專利名稱：細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)方法、基因芯片和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種檢測(cè)臨床常見(jiàn)細(xì)菌耐藥基因的方法。本發(fā)明還涉及用于該方法的試劑盒和基因芯片。
背景技術(shù)：
全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)的統(tǒng)計(jì)顯示，在耐藥細(xì)菌中，革蘭氏陰性菌占70%左右，其中以大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌為多，且多重耐藥情 況嚴(yán)重；革蘭氏陽(yáng)性菌占30%左右，其中，葡萄球菌屬占到2/3，而金黃色葡萄球菌幾乎占葡萄球菌屬的一半，腸球菌屬占革蘭氏陽(yáng)性菌的1/4左右，并以糞腸球菌和屎腸球菌為主。隨著感染性疾病的增多，第三代和第四代頭孢菌素、碳青霉烯類以及氟喹諾酮類等超廣譜抗菌藥物被廣泛使用，細(xì)菌的耐藥情況變得日益嚴(yán)重，造成感染性疾病難以控制、易復(fù)發(fā)、術(shù)后感染率高、昂貴抗菌藥物使用量增加等后果。耐藥菌株還隨著國(guó)際交流在全球范圍蔓延。傳統(tǒng)的病原學(xué)診斷及其耐藥性檢測(cè)主要依賴于形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)等方法，需要先從標(biāo)本中培養(yǎng)分離到病原菌，然后測(cè)定細(xì)菌的藥物敏感性，測(cè)定的方法主要包括定性測(cè)定的紙片擴(kuò)散法、K-B法，定量測(cè)定的稀釋法(如肉湯稀釋法，瓊脂稀釋法)，E試驗(yàn)法以及全自動(dòng)藥敏儀法，這些方法的成本相對(duì)較低，但測(cè)定過(guò)程復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)。目前，臨床上也有應(yīng)用全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)來(lái)做耐藥檢測(cè)，但同樣需要經(jīng)歷培養(yǎng)、分離提純、鑒定三個(gè)步驟，最順利的情況也需要72小時(shí)才能提供藥敏結(jié)果，且難以對(duì)自身生長(zhǎng)緩慢、生長(zhǎng)條件苛刻的細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)。此外，血清免疫學(xué)方法也可用于細(xì)菌的耐藥性檢測(cè)，但其假陽(yáng)性率和假陰性率高，重復(fù)性差，效能也不高。鑒于臨床治療的需要，醫(yī)生往往先根據(jù)流行病學(xué)資料、臨床癥狀、體征及影像學(xué)特征等，估計(jì)可能的病原體及藥敏情況，經(jīng)驗(yàn)性應(yīng)用覆蓋可能病原體的抗菌藥物或者相對(duì)廣譜的抗菌藥物，待培養(yǎng)結(jié)果出來(lái)后，再對(duì)抗菌藥物進(jìn)行調(diào)整，這嚴(yán)重限制了臨床醫(yī)師為患者及時(shí)有效地選擇敏感抗菌藥物，尤其不利于重癥感染性疾病的及時(shí)治療，而且很可能存在抗生素濫用的問(wèn)題，助長(zhǎng)了耐藥菌的產(chǎn)生。通過(guò)檢測(cè)細(xì)菌的耐藥基因，實(shí)現(xiàn)臨床上耐藥菌的快速準(zhǔn)確診斷，是目前臨床微生物學(xué)的重要研究和發(fā)展方向，它對(duì)控制醫(yī)院內(nèi)感染和搶救重癥感染病人具有重要的意義。β -內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生是細(xì)菌對(duì)β -內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要機(jī)制。β -內(nèi)酰胺酶可由染色體和質(zhì)粒介導(dǎo)，數(shù)量超過(guò)200種，其中，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)超過(guò)50種，遍布于世界各地。ESBLs的產(chǎn)生，是革蘭氏陰性腸桿菌的主要耐藥機(jī)制。在醫(yī)院感染中，ESBLs所涉及的菌種，幾乎涵蓋了所有主要的革蘭氏陰性桿菌。質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥(PMQR)基因，包括qnr(quinolone resistance)、qepA(quinolone efflux protein A)和 aac (6’)-Ib-cr 等。質(zhì)粒通過(guò)接合等方式，在細(xì)菌間傳遞耐藥基因，造成耐藥性的傳播?；騛ac (6’ )-Ib的304位T突變?yōu)镃或者A，或者535位G突變?yōu)門，導(dǎo)致102位色氨酸突變?yōu)榫彼幔?79位天冬氨酸突變?yōu)槔野彼?，引起?xì)菌對(duì)喹諾酮類抗菌藥物的耐藥性。
DNA回旋酶GyrA和拓?fù)洚悩?gòu)酶ParC的突變是導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)喹諾酮類耐藥的重要機(jī)制，GyrA基因常見(jiàn)突變位點(diǎn)有83位絲氨酸(S83)突變?yōu)榱涟彼?L83)、87位天冬氨酸(D87)突變?yōu)樘於０?N87)或者酪氨酸(Y87) ;ParC常見(jiàn)突變位點(diǎn)有80位絲氨酸(S80)突變?yōu)楫惲涟彼?180)、84位谷氨酸(E84)突變?yōu)橘嚢彼?K84)、甘氨酸(G84)或者纈氨酸(V84)。mecA基因是MRSA(耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)特有的耐藥基因，其編碼的PBP2a蛋白代替原來(lái)的青霉素結(jié)合蛋白PBP2，細(xì)菌細(xì)胞壁的合成不能被抑制，致使β -內(nèi)酰胺類藥物結(jié)合靶位缺失，從而形成耐藥。