩沖液的滲透壓介于260 320m0sm/kgH20、pH為6. 85
7.75，所述含糖溶液為選自以下的糖的溶液如右旋糖苷、多聚糖和泛影酸鈉或其衍生物、或蔗糖等。在優(yōu)選實施例中，所述循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞選自循環(huán)的具有上皮來源的任何實體瘤細(xì)胞、或不具有上皮來源的任何實體瘤細(xì)胞，循環(huán)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞，干細(xì)胞，以及免疫細(xì)胞。
適用于本試劑盒富集的循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞包括但不限于循環(huán)腫瘤細(xì)胞及循環(huán)血管內(nèi)皮細(xì)胞，可源自動物自發(fā)生長，或因引入人或動物的異常致病細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)、致病基因或蛋白質(zhì)在相應(yīng)條件下而生長的腫瘤或其它疾病模型。在優(yōu)選實施例中，所述腫瘤細(xì)胞選自所有實驗動物自身生長或因弓I人動物或人的上皮來源的實體瘤細(xì)胞，如肺癌、宮頸癌、食管癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等；或不具有上皮來源的腫瘤細(xì)胞，如黑色素瘤等。在本發(fā)明的具體實施方式
中，去除血緣性有核細(xì)胞的試劑是將一種或多種識別哺乳類實驗動物白細(xì)胞表面標(biāo)識物的抗體與磁性或非磁性固體顆粒或固體表面共價偶聯(lián)而成為免疫顆粒。離心分離介質(zhì)的密度為I. 072 I. 076克/毫升，比重可用任何滲透壓介于260 320m0sm/kg H20、pH 6. 8 7. 8的緩沖液調(diào)制而成。此分離介質(zhì)可將非血緣性有核細(xì)胞從紅細(xì)胞及結(jié)合了血緣性有核細(xì)胞的免疫顆粒中進(jìn)行有效的分離。在優(yōu)選具體實施例中，本發(fā)明的用于從疾病動物模型的哺乳類動物血液中快速獲取循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞的試劑盒，其中的組合物不包括融破裂解紅細(xì)胞的組分，如紅細(xì)胞裂解劑等。在具體實施例中，本發(fā)明還提供了上述組合物或試劑盒在用于生物醫(yī)學(xué)實驗，或手動或用于借助于自動化檢測儀器設(shè)備的操作中的應(yīng)用。在腫瘤新藥研究過程中常見的腫瘤動物模型異種移植實驗，以腫瘤大小的變化來衡量已有的抗腫瘤藥或正在研發(fā)的抗腫瘤新藥藥效，其缺點是耗時長，不敏感。使用本發(fā)明試劑盒分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞可以從細(xì)胞水平進(jìn)行藥效判斷，更加準(zhǔn)確與敏感。使用該試劑盒從腫瘤動物模型分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞可用于有效判斷抗腫瘤藥或在研發(fā)的抗腫瘤新藥是否有效阻斷腫瘤血路轉(zhuǎn)移。循環(huán)腫瘤細(xì)胞降低或消失可被視為對腫瘤血路轉(zhuǎn)移的有效抑制。腫瘤動物模型中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞不僅可以作為判讀抗腫瘤藥物藥效的指標(biāo)，亦作為現(xiàn)有或正在研制的抗腫瘤新藥的靶標(biāo)。對循環(huán)腫瘤細(xì)胞的直接殺傷可有效阻斷腫瘤的轉(zhuǎn)移。通過對疾病動物模型如心臟病模型動物外周血中的循環(huán)稀有細(xì)胞包括但不限于循環(huán)血管內(nèi)皮細(xì)胞的檢測可用于心臟病早期診斷的研究及治療心臟病新藥的開發(fā)。名詞解釋血緣性有核細(xì)胞指白細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞、B細(xì)胞等);嗜中性粒細(xì)胞；嗜酸性粒細(xì)胞；嗜堿性粒細(xì)胞等。