專利名稱：一種評價her2靶位治療藥物及手段的體外檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種評價HER2靶位治療藥物及手段的體外檢測方法。
背景技術(shù)：
乳腺癌具有高發(fā)病率和高致命性，是女性最常見的惡性腫瘤之一。世界范圍內(nèi)，每年約有超過1200萬的女性被確診患有乳腺癌，嚴(yán)重影響著女性的健康生活。目前治療乳腺癌仍主要依賴放療和化療，毒副作用較大，并且特異性差，易產(chǎn)生并發(fā)癥狀。隨著乳腺癌發(fā)病理論研究的不斷深入，研究人員發(fā)現(xiàn)乳腺癌其實(shí)是某些與細(xì)胞增殖相關(guān)的原癌基因發(fā)生突變所導(dǎo)致的一種復(fù)雜分子疾病。而人表皮生長因子受體2 (HEM)則是公認(rèn)的與乳腺癌發(fā)病密切相關(guān)的原癌基因之一。研究表明，約25% -30%乳腺癌患者的癌細(xì)胞存在HER2的過度表達(dá)，而它的過量表達(dá)能夠不斷與人表皮生長因子受體家族的其他成員如HER1，HER3形成異源二聚體，通過磷酸化作用激活各種下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑如MAPK，P13K/AKT/mT0R等，從而引起一系列的細(xì)胞反應(yīng)包括促血管生成，抗凋亡，促細(xì)胞生長等，使癌細(xì)胞一直處于失控的持續(xù)增殖狀態(tài)之中?；诖?，HER2是研究治療和診斷乳腺癌的一個最重要的靶分子，而圍繞該靶分子所開發(fā)出的包括單克隆抗體，激酶抑制劑，反義寡核苷酸等生物治療藥物及手段也因其高效，特異性強(qiáng)和毒副作用較小等特點(diǎn)迅速引起了研究人員的高度重視和大量投入。此外，HER2的高表達(dá)在宮頸癌細(xì)胞中同樣存在，因此該靶點(diǎn)也是研究治療和診斷宮頸癌的重要突破口之一。在生物治療藥物及手段的開發(fā)過程中，為了便于大量具有生物活性治療藥物及手段的篩選，研究人員需要通過一種快速，高效的檢測手段能夠準(zhǔn)確的評價候選治療藥物及手段的生物活性，效果及其穩(wěn)定性。這種方法必須滿足下列幾個條件首先該法最好是體外實(shí)驗(yàn)，基于細(xì)胞水平，如增殖抑制，ADCC，CDC等，或基于酶促反應(yīng)；其次，該方法的實(shí)驗(yàn)機(jī)理與藥物及手段在體內(nèi)的作用機(jī)理應(yīng)盡可能一致，通過體外實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛘鎸?shí)的反應(yīng)該治療藥物及手段在體內(nèi)作用的療效，包括在細(xì)胞系的選擇上也應(yīng)盡量與真實(shí)病患情況接近；第三，該法必須通過方法驗(yàn)證，滿足方法專屬性，準(zhǔn)確性，精密度以及耐用性等方面的要求，如針對同一樣品檢測的重復(fù)性，日間差，人員操作誤差等結(jié)果的RSD應(yīng)該滿足小于10%。在此基礎(chǔ)上，才能保證生物活性檢測結(jié)果的可靠，并用于指導(dǎo)治療藥物及手段篩選工作。最后，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，該方法越簡單，操作步驟越少越好，因?yàn)檫@樣的方法更加靈活，更有利于推廣，并且適用于高通量工作。以基于靶分子HER2進(jìn)行生物治療藥物及手段研發(fā)為例，關(guān)于該原癌基因的作用機(jī)制已經(jīng)逐漸闡明。乳腺癌細(xì)胞過量表達(dá)HER2，隨之通過一系列級聯(lián)反應(yīng)，并最終處于失控的持續(xù)增殖狀態(tài)中。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計作用機(jī)理一致性原則，研究人員通常利用該治療藥物及手段對高表達(dá)HER2細(xì)胞的體外增殖抑制作用來評價其生物活性及效果。常用的高表達(dá) HER2的細(xì)胞系主要是人乳腺腺癌細(xì)胞SK-BR-3和人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞BT-474。然而到目前為止，從文獻(xiàn)報道來看，該增殖抑制的細(xì)胞學(xué)活性方法并未得到公認(rèn)或標(biāo)準(zhǔn)化，例如細(xì)胞系的選擇，細(xì)胞鋪板密度，治療藥物及手段作用時間，顯色時間以及顯色方式等都各不相同。更重要的是，在已經(jīng)報道的增殖抑制活性方法中，也缺乏對檢測體系專屬性，準(zhǔn)確性，重復(fù)性等方面的相關(guān)評價，包括對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的評價方式也存在不同，難以保證檢測結(jié)果的穩(wěn)定性