檢測(cè)mecA基因是被認(rèn)為國(guó)內(nèi)外判斷MRSA的金標(biāo)準(zhǔn)。氨基糖苷類修飾基因aac出’)-Ie-aph (2”)-Ia的存在，是耐高濃度慶大霉素腸球菌(HLGR)的主要原因。目前，臨床微生物耐藥基因的檢測(cè)，基本以表型檢測(cè)為主。由于耐藥機(jī)制的多樣性，某些耐藥基因可能沉默表達(dá)，但潛在的耐藥性是存在的，在合適的環(huán)境條件下，就會(huì)轉(zhuǎn)·變成耐藥細(xì)菌，或者將耐藥基因傳播給其他細(xì)菌。PCR雜交分析是檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因最常見(jiàn)的方法，然而，在眾多的耐藥基因中篩選某一種或者幾種耐藥基因，需要做大量的重復(fù)工作?；蛐酒夹g(shù)，具有敏感性高、特異性強(qiáng)、快速、高通量等特性，與PCR雜交分析法相比，基因芯片可并行檢測(cè)多種基因信息，實(shí)現(xiàn)大量重復(fù)工作的同步化，從而能提高檢測(cè)效率。針對(duì)細(xì)菌耐藥基因的檢測(cè)，國(guó)內(nèi)外研究者嘗試了不同檢測(cè)范圍的基因芯片。例如，Jan Weile等開(kāi)發(fā)了一種檢測(cè)銅綠假單胞菌抗生素耐藥性和毒力因子的基因芯片，整個(gè)過(guò)程在5個(gè)小時(shí)內(nèi)完成，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、靈敏度、特異度分別為78%、91%、89 %>83 % (ffeile J et al. DNA microarray for genotyping multidrug-resistantPseudomonas aeruginosa clinical isolates[J]. Diagn Microbiol Infect Dis,2007,59(3) :325-338)。Miranda Batchelor等開(kāi)發(fā)的革蘭氏陰性桿菌耐藥基因的微型芯片可以檢測(cè)編碼耐氨基糖苷類、甲氧芐啶、磺胺類、四環(huán)素和內(nèi)酰胺類以及超廣譜β _ 內(nèi)酸胺酶的 47 個(gè)耐藥基因(Batchelor M et al. Development of a miniaturisedmicroarray-based assay for the rapid identification of antimicrobial resistancegenes in Gram-negative bacteria[J].Int J Antimicrob Agents,2008,31 (5)440-451)。Naas等設(shè)計(jì)的芯片能檢測(cè)腸桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌中各型β-內(nèi)酰胺酶類耐藥基因，包括 TEM、SHV、CTX-M、KPC 等(Naas T et al. Evaluation of a DNAmicroarray,the check-points ESBL/KPC array,for rapid detection of TEM, SHV,andCTX-M extended-spectrum beta-lactamases and KPCcarbapenemases[J]. AntimicrobAgents Chemother. 2010, 54 (8) :3086-3092)。Marco Cassone 等設(shè)計(jì)制作了覆蓋 8 種細(xì)菌的65個(gè)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因的芯片(Cassone M et al. DNA microarray for detectionof macroIide resistance genes[J]. Antimicrob.Agents Chemother,2006,50 (6)2038-2041)。我國(guó)的基因芯片技術(shù)近年來(lái)也發(fā)展較快，例如，毛紅菊等設(shè)計(jì)了可以檢測(cè)超廣譜β內(nèi)酞胺酶類耐藥基因中的SHV、CTX-M的幾個(gè)亞型的基因芯片，該方法由標(biāo)本處理到細(xì)菌鑒定及耐藥譜檢測(cè)，全程僅需6-8小時(shí)(毛紅菊等.利用基因芯片快速檢測(cè)多種臨床常見(jiàn)致病菌及其耐藥性基因[J].中華傳染病雜志，2006，24￠) :372-377)。沈定霞等設(shè)計(jì)了檢測(cè)大腸桿菌、肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌產(chǎn)生ESBLs和AmpC酶基因的基因芯片，并對(duì)上述三種菌株共225株進(jìn)行檢測(cè)，除部分表型AmpC酶陽(yáng)性的大腸桿菌和肺炎克雷伯菌外，該芯片對(duì)所有表型ESBLs陽(yáng)性菌株均能檢出；同時(shí)對(duì)CTX-M基因進(jìn)行了分型(沈定霞等.基因芯片技術(shù)檢測(cè)大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌中ESBLs和AmpC酶基因[J].中國(guó)抗生素雜志，2007，32 (12) :727-731)。王雅杰等設(shè)計(jì)的基因芯片，可以對(duì)常見(jiàn)革蘭陽(yáng)性細(xì)菌同步進(jìn)行細(xì)菌鑒定和耐藥性檢測(cè)，靈敏度和特異度均較高(王雅杰等.常見(jiàn)革蘭陽(yáng)性細(xì)菌鑒定與耐藥檢測(cè)基因芯片的臨床應(yīng)用[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28 (2) :140-144)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是提供一種細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒，它可以用于多種臨床常見(jiàn)耐藥細(xì)菌產(chǎn)生的耐藥基因的同時(shí)檢測(cè)。