循環(huán)的非血緣性有核細(xì)胞主要指在血液中循環(huán)的具有上皮來源的或不具有上皮來源的腫瘤細(xì)胞和循環(huán)的血管內(nèi)皮細(xì)胞；腫瘤干細(xì)胞，干細(xì)胞，血中胎兒細(xì)胞，某些免疫細(xì)胞等稀有細(xì)胞。疾病動物模型在哺乳類動物體內(nèi)使用各種技術(shù)手段包括但不限于引入致病基因、腫瘤細(xì)胞、蛋白質(zhì)等在相應(yīng)實驗條件下建立與人或動物相關(guān)的疾病模型。本發(fā)明主要用于從血液樣品中快速去除血漿蛋白、紅細(xì)胞以及血緣性有核細(xì)胞，從而達(dá)到富集血液樣品中的非血緣性有核細(xì)胞的目的。在本發(fā)明的實施過程中，將血液采集于含抗凝劑的采血管中。采用本發(fā)明的組合物用于富集血液樣品中非血緣性有核細(xì)胞的主要步驟，包括去除血漿蛋白；
應(yīng)用抗血緣性有核細(xì)胞表面標(biāo)志的特殊單克隆抗體組合群包被的免疫微球或免疫顆粒(將抗體共價或非共價偶聯(lián)于固體表面)，其中特殊單克隆抗體組合群指的是抗下述任意一個或幾個⑶的抗體組合⑶3、⑶31、⑶34、⑶45、⑶69、⑶84、或⑶102 ；加入比重為I. 072 I. 076克/毫升的細(xì)胞分離介質(zhì)，進(jìn)行基于特殊密度的細(xì)胞分離介質(zhì)的離心，從而富集血中的非血緣性有核細(xì)胞。在本發(fā)明的組合物中，細(xì)胞分離介質(zhì)的比重為1.072 1.076克/毫升(gr/ml或gr/cm3)。細(xì)胞分離介質(zhì)包含下列任何一種或任意兩種以上的試劑成份聚乙烯吡咯燒酮包被的膠質(zhì)二氧化娃(polyvinylpyrrolidine coated colloidal silica);多聚糖(polysucrose)與泛影酸鈉(sodium diatrizoate)或其衍生物的混合物；由鹿糖和表氯醇 聚合而成的非離子聚合物；以及可選的任意蛋白溶液。細(xì)胞分離介質(zhì)的比重可用任何滲透壓介于260 320m0sm/kg H20、pH6. 8 7. 8的緩沖液調(diào)制而成。在優(yōu)選實施例中，所述緩沖液的滲透壓介于260 320m0sm/kgH20、pH為6. 85
7.75。在優(yōu)選實施例中，所述細(xì)胞分離介質(zhì)在20°C下的比重為I. 0722 I. 0758克/毫升。在優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的用于從疾病動物模型的哺乳類動物血液中快速獲取循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞的組合物不包括融破裂解紅細(xì)胞的組分，如紅細(xì)胞裂解劑等。在另一優(yōu)選實施例的異體移種(Xenograft)實驗中，將人的肝癌細(xì)胞注射于裸鼠(I百萬或以上細(xì)胞/裸鼠)。注射后第二周起，在使用小鼠體內(nèi)成像系統(tǒng)觀測到腫瘤轉(zhuǎn)移病灶形成前，已在不同動物體內(nèi)檢測到數(shù)目不等的循環(huán)腫瘤細(xì)胞。實驗證明循環(huán)腫瘤細(xì)胞的可檢查數(shù)目的出現(xiàn)遠(yuǎn)早于借助顯微成像系統(tǒng)觀測到的腫瘤，其數(shù)目多的裸鼠其腫瘤轉(zhuǎn)移病灶出現(xiàn)早于循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目低的動物。此現(xiàn)象亦在接種了乳腺癌的裸鼠中得到了證實。對這些腫瘤動物模型進(jìn)行現(xiàn)有的或正在進(jìn)行臨床驗證的抗腫瘤藥治療，證明循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目的變化遠(yuǎn)早于借助體內(nèi)成像系統(tǒng)觀察到的腫瘤大小的變化，且循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目的變化與腫瘤大小的變化呈正相關(guān)。