與可靠性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對以上存在的問題與不足，提供一種在評價HER2 靶位治療藥物及手段過程中，對具有生物活性治療藥物及手段進(jìn)行篩選以及穩(wěn)定性評價的細(xì)胞增殖抑制生物活性檢測方法。該方法能夠滿足方法驗(yàn)證過程中對專屬性，準(zhǔn)確性，精密度包括重復(fù)性，日間差，人員操作誤差，以及耐用性等方面的要求，能夠?qū)Υ罅可锘钚灾委熕幬锛笆侄芜M(jìn)行快速，準(zhǔn)確，高通量的篩選，滿足治療藥物及手段在研發(fā)過程中的需求。。為此，本發(fā)明公開了一種評價HER2靶位治療藥物及手段的體外檢測方法，包括下列步驟a取對數(shù)生長期表達(dá)HER2的細(xì)胞經(jīng)酶消化后，用完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，計數(shù)并計算細(xì)胞密度及活率，調(diào)整至合適的活細(xì)胞密度為η X IO5個/ml，η = 1_3，將細(xì)胞懸液等體積加入細(xì)胞培養(yǎng)板孔中，同時設(shè)立空白對照孔，空白對照孔被加入等體積完全培養(yǎng)基，然后將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；b取對照品及待測樣品，用完全培養(yǎng)基進(jìn)行系列梯度稀釋，得到系列稀釋濃度的對照品及待測樣品；c取步驟a的細(xì)胞培養(yǎng)板，除去上清。d將系列稀釋濃度的對照品及待測樣品依次等體積加入步驟a所述細(xì)胞培養(yǎng)板不同孔中，空白對照孔則加入等體積完全培養(yǎng)基，然后將細(xì)胞培養(yǎng)板放置于37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72-74h;e采用檢測活細(xì)胞或死細(xì)胞量的檢測體系對細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行顯色反應(yīng)；f顯色反應(yīng)完成后，測定顯色反應(yīng)的結(jié)果，并根據(jù)測定結(jié)果計算待測樣品的細(xì)胞增殖抑制生物活性。本發(fā)明術(shù)語“對照品”是指已公知其對表達(dá)HER2的細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞增殖抑制作用活性的化合物或組合物。在一些實(shí)施例中，所述及HER2靶位治療藥物是單克隆抗體、激酶抑制劑、反義寡核苷酸、化合物、中藥提取物或中藥復(fù)方提取物中之一或它們的任何組合，其中優(yōu)選為單克隆抗體。在一些實(shí)施例中，所述對數(shù)生長期表達(dá)HER2的細(xì)胞是人乳腺腺癌細(xì)胞SK-BR-3或人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞BT-474，其中優(yōu)選人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞BT-474。BT-474細(xì)胞相對SK-BR-3 細(xì)胞而言，對針對HER2的單克隆抗體治療藥物及手段更加敏感，治療藥物及手段對其細(xì)胞增殖抑制作用更強(qiáng)，這有利于擴(kuò)大方法對不同活性治療藥物及手段的篩選范圍。在一些實(shí)施例中，所述完全培養(yǎng)基是含10% FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基；在一些實(shí)施例中，所述系列梯度稀釋是2倍系列梯度稀釋。在一些實(shí)施例中，在步驟e中，所述檢測活細(xì)胞或死細(xì)胞量的檢測體系包括四唑類化合物氧化還原檢測體系、ATP總量檢測體系或LDH釋放量檢測體系等。
在一些實(shí)施例中，所述四唑類化合物為肌1\肌5、00(-8，其中優(yōu)選為00(-8。相對于其他四唑類化合物如MTT，MTS而言，CCK-8所形成的還原顯色物質(zhì)可直接溶于水相，無需添加DMSO助溶，因此使用更加方便，檢測靈敏度也較高。在一些實(shí)施例中，所述細(xì)胞培養(yǎng)板為96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，以便于高通量地進(jìn)行藥物評價。本發(fā)明能夠快速，準(zhǔn)確，高效的對針對HER2靶位治療藥物及手段的細(xì)胞增殖抑制生物活性進(jìn)行檢測。該方法專屬性好，特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確性高，測定活性范圍達(dá)到50%-150% ； 精密度高，重復(fù)性，日間差以及人員操作誤差RSD均小于10%，并且雙復(fù)孔的CV%小于 10%，4參數(shù)擬合的擬合常數(shù)R2均大于0. 98。此外，本發(fā)明并不需要十分昂貴的儀器和繁瑣的操作，便于推廣以及高通量操作，完全能夠滿足其在進(jìn)行具有針對HER2靶位，抑制腫瘤細(xì)胞生長，具有生物活性治療藥物及手段的篩選及其穩(wěn)定性評價的需要。