為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒，包括擴(kuò)增待測(cè)細(xì)菌耐藥基因的引物對(duì)和檢測(cè)所述細(xì)囷耐藥基因的探針；所述引物具有如SEQ ID No:l 32所不的序列或其互補(bǔ)鏈；所述探針具有如SEQ ID No :33 61所示的序列或其互補(bǔ)鏈。本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之二是提供一種細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)芯片。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的用于細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)的基因芯片，包括檢測(cè)待測(cè)細(xì)菌耐藥基因的探針，所述探針具有如SEQ ID No 33 61所示的序列或其互補(bǔ)鏈。所述細(xì)菌耐藥基因包括0XA-23、MP、VM、aac(6’)_Ie_aph(2”)_Ia、CTX_M、KPC、CIT、mecA、TEM、SHV, DHA, qnrB、qnrS、aac (6，) _Ib、ParC 和 GyrA。本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之三是提供一種利用上述細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒和基因芯片進(jìn)行細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)的方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)方法，包括以下步驟I)利用所述試劑盒中的引物，對(duì)待測(cè)樣本DNA中的耐藥基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；2)將步驟I)的產(chǎn)物與所述試劑盒中的檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因的探針進(jìn)行熒光標(biāo)記反應(yīng)；3)將步驟2)的產(chǎn)物與所述芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)，確定樣本所含的耐藥基因。本發(fā)明的細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)方法及檢測(cè)芯片和試劑盒，覆蓋了革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌所產(chǎn)生的最常見(jiàn)的16種耐藥基因的檢測(cè)，且檢測(cè)速度快，靈敏度和特異性高，從而有助于實(shí)現(xiàn)臨床細(xì)菌感染的快速診斷和及時(shí)有效地用藥，具有顯著的臨床實(shí)用價(jià)值。


附圖是用本發(fā)明的基因芯片對(duì)臨床血液樣本進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)得到的芯片掃描圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人,分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例I利用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行臨床常見(jiàn)耐藥細(xì)菌的耐藥基因檢測(cè)I.檢測(cè)目標(biāo)及引物和探針的設(shè)計(jì)本實(shí)施例的檢測(cè)目標(biāo)包括革蘭氏陽(yáng)性球菌中的金黃色葡萄球菌和腸球菌的耐藥基因，以及革蘭氏陰性桿菌中的肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥基因。所述耐藥基因沒(méi)有細(xì)菌種屬特異性差異，包括TEM、SHV、CTX-M、DHA、CIT、頂P、V頂、KPC> 0XA-23、qnrB、qnrS、mecA、aac (6，) -Ie-aph (2，，) -la、aac (6，) _Ib、GyrA 和 ParC,其中，aac(6，)-Ib基因設(shè)計(jì)3個(gè)突變位點(diǎn)，分別為T304C、T304A、G535T ；GyrA設(shè)計(jì)3個(gè)突變位點(diǎn)，分別為N87、Y87、L83 ；ParC設(shè)計(jì)4個(gè)突變位點(diǎn)，分別為180、K84、G84、V84。擴(kuò)增上述耐藥基因特異性片段的引物對(duì)，其正向引物和反向引物的序列長(zhǎng)度為·15 50個(gè)核苷酸,優(yōu)選為15 25個(gè)核苷酸。引物的詳細(xì)信息如表I所不表I本發(fā)明的細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒包括的引物
權(quán)利要求
1.一種細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括擴(kuò)增待測(cè)細(xì)菌耐藥基因的引物對(duì)和檢測(cè)所述細(xì)囷耐藥基因的探針；所述引物具有如SEQ ID No : I 32所不的序列或其互補(bǔ)鏈；所述探針具有如SEQ ID No 33 61所示的序列或其互補(bǔ)鏈。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述耐藥基因?yàn)镺XA-23、IMP、VIM、aac (6’ ) -Ie-aph (2”) -la、CTX-M、KPC, CIT、mecA、TEM、SHV, DHA, qnrB、qnrS、aac (6’ ) _Ib、ParC 和 GyrA。
3.一種用于細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)的基因芯片，其特征在于包括檢測(cè)待測(cè)細(xì)菌耐藥基因的探針，所述探針具有如SEQ ID No 33 61所示的序列或其互補(bǔ)鏈。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因芯片，其特征在于，還包括陽(yáng)性對(duì)照探針和陰性對(duì)照探針，所述陽(yáng)性對(duì)照探針具有如SEQ ID No :62所示的序列或其互補(bǔ)鏈，所述陰性對(duì)照探針具有如SEQ ID No :63所示的序列或其互補(bǔ)鏈。
5.利用權(quán)利要求I或2所述的細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒和權(quán)利要求3或4所述的用于細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)的基因芯片進(jìn)行細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)利用所述試劑盒中的引物，對(duì)待測(cè)樣本DNA中的耐藥基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 2)將步驟I)的產(chǎn)物與所述試劑盒中的檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因的探針進(jìn)行熒光標(biāo)記反應(yīng)； 3)將步驟2)的產(chǎn)物與所述基因芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)，確定樣本所含的耐藥基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR的反應(yīng)體系為=IOXPCR緩沖液I. O 2. O μ L，IOmM dNTP混合液O. I O. 4 μ L，引物混合物O. 8 I. 2 μ L，DNA聚合酶O.I O. 4 μ L,樣本DNA O. 8 2 μ L,加滅菌蒸懼水補(bǔ)充至15 μ L。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于所述PCR的反應(yīng)條件為95°C，5分鐘；95°C，30 #,68°C，30 秒，共 30 個(gè)循環(huán)；68°C，3 分鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述熒光標(biāo)記反應(yīng)的反應(yīng)體系為擴(kuò)增產(chǎn)物 2 5μ L，IOXBuffer I. 2 I. 8 μ L，5U/μ L Sequenase DNA 聚合酶 O. I O. 3 μ L，20 μ M 探針混合物 O. I O. 5 μ L，IOOmM Cy3-ddNTP O. I O. 5 μ L。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或8所述的方法，其特征在于，所述熒光標(biāo)記反應(yīng)的反應(yīng)條件為95。。，5 分鐘；95°C，30 秒，65°C，30 秒，72°C，20 秒，共 40 個(gè)循環(huán)；72°C，5 分鐘。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述雜交反應(yīng)的反應(yīng)體系為熒光標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物15 25 μ L，20 X SSPE 6 15 μ L，20nmol/L陽(yáng)性質(zhì)控O. I O. 4 μ L，混合均勻，用滅菌水補(bǔ)充至30 40 μ L ;反應(yīng)條件為在95°C下加熱5分鐘，冰上驟冷，然后與所述基因芯片在48°C下雜交反應(yīng)2小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)方法、基因芯片和試劑盒。該試劑盒包括擴(kuò)增待測(cè)細(xì)菌耐藥基因的引物對(duì)和檢測(cè)探針。該基因芯片包括檢測(cè)待測(cè)細(xì)菌耐藥基因的探針。利用該試劑盒和基因芯片進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)的方法，包括步驟1)利用試劑盒中的引物，PCR擴(kuò)增待測(cè)樣本DNA中的耐藥基因；2)擴(kuò)增產(chǎn)物與試劑盒中的檢測(cè)探針進(jìn)行熒光標(biāo)記反應(yīng)；3)熒光標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物與基因芯片進(jìn)行雜交，確定樣本所含耐藥基因。本發(fā)明的檢測(cè)方法覆蓋了臨床最常見(jiàn)的16種耐藥基因的檢測(cè)，有助于實(shí)現(xiàn)臨床細(xì)菌耐藥情況的快速診斷，從而可以為臨床合理選擇治療藥物提供支持。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102952875SQ201110254798
公開(kāi)日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2011年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月31日
發(fā)明者蔡挺, 張春秀, 張順, 陳金絲, 李巧云, 周佳菁, 肖華勝 申請(qǐng)人:寧波市第二醫(yī)院, 上海生物芯片有限公司, 上海伯豪生物技術(shù)有限公司