實驗證明，一旦腫瘤動物模型中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目經(jīng)藥物治療后得到有效控制，腫瘤原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶及腫瘤的轉(zhuǎn)移都能夠得到有效的控制。其療效與藥效的敏感性及意義要遠(yuǎn)高于觀察腫瘤大小的變化。實施例I利用本發(fā)明組合物從疾病動物模型哺乳類實驗動物的外周血液樣品中快速獲取非血緣性循環(huán)有核細(xì)胞采集Iml動物的外周血于含抗凝劑的采血管中離心(lOOOXg，15分鐘)后，去掉
血漿蛋白。將沉積的細(xì)胞重懸于3毫升緩沖液中。向其中加入I毫升包被有抗動物白細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體的磁珠后室溫孵育60分鐘。將反應(yīng)液加到20毫升的細(xì)胞分離介質(zhì)上方(該細(xì)胞分離介質(zhì)在20°C下的比重為I. 0722 I. 0758克/毫升，該細(xì)胞分離介質(zhì)包含下列成份聚乙烯吡咯烷酮包被的膠質(zhì)二氧化硅；多聚糖和泛影酸鈉；含右旋糖苷的糖溶液；由蔗糖和表氯醇聚合而成的非離子聚合物)，然后離心lOOOXg，15分鐘。
取上清液，將上清液再離心1500 X g，10分鐘。棄去上清液，得到的沉積細(xì)胞即為富集的非血緣性有核細(xì)胞。離心后得到的沉積細(xì)胞重懸于磷酸鹽緩沖液后可做進(jìn)一步分析。具體地，在本發(fā)明的組合物中，免疫微球或免疫顆粒由特異性識別白細(xì)胞標(biāo)示物的抗體與微球表面進(jìn)行共價或非共價偶聯(lián)而形成，所述微球的表面可經(jīng)過或沒有經(jīng)過化學(xué)處理以適于與蛋白質(zhì)相偶聯(lián)，所述微球的直徑介于10納米 100微米，所述免疫微球或免疫顆粒包含或部分包含任何一種下列成份二氧化硅，右旋糖苷，瓊脂糖，或交聯(lián)葡聚糖。用于制備所述免疫微球的微球為磁性或非磁性的。在本發(fā)明的組合物中，用于制備免疫微球或免疫顆粒的抗體特異性地識別下述 但不局限于這些白細(xì)胞表面標(biāo)示物的一種或幾種⑶3，⑶31，⑶34，⑶45，⑶69，⑶84，或CD102 等。在本發(fā)明的組合物中，所述免疫微球或免疫顆粒是將任何經(jīng)過或沒有經(jīng)過化學(xué)處理的適宜結(jié)合蛋白的固體表面如二氧化硅顆粒與配體或特異的單克隆或多克隆抗體包括抗白細(xì)胞表面標(biāo)示物的抗體進(jìn)行共價或非共價偶聯(lián)而制備而成。在本發(fā)明的組合物中，所述獨特的細(xì)胞分離介質(zhì)在20°C溫度下比重范圍優(yōu)選介于
I.0722 I. 0758克/毫升(gr/ml or gr/cm3)，這一特定范圍內(nèi)的密度適于將幾乎所有有核細(xì)胞與紅細(xì)胞及免疫微球或免疫顆粒進(jìn)行分離。所述細(xì)胞分離介質(zhì)包含下列任何一種或任意兩種以上的試劑成份聚乙烯吡咯烷酮包被的膠質(zhì)二氧化硅；多聚糖；泛影酸鈉或其衍生物；由蔗糖和表氯醇構(gòu)成的非離子聚合物；或任何一種含糖的溶液，如右旋糖苷或蔗糖；碘化小分子化合物(如甲泛影酰胺(或甲泛葡胺,metrizamide));或任意蛋白溶液。所述細(xì)胞分離介質(zhì)的比重可用任何滲透壓介于285 315m0sm/kg H2O>pH 6. 8 7. 8的緩沖液在20°C溫度下調(diào)制在I. 0722 I. 0758克/毫升范圍內(nèi)。所述免疫微球或免疫顆粒的比重高于所述細(xì)胞分離介質(zhì)的比重?；谒黾?xì)胞分離介質(zhì)的離心在普通的商購的離心管內(nèi)進(jìn)行。本發(fā)明的目的還在于提供了一種用于從血液中快速獲取循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞的試劑盒，包括—種組合物，所述組合物由下述成份組成緩沖液，包被了抗血緣性有核細(xì)胞表面標(biāo)識物抗體的磁性或非磁性免疫微球或免疫顆粒，以及細(xì)胞分離介質(zhì)；其中，所述緩沖液的滲透壓介于260 320m0sm/kg H2O, pH為6. 