圖IHerc印tin及參考品4參數(shù)擬合圖。圖2參考品及AvastiM參數(shù)擬合圖。圖3細(xì)胞鋪板后直接加藥條件下Here印tin及參考品4參數(shù)擬合圖。圖4加藥后細(xì)胞孵育24h條件下Here印tin及參考品4參數(shù)擬合圖。圖5加藥后細(xì)胞孵育4 條件下Here印tin及參考品4參數(shù)擬合圖。圖6加藥后細(xì)胞孵育條件下Here印tin及參考品4參數(shù)擬合圖。圖7MTT顯色條件下Here印tin及參考品4參數(shù)擬合圖。圖8AlamarBlue顯色條件下Here印tin及參考品4參數(shù)擬合圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。一、材料和試劑材料針對HER2靶位單克隆抗體藥物Here印tin (產(chǎn)于Roche，批號B340;3)，針對 HER2靶位單克隆抗體藥物參考品(嘉和生物藥業(yè)制備)，針對HER2靶位單克隆抗體藥物待測樣品(嘉和生物藥業(yè)制備)，不針對HER2靶位的單克隆抗體藥物Avastin (產(chǎn)于Roche， 批號:B9005B02)。試劑染色液CCK-8 (Dojindo, Cat. No. CK04-20)，RPMI1640 培養(yǎng)基粉末(GIBC0, Cat. No. 31800-022)，鏈霉素 / 青霉素雙抗(GIBC0, Cat. No. 15070-063)，胰蛋白酶(GIBC0， Cat. No. 25200-07)，F(xiàn)BS(GIBC0, Cat. No. 10099-141)，MTT 粉末(Sigma, Cat. No. M2128)， AlamarBlue(Invitrogen, Ca t. No. DALl100)。溶液配制RPMI1640培養(yǎng)基取1000ml燒杯，倒入RPMI 1640培養(yǎng)基粉末1袋，碳酸氫鈉2. 0g，加入約900ml超純水，避光磁力攪拌直至溶解，用稀鹽酸調(diào)pH值至7. 00士0. 05，將溶液倒入量筒，定容至1000ml，經(jīng)0. 22 μ m濾膜無菌過濾即得，分裝后4°C避光保存。RPMI1640完全培養(yǎng)基量取胎牛血清(FBQ 50ml，加RPMI 1640培養(yǎng)基445ml，再加入鏈霉素/青霉素雙抗5ml，即得，4°C避光保存。細(xì)胞株SK-BR_3細(xì)胞株(購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，目錄號TCHu49)，BT-474細(xì)胞株(購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，目錄號 TCHu143)二、檢測方法步驟1)細(xì)胞鋪板取對數(shù)生長期的BT-474細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后用RPMI1640完全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液。計數(shù)，并計算細(xì)胞密度及活率，調(diào)整活細(xì)胞密度至1. 0-3. 0 X IO5個/ ml，以100 μ 1/孔加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中?？瞻讓φ湛讋t以100 μ 1/孔加入RPMI1640完全培養(yǎng)基。完成后將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24- ，使細(xì)胞貼壁。2)參考品及待測樣品稀釋取對照品及待測樣品，根據(jù)標(biāo)示濃度，用RPMI1640完全培養(yǎng)基稀釋至合適濃度，在新的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中做2倍系列梯度稀釋，得到11個稀釋度。3)加樣取貼壁后的細(xì)胞培養(yǎng)板，除去上清。接著將稀釋好的系列稀釋濃度的對照品及待測樣品以100 μ 1/孔依次加入鋪好細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板中，空白對照孔則以 100 μ 1/孔加入完全培養(yǎng)基，2-3復(fù)孔。完成后將細(xì)胞培養(yǎng)板放置于37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72-74h。4)顯色采用CCK-8顯色體系分別對細(xì)胞培養(yǎng)板中對照品孔，待測樣品孔，空白對照孔中以1(^1/孔加入00(-8。完成后將細(xì)胞培養(yǎng)板放置于37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2-4h。5)讀數(shù)取出細(xì)胞培養(yǎng)板混勻，放入酶標(biāo)儀，以650nm為參比波長，在450nm下測
