專利名稱：山羊絨和綿羊毛的實(shí)時(shí)熒光pcr鑒別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種山羊絨和綿羊毛的實(shí)時(shí)熒光PCR鑒別方法。
背景技術(shù)：
山羊絨即通常所說(shuō)的羊絨，是一種珍稀而昂貴的動(dòng)物纖維。其纖維細(xì)度均勻，手感滑糯柔軟而細(xì)膩，拉力強(qiáng)而富有彈性，素有“軟黃金”之稱。其羊絨制品具有極高的品質(zhì)和舒適的服用性能，受到人們的喜愛(ài)，價(jià)格也很高。生產(chǎn)者為了降低成本，將與山羊絨外觀相似的細(xì)支綿羊毛或經(jīng)處理改性的綿羊毛混入織物中，使市場(chǎng)上出現(xiàn)假冒或含量降低的山羊絨紡織品，大大損傷了消費(fèi)者的利益。因而有效鑒別山羊絨與綿羊毛就顯得非常重要。山羊絨與綿羊毛同屬蛋白質(zhì)纖維，化學(xué)性質(zhì)的差異不大，而僅在鱗片結(jié)構(gòu)及纖維細(xì)度上有些差異，目前鑒別方法主要有光學(xué)投影顯微鏡法、溶液法、染色法和掃描電子顯微鏡法等，但存在誤差較大、誤判率較高，試樣準(zhǔn)備繁瑣、操作復(fù)雜，帶有檢測(cè)者的主觀判斷， 結(jié)果欠客觀等缺點(diǎn)。山羊絨和綿羊毛的準(zhǔn)確、客觀鑒別是當(dāng)前檢驗(yàn)工作中迫切需要解決的重要技術(shù)難題之一。近年來(lái)，分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)飛速發(fā)展，在生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用。由于不同毛類纖維的遺傳物質(zhì)DNA存在差異，因此可利用基于DNA基礎(chǔ)上的分子生物學(xué)方法(如實(shí)時(shí)熒光PCR法)來(lái)鑒別區(qū)分山羊絨和綿羊毛，以達(dá)到靈敏、準(zhǔn)確、客觀的目的。據(jù)檢索，國(guó)外已有采用PCR-RFLP方法來(lái)鑒別不同動(dòng)物毛纖維的報(bào)道，但未見(jiàn)有應(yīng)用其他基于DNA基礎(chǔ)上的分子生物學(xué)方法(如實(shí)時(shí)熒光PCR法)的報(bào)道。我國(guó)雖然是進(jìn)口羊毛和出口羊絨大國(guó)， 但是在山羊絨和綿羊毛分子生物學(xué)鑒別方法的研究上還是空白。我們首次建立了山羊絨和綿羊毛的實(shí)時(shí)熒光PCR鑒別方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠靈敏、準(zhǔn)確地鑒別山羊絨和綿羊毛的實(shí)時(shí)熒光 PCR方法。本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下
本發(fā)明的一種山羊絨和綿羊毛的實(shí)時(shí)熒光PCR鑒別方法，所述方法包括提取樣品 DNA;針對(duì)山羊、綿羊的線粒體DNA序列設(shè)計(jì)引物和探針；通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR，對(duì)DNA中的山羊成分、綿羊成分分別進(jìn)行特異性擴(kuò)增；根據(jù)擴(kuò)增曲線和Ct值鑒別待測(cè)樣品中是否含有山羊絨、綿羊毛。用于鑒別山羊絨的引物、探針為12SG-F:5，-CGC CCT CCA AAT CAA TAA-3，、 12SG-R 5' -CTA TAG TGT ATC AGC TGC A_3，、12SG_P 5' -FAM-AAA CGT GTT AAA GCA CTA CAT C-TAMARA-3，;用于鑒別綿羊毛的引物、探針為12SS-F :5，-ATA TCA ACC ACA CGA GAG GAG AC-3M2SS-R :5，_TM ACT GGA GAG TGG GAG A_3，、12SS_P :5，-FAM_ACT AAT CCT CAT CCT CAT GC-TAMARA-3，。所述PCR 反應(yīng)體系為..2XPremix Ex Taq 12. 5 μ L，50XROX Reference Dye110. 5 yL, 10 μ mol/L 引物、探針各 0.75 μ L，DNA 模板 5 μ L, ddH20 4. 75 μ L ；鑒別山羊絨的PCR反應(yīng)條件為95 °C, 30 s ；95 °C，5 s，54 °C，35 s，40個(gè)循環(huán)；鑒別綿羊毛的PCR 反應(yīng)條件為95 °C, 30 s ；95 °C, 5 s，52 °C，35 s，40 個(gè)循環(huán)。本發(fā)明建立的山羊絨、綿羊毛實(shí)時(shí)熒光PCR鑒別法特異性好、靈敏度高，能夠滿足輕紡日常檢測(cè)的要求。


圖1為優(yōu)化前的山羊、綿羊成分的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果；其中A.綿羊成分；B.山羊成分。圖2為實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化結(jié)果，其中A.綿羊成分；B.山羊成分。圖3為綿羊成分的靈敏度測(cè)定結(jié)果，其中A. DNA系列稀釋內(nèi)參基因；B. DNA系列稀釋綿羊成分；C.含量?jī)?nèi)參基因；D.含量綿羊成分。圖4為山羊成分的靈敏度測(cè)定結(jié)果，其中A. DNA系列稀釋內(nèi)參基因；B. DNA系列稀釋山羊成分；C.含量?jī)?nèi)參基因；D.含量山羊成分。圖5為供試材料中山羊絨、綿羊毛的實(shí)時(shí)熒光PCR鑒別結(jié)果；其中A.內(nèi)參基因； B.綿羊成分；C.山羊成分。
具體實(shí)施例方式1 試驗(yàn)材料
兔毛，自行收集。淺綠色毛衣料、深墨綠色毛衣料、灰色毛衣料、肉色毛衣料(標(biāo)牌顯示 70 %綿羊毛和30 %山羊絨)、墨綠色毛衣料(標(biāo)牌顯示70 %綿羊毛和30 %山羊絨)、灰色格子西裝布料、灰色男西服布料、藍(lán)色毛衣料(標(biāo)牌顯示純山羊絨)、黑白灰三色毛衣料(標(biāo)牌顯示73. 9%綿羊毛、11. 6%山羊絨和14. 5%駝絨)均由本單位輕紡實(shí)驗(yàn)室收集。紫色羊絨衫料、駝毛由參加“第八屆CU系列纖維細(xì)度儀應(yīng)用研討會(huì)暨目光統(tǒng)一交流會(huì)”代表饋贈(zèng)。紫羊絨、貉子毛由國(guó)家紡織科學(xué)研究院國(guó)家紡織制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心張艷研究員饋贈(zèng)。其中墨綠色毛衣料、藍(lán)色毛衣料、紫色羊絨衫料經(jīng)張艷老師用纖維細(xì)度儀鑒定，墨綠色毛衣料和藍(lán)色毛衣料同時(shí)含有綿羊毛和山羊絨，而紫色羊絨衫料的山羊絨含量很高(超過(guò)96%)，僅含少量綿羊毛。山羊絨取自內(nèi)蒙農(nóng)家同一頭山羊，綿羊毛取自山東農(nóng)家同一頭綿羊，洗凈、 晾干、去雜質(zhì)。2主要試劑
組織和毛發(fā)DNA提取試劑盒[與DNA IQ 系統(tǒng)結(jié)合使用]為!Iomega公司產(chǎn)品。辦 Ex Taq (Perfect Real Time) (2X )為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。3.主要儀器與設(shè)備
電子天平、渦旋儀、瞬時(shí)離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、微孔干浴器、1.5mL磁力架、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀(美國(guó)ABI公司的7500)。4. 引物、探針
1，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，用TE溶液(pH8. 0)稀釋至lOymol/ L，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 4表1實(shí)時(shí)焚光PCR所用的引物、探針
權(quán)利要求
1.一種山羊絨和綿羊毛的實(shí)時(shí)熒光PCR鑒別方法，其特征在于所述方法包括提取樣品DNA ；針對(duì)山羊、綿羊的線粒體DNA序列設(shè)計(jì)引物和探針；通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCRJiDNA中的山羊成分、綿羊成分分別進(jìn)行特異性擴(kuò)增；根據(jù)擴(kuò)增曲線和Ct值鑒別待測(cè)樣品中是否含有山羊絨、綿羊毛。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的山羊絨和綿羊毛的實(shí)時(shí)熒光PCR鑒別方法，其特征在于用于鑒別山羊絨的引物、探針為:12SG-F :5，-CGC CCT CCA AAT CAA TAA-3，、12SG-R :5，-CTA TAG TGT ATC AGC TGC A_3，、12SG_P :5，-FAM_MA CGT GTT AM GCA CTA CAT C-TAMARA-3'； 用于鑒別綿羊毛的引物、探針為12SS-F :5，-ATA TCA ACC ACA CGA GAG GAG AC-3，、 12SS-R :5’ -TAA ACT GGA GAG TGG GAG A_3，、12SS_P :5’ -FAM-ACT AAT CCT CAT CCT CAT GC-TAMARA-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的山羊絨和綿羊毛的實(shí)時(shí)熒光PCR鑒別方法，其特征在于所述 PCR 反應(yīng)體系為2X/￥e iz 位 Taq 12. 5 μ L, 50 X ROX Reference Dye II 0. 5 μ L, 10 μ mol/L引物、探針各0. 75 μ L，DNA模板5 μ L，ddH20 4. 75 μ L ；鑒別山羊絨的PCR反應(yīng)條件為95 °C, 30 s ；95 °C, 5 s，54 °C，35 s，40個(gè)循環(huán)；鑒別綿羊毛的PCR反應(yīng)條件為95 "C, 30 s ；95 "C, 5 s, 52 "C, 35 s，40 個(gè)循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種山羊絨和綿羊毛的實(shí)時(shí)熒光PCR鑒別方法。所述方法包括提取樣品DNA；針對(duì)山羊、綿羊的線粒體DNA序列設(shè)計(jì)引物和探針；通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR，對(duì)DNA中的山羊成分、綿羊成分分別進(jìn)行特異性擴(kuò)增；根據(jù)擴(kuò)增曲線和Ct值鑒別待測(cè)樣品中是否含有山羊絨、綿羊毛。本發(fā)明建立的山羊絨、綿羊毛實(shí)時(shí)熒光PCR鑒別法特異性好、靈敏度高，能夠滿足輕紡日常檢測(cè)的要求。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102304579SQ201110254979
公開(kāi)日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2011年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月31日
發(fā)明者彭娟, 林志武, 繆婷玉, 邵碧英, 陳文炳 申請(qǐng)人:福建出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心