8 7. 8，所述細(xì)胞分離介質(zhì)在20°C下的比重為I. 072 I. 076克/毫升，所述細(xì)胞分離介質(zhì)包含選自下列試劑中的任意一種或任意兩種以上的成份聚乙烯吡咯烷酮包被的膠質(zhì)二氧化硅，多聚糖，泛影酸鈉或其衍生物，一種含糖的溶液，由蔗糖和表氯醇聚合而成的非離子聚合物。該試劑盒還包括用于容納所述組合物的容器以及包括適合保存循環(huán)稀有細(xì)胞的抗凝劑；適用于免疫熒光或免疫組織化學(xué)染色并保證細(xì)胞不會脫落的包被載玻片在本發(fā)明的試劑盒中，緩沖液，包被了抗血緣性有核細(xì)胞表面標(biāo)識物抗體的磁性或非磁性免疫微球或免疫顆粒，以及細(xì)胞分離介質(zhì)被分開容納在不同的容器中。在本發(fā)明的試劑盒中，免疫微球或免疫顆粒由特異性識別白細(xì)胞標(biāo)示物的抗體與微球或顆粒的表面進(jìn)行共價或非共價偶聯(lián)而形成，所述微球或顆粒的表面可經(jīng)過或沒有經(jīng)過化學(xué)處理以適于與蛋白質(zhì)相偶聯(lián)，所述微球或顆粒的直徑介于10納米 100微米，所述微球或顆粒包含或部分包含任何一種下列成份二氧化硅，右旋糖苷，瓊脂糖，或交聯(lián)葡聚糖。用于制備所述免疫微球的微球為磁性或非磁性的。在本發(fā)明的試劑盒中，用于制備免疫微球或免疫顆粒的抗體特異性地識別下述但不局限于這些白細(xì)胞表面標(biāo)示物中的一種或多種⑶3，⑶31，⑶34，⑶45，⑶69，⑶84，或⑶102 等。在本發(fā)明的試劑盒中，免疫微球或免疫顆粒是將任何經(jīng)過或沒有經(jīng)過化學(xué)處理的適宜結(jié)合蛋白的固體表面如二氧化硅微球，或右旋糖苷、瓊脂糖、或交聯(lián)葡聚糖微球與配體或特異的單克隆或多克隆抗體包括抗白細(xì)胞表面標(biāo)示物的抗體進(jìn)行共價或非共價偶聯(lián)而制備而成。在本發(fā)明的試劑盒中，優(yōu)選該細(xì)胞分離介質(zhì)在20°C溫度下比重范圍優(yōu)選介于
I.0722 I. 0758克/毫升(gr/ml或gr/cm3)，這一特定范圍內(nèi)的密度適于將幾乎所有有·核細(xì)胞與紅細(xì)胞及免疫微球進(jìn)行分離。所述細(xì)胞分離介質(zhì)包含下列任何一種或任意兩種以上的試劑成份聚乙烯吡咯烷酮包被的膠質(zhì)二氧化硅；多聚糖加泛影酸鈉或其衍生物；由蔗糖和表氯醇構(gòu)成的非離子聚合物；或任何一種含糖的溶液，如右旋糖苷或蔗糖；碘化小分子化合物(如甲泛影酰胺(metrizamide));或任意蛋白溶液。所述細(xì)胞分離介質(zhì)的比重可用任何滲透壓介于260 320m0sm/kg H20、pH 6· 8 7· 8的緩沖液在20°C溫度下調(diào)制在I. 0722 I. 0758克/毫升范圍內(nèi)。所述免疫微球或免疫顆粒的比重高于所述細(xì)胞分離介質(zhì)的比重。細(xì)胞分離介質(zhì)的離心在普通商購的離心管內(nèi)進(jìn)行。實施例2利用本發(fā)明判斷抗腫瘤藥物的有效性向裸鼠皮下注射人肺轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞(IxlO6細(xì)胞/鼠)。3-4周后，可見皮下腫瘤形成。將部分此腫瘤移植到另一裸鼠肝臟。此后，每周使用體內(nèi)成像系統(tǒng)觀察轉(zhuǎn)移癌的生成。與此同時，每周尾靜脈取血一次，并利用本發(fā)明試劑盒檢測血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞。另外一種實驗方法為在裸鼠乳腺附近皮下注射人肺轉(zhuǎn)移乳腺腫瘤細(xì)胞(IxlO6/鼠)，從注射第二周開始，每周使用本發(fā)明試劑盒監(jiān)測鼠外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞，并使用體內(nèi)成像系統(tǒng)觀察腫瘤轉(zhuǎn)移灶的形成。實驗證明，使用成像系統(tǒng)需要在至少5-6周或更長時間以后才可觀測到肺轉(zhuǎn)移灶的形成，而循環(huán)腫瘤細(xì)胞在接種后第二周即可從血中檢測到。應(yīng)用目前常規(guī)使用的化療藥5-FU或某些正在研發(fā)的抗腫瘤藥對按上述方法制備的腫瘤動物模型進(jìn)行給藥，循環(huán)腫瘤細(xì)胞在給藥后第2-3天即開始下降，而依賴成像系統(tǒng)觀察到的腫瘤縮小則要等到4-5周以后才可觀察到。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明了，上述所有優(yōu)選實施例只是對本發(fā)明的具體說明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。根據(jù)需要可以對其進(jìn)行多種改進(jìn)，組合，亞組合以及變換，所有的改進(jìn)，組合，亞組合、變換以及等效替換都落入在所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于從疾病動物模型的哺乳類動物血液中快速獲取循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞的組合物，由下述成份組成緩沖液，包被了抗血緣性有核細(xì)胞表面標(biāo)識物抗體的磁性或非磁性免疫微球或免疫顆粒，以及細(xì)胞分離介質(zhì)，其中，所述緩沖液的滲透壓介于260 320m0sm/kg Η20、ρΗ為6. 8 7. 8，所述細(xì)胞分離介質(zhì)在20°C下的比重為I. 072 I. 076克/毫升，所述細(xì)胞分離介質(zhì)包含選自下列試劑中的任意一種或任意兩種以上的成份聚乙烯吡咯烷酮包被的膠質(zhì)二氧化硅，多聚糖和泛影酸鈉或其衍生物，一種含糖的溶液，由蔗糖和表氯醇聚合而成的非離子聚合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其中，所述免疫微球或免疫顆粒的比重高于所述細(xì)胞分離介質(zhì)的比重，所述免疫微球或免疫顆粒共價或非共價結(jié)合有特異性地識別下述哺乳類動物的白細(xì)胞表面標(biāo)示物的一種或多種的多克隆或單克隆抗體CD3、CD31、CD34、CD45、CD69、CD84、或 CD102。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的組合物，其中，所述循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞選自循環(huán)的具有上皮來源的任何實體瘤細(xì)胞、或不具有上皮來源的任何腫瘤細(xì)胞，循環(huán)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞，干細(xì)胞，以及免疫細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項所述的組合物，其中，所述緩沖液的滲透壓介于260 320m0sm/kg Η20、ρΗ為6. 85 7. 75，所述含糖溶液為選自以下的糖的溶液右旋糖苷，多聚糖和泛影酸鈉或其衍生物，或蔗糖，所述細(xì)胞分離介質(zhì)在20°C下的比重為I. 0722 I. 0758克/暈升°
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，疾病動物模型為腫瘤動物模型,所述腫瘤細(xì)胞來自動物自身生長，或因引入人或動物的所有上皮來源的實體瘤細(xì)胞，包括但不局限于胰腺癌、肺癌、宮頸癌、食管癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等；或不具有上皮來源的腫瘤細(xì)胞，如黑色素瘤；循環(huán)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞，血中胎兒細(xì)胞，干細(xì)胞，以及免疫細(xì)胞等。
6.一種用于從血液中快速獲取循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞的試劑盒，包括 一種組合物，所述組合物由下述成份組成緩沖液；包被了抗哺乳類動物血緣性有核細(xì)胞表面標(biāo)識物抗體的磁性或非磁性免疫微球或免疫顆粒；細(xì)胞分離介質(zhì)；其中，所述緩沖液的滲透壓介于260 320m0sm/kg H2O>pH為6. 8 7. 8,所述細(xì)胞分離介質(zhì)在20°C下的比重為I. 072 I. 076克/毫升，所述細(xì)胞分離介質(zhì)包含選自下列試劑中的任意一種或任意兩種以上的成份聚乙烯吡咯烷酮包被的膠質(zhì)二氧化硅，多聚糖和泛影酸鈉或其衍生物，一種含糖的溶液，由蔗糖和表氯醇聚合而成的非離子聚合物； 容納所述組合物的容器；適用于保存外周血中循環(huán)稀有細(xì)胞的抗凝劑；適用于免疫熒光或免疫組織化學(xué)染色并保證細(xì)胞不會脫落的包被電荷的載玻片；以及所述試劑盒的使用說明書。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中，所述免疫微球或免疫顆粒的比重高于所述細(xì)胞分離介質(zhì)的比重，所述免疫微球或免疫顆粒共價或非共價結(jié)合有特異性地識別下述的抗哺乳類動物白細(xì)胞表面標(biāo)示物的一種或多種的抗體⑶3、⑶31、⑶34、⑶45、⑶69、⑶84、或CD102。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的試劑盒，其中，所述循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞來自人或動物的所有上皮來源的實體瘤細(xì)胞，包括但不局限于胰腺癌、肺癌、宮頸癌、食管癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等；或不具有上皮來源的腫瘤細(xì)胞，如黑色素瘤；循環(huán)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞，血中胎兒細(xì)胞，干細(xì)胞，以及免疫細(xì)胞等。
9.根據(jù)權(quán)利要求I 5任一項所述的組合物或根據(jù)權(quán)利要求6 8任一項所述的試劑盒在用于各種疾病動物模型的生物醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用，所述生物醫(yī)學(xué)實驗包括但不限于新藥開發(fā)，新的生物標(biāo)識物的發(fā)現(xiàn)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中疾病動物模型包括所有與人類疾病相關(guān)的疾病模型，包括腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和糖尿病。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從疾病動物模型外周血中快速提取循環(huán)的非血緣性有核細(xì)胞的組合物和試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明用于從疾病動物模型(包括腫瘤動物模型，心血管疾病動物模型等)的哺乳類動物血液中快速獲取循環(huán)的非血緣性有核稀有細(xì)胞的組合物，由下述成份組成緩沖液，包被了抗血緣性有核細(xì)胞表面標(biāo)識物抗體的磁性或非磁性免疫微球，以及一定密度的細(xì)胞分離介質(zhì)。相對目前市場上通用的商品化離心介質(zhì)，本發(fā)明的新的組合物的使用可極大地縮短離心時間，并將細(xì)胞回收率從原有的60±20％穩(wěn)定地提高到95％以上。該方法不需裂解融破紅細(xì)胞，從而高效快速地從疾病動物模型中富集提取外周血中的非血緣性循環(huán)稀有細(xì)胞。
文檔編號C12N5/095GK102952781SQ20111025373
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月30日
發(fā)明者盧煥梅 申請人:盧煥梅