定對照品孔，待測樣品孔及空白對照孔的OD45ch65ci，記錄測定結(jié)果。6)結(jié)果分析扣除空白對照孔的OD值后，分別用對照品孔和待測樣品孔OD值與加藥濃度的量效關(guān)系進(jìn)行4參數(shù)擬合，確定對照品與待測樣品的EC5tl值，曲線擬合常數(shù)R2， 復(fù)孔CV%。按照下列公式計算待測樣品的細(xì)胞增殖抑制生物活性
權(quán)利要求
1.一種評價HER2靶位治療藥物及手段的體外檢測方法，包括下列步驟a取對數(shù)生長期表達(dá)HER2的細(xì)胞經(jīng)酶消化后，用完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，計數(shù)并計算細(xì)胞密度及活率，調(diào)整活細(xì)胞密度為nX IO5個/ml，將細(xì)胞懸液等體積加入細(xì)胞培養(yǎng)板孔中，同時設(shè)立空白對照孔，空白對照孔被加入等體積完全培養(yǎng)基，然后將細(xì)胞培養(yǎng)板置于 37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；b取對照品及待測樣品，用完全培養(yǎng)基進(jìn)行系列梯度稀釋，得到系列稀釋濃度的對照品及待測樣品；c取步驟a的細(xì)胞培養(yǎng)板，除去上清。d將系列稀釋濃度的對照品及待測樣品以等體積依次加入步驟a所述細(xì)胞培養(yǎng)板孔中，空白對照孔則加入等體積的完全培養(yǎng)基，然后將細(xì)胞培養(yǎng)板放置于37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72-74h;e采用檢測活細(xì)胞或死細(xì)胞量的檢測體系對細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行顯色反應(yīng)； f顯色反應(yīng)完成后，測定顯色反應(yīng)的結(jié)果，并根據(jù)測定結(jié)果計算待測樣品的細(xì)胞增殖抑制生物活性。
2.如權(quán)利要求1所述的體外檢測方法，其特征在于所述HER2靶位治療藥物是單克隆抗體、激酶抑制劑、反義寡核苷酸、化合物、中藥提取物或中藥復(fù)方提取物中之一或它們的任何組合。
3.如權(quán)利要求1所述的體外檢測方法，其特征在于所述η= 1-3。
4.如權(quán)利要求1所述的體外檢測方法，其特征在于所述對數(shù)生長期表達(dá)HER2的細(xì)胞是人乳腺腺癌細(xì)胞SK-BR-3或人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞ΒΤ-474。
5.如權(quán)利要求1所述的體外檢測方法，其特征在于所述對數(shù)生長期表達(dá)HER2的細(xì)胞是人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞ΒΤ-474。
6.如權(quán)利要求1所述的體外檢測方法，其特征在于所述完全培養(yǎng)基是含10%FBS的 RPMI1640完全培養(yǎng)基。
7.如權(quán)利要求1所述的體外檢測方法，其特征在于所述系列梯度稀釋是2倍系列梯度稀釋。
8.如權(quán)利要求1所述的體外檢測方法，其特征在于在步驟e中，所述檢測活細(xì)胞或死細(xì)胞量的檢測體系包括四唑類化合物氧化還原檢測體系、ATP總量檢測體系或LDH釋放量檢測體系等。
9.如權(quán)利要求1所述的體外檢測方法，其特征在于所述四唑類化合物為MTT、MTS或 CCK-8。
10.如權(quán)利要求1所述的體外檢測方法，其特征在于所述細(xì)胞培養(yǎng)板為96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種評價HER2靶位治療藥物及手段的體外檢測方法。本發(fā)明公開了一種評價HER2靶位治療藥物及手段的體外檢測方法，其能夠快速、準(zhǔn)確、高效的對針對HER2靶位治療藥物及手段的細(xì)胞增殖抑制生物活性進(jìn)行檢測，該方法專屬性好、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高，活性測定范圍達(dá)到50％-150％；精密度高，重復(fù)性，日間差以及人員操作誤差RSD均小于10％，并且雙復(fù)孔的CV％小于10％，4參數(shù)擬合的擬合常數(shù)R2均大于0.98。此外，本發(fā)明并不需要十分昂貴的儀器和繁瑣的操作，便于推廣以及高通量操作，完全能夠滿足其在進(jìn)行具有針對HER2靶位、抑制腫瘤細(xì)胞生長活性的治療藥物及手段的篩選及其穩(wěn)定性評價的需要。
文檔編號C12Q1/06GK102352404SQ201110254630
公開日2012年2月15日 申請日期2011年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月31日
發(fā)明者劉培培, 呂品, 王少雄, 裘莉娟 申請人:嘉和生物藥業(yè